專利名稱：從香根草中提取防治植物病原真菌活性物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及從香根草植物中提取具抑制植物病原真菌活 性物質(zhì)的方法及該提取物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
香根草(Vetiveria zizanioides)，又名巖蘭草，屬禾本科香根草屬多年生草本植 物，原產(chǎn)于印度等熱帶、亞熱帶國(guó)家，在我國(guó)廣東省吳川地區(qū)也有少量分布。香根草具有生 態(tài)適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快、繁殖力強(qiáng)、抗逆性強(qiáng)、抗蟲和抗病性強(qiáng)及能增強(qiáng)土壤肥力等特性， 被譽(yù)為“21世紀(jì)最有價(jià)值的生態(tài)工程技術(shù)”之一。由于香根草特殊的生物學(xué)特征和生態(tài)學(xué) 特性，我國(guó)學(xué)者已做了大量的相關(guān)研究，推動(dòng)了香根草在我國(guó)的水土保持、污染治理等方面 的應(yīng)用。同時(shí)，香根草還具有藥用保健和食用功能，香根油能減緩人體疲勞，保護(hù)皮膚，殺菌 消毒，還可用于其它保健藥物的開發(fā)；同時(shí)香根草的幼嫩葉還可以作為飼料開發(fā)利用。農(nóng)業(yè)上香根草還可用于玉米和水稻作物螟蟲的防治，2003年國(guó)際昆蟲生理生態(tài)中 心和英國(guó)洛桑研究中心的科研人員Van den Berg通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，香根草對(duì)鉆蛀性玉米螟蟲 Chilo partellus是一種誘殺性植物，其雌成蟲明顯偏好在該植物上產(chǎn)卵，使玉米上的產(chǎn)卵 量降低到18%，同時(shí)，在香根草上未發(fā)現(xiàn)有幼蟲存活。我國(guó)江西農(nóng)科院陳先茂等(2007)報(bào) 道水稻螟蟲在香根草上的卵塊數(shù)和著卵密度是水稻上的4. 7倍，且種植時(shí)間在3月底至4 月初最佳。2009年浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭許松等也報(bào)道了香根草對(duì)水稻二化螟和大螟均有很 強(qiáng)的誘殺作用。香根草作為誘殺植物用于螟蟲的生態(tài)防治具有很大的發(fā)展空間，它的推廣 種植將為我國(guó)和世界的經(jīng)濟(jì)發(fā)展做出更大的貢獻(xiàn)。從目前我國(guó)對(duì)香根草的研究與應(yīng)用現(xiàn)狀來(lái)看，香根草的研究多限于理論研究，而 缺少對(duì)香根草植物的開發(fā)利用，這也限制了香根草的推廣種植，不利于發(fā)揮其多方面的功 能優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明首次利用香根草植物地上部分的提取物并開發(fā)其在防治植物病原真菌方面 的應(yīng)用。目前常用于植物病原真菌的殺菌劑同其它化學(xué)農(nóng)藥一樣具有毒性較大，難降解，易 產(chǎn)生抗藥性的缺點(diǎn)，對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康存在著極大的威脅，因此利用香根草的植物體 開發(fā)綠色環(huán)保，低毒無(wú)害的植物源殺菌劑既能有效利用香根草植物資源，又可以推動(dòng)香根 草在生態(tài)系統(tǒng)中的應(yīng)用，在保持生態(tài)效益的同時(shí)獲得一定的經(jīng)濟(jì)效益，達(dá)到互利共贏。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是，針對(duì)目前對(duì)香根草抑制植物病原真菌活性物質(zhì)的提取方法與其用 途認(rèn)識(shí)不足的缺陷，提供一種從香根草植物中提取具抑制植物病原真菌活性物質(zhì)的方法; 本發(fā)明的另一目的是提出該提取物在防治植物真菌病害中的應(yīng)用。本發(fā)明目的通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)。從香根草中提取防治植物病原真菌活性物質(zhì)的方法，該方法按以下步驟進(jìn)行(1)原料預(yù)處理將香根草的莖葉陰干至含水量少于5%，再切斷成l-2cm長(zhǎng)后，備 用；
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(2)酒精粗提取物的制備在室溫下將預(yù)處理后的原料和工業(yè)酒精按重量 1 25-40比例浸泡提取2-4次，每次浸泡3-8天；過(guò)濾、合并提取液后在45-55 °C水浴中減 壓濃縮得膏狀酒精粗提取物；(3)石油醚萃取物的制備先將酒精粗提取物按重量體積Ikg 2-6L比例溶于 70%乙醇水溶液中；再加入等體積60-90沸程的石油醚攪動(dòng)、萃取三次，每次4h ；靜置分層 后，取石油醚層過(guò)濾后在35-48°C水浴中減壓濃縮得黑色膏狀物即為香根草石油醚萃取物； 余下的母液減壓濃縮除去70%乙醇后用水定容至原體積、備用；(4)乙酸乙酯萃取物的制備將石油醚萃取物母液用等體積的乙酸乙酯萃取三 次，每次4h;乙酸乙酯層過(guò)濾后在40-50°C水浴中減壓濃縮得深褐色無(wú)定型物即為香根草 乙酸乙酯萃取物。所述的香根草提取物是指從香根草植物莖葉中的提取物。香根草提取物在防治植物真菌病害中的應(yīng)用，所述的香根草石油醚萃取物和香根 草乙酸乙酯萃取物，對(duì)水稻紋枯病菌，香蕉炭疽病菌，葡萄炭疽菌，黃瓜立枯絲核菌，黃瓜枯 萎病菌及番茄早疫病菌具有抑菌活性；并能用于對(duì)水稻紋枯病，香蕉炭疽病，葡萄炭疽病， 黃瓜立枯絲核菌病，黃瓜枯萎病及番茄早疫病病害的防治。本發(fā)明的有益效果1、本發(fā)明將香根草植物作為優(yōu)良的植物源殺菌劑資源，提出了從該資源中提取對(duì) 植物病原真菌具抑制作用活性物質(zhì)的方法，并成功地提取出香根草石油醚萃取物和香根草 乙酸乙酯萃取物；2、經(jīng)抑菌實(shí)驗(yàn)明確，當(dāng)萃取物濃度在5. Omg/ml時(shí)，對(duì)6種植物病原真菌具有不同 程度的抑制作用(見(jiàn)實(shí)施例4、5)，表明這兩部分萃取物是香根草中的主要抑菌活性成分；3、經(jīng)防病實(shí)驗(yàn)明確，萃取物對(duì)水稻紋枯病與黃瓜枯萎病有較好的防治效果(見(jiàn)實(shí) 施例6、7)；4、通過(guò)抑菌和防病實(shí)驗(yàn)已明確，香根草石油醚萃取物和香根草乙酸乙酯萃取物這 兩種來(lái)源于香根草的中間產(chǎn)品，現(xiàn)有效果雖不及化學(xué)藥劑百菌清，但因其毒性低，不易于產(chǎn) 生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，具有潛在的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值，經(jīng)過(guò)添加增效劑、復(fù)配及劑型等的研究改進(jìn)， 有望進(jìn)一步開發(fā)成為一種新型的植物源殺菌劑。
具體實(shí)施例方式通過(guò)下面給出的實(shí)施例與試驗(yàn)例可以進(jìn)一步清楚地理解本發(fā)明，但下述內(nèi)容并不 是對(duì)本發(fā)明的限定。實(shí)施例1 (從香根草中提取防治植物病原真菌活性物質(zhì)的方法1)按以下步驟進(jìn)行(1)原料預(yù)處理將香根草的莖葉陰干至含水量少于5%，切斷成l-2cm長(zhǎng)后，得材 料4. 5kg，備用；(2)酒精粗提取物的制備在室溫下將預(yù)處理后的原料和95%工業(yè)酒精180kg按 重量1 40比例浸泡提取3次，每次浸泡5天；過(guò)濾、合并提取液后在48 °C水浴中用EYELA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮得膏狀酒精粗提取物530g ；(3)石油醚萃取物的制備先將酒精粗提取物按重量體積Ikg 2L比例溶于70%
4乙醇水溶液中；再加入等體積60-90沸程的石油醚攪動(dòng)、萃取3次，每次4h ；靜置分層后，取 石油醚層過(guò)濾后在48°C水浴中減壓濃縮得黑色膏狀物即為香根草石油醚萃取物產(chǎn)品40g ； 余下的母液減壓濃縮除去70%乙醇后用水定容至2L，備用；(4)乙酸乙酯萃取物的制備將石油醚萃取物母液用2L乙酸乙酯萃取3次，每次 4h ；乙酸乙酯層過(guò)濾后在50°C水浴中減壓濃縮得深褐色無(wú)定型物即為香根草乙酸乙酯萃 取物產(chǎn)品40g。實(shí)施例2 (從香根草中提取防治植物病原真菌活性物質(zhì)的方法2)本例中，步驟⑴原料預(yù)處理香根草原料為1. Okg ；步驟⑵酒精粗提取物的制 備將原料1.0kg和95%工業(yè)酒精25kg按重量1 25比例浸泡提取2次，每次浸泡8天； 在55°C水浴中減壓濃縮得酒精粗提取物120g ；步驟(3)石油醚萃取物的制備酒精粗提取 物120g與400ml 70%乙醇水溶液的重量體積比為Ikg 3. 3L ；再加入等體積石油醚萃取3 次，每次4h ；經(jīng)35°C水浴減壓濃縮后得香根草石油醚萃取物產(chǎn)品9. 5g ；母液減壓濃縮除乙 醇后用水定容至400ml ；步驟(4)乙酸乙酯萃取物的制備將母液用400ml乙酸乙酯萃取3 次，每次4h ；乙酸乙酯層過(guò)濾后在40°C水浴中減壓濃縮得香根草乙酸乙酯萃取物產(chǎn)品IOg ； 其余工藝、條件同于實(shí)施例1。實(shí)施例3 (從香根草中提取防治植物病原真菌活性物質(zhì)的方法1)本例中，步驟⑴原料預(yù)處理香根草原料為2. 5kg ；步驟⑵酒精粗提取物的制 備將原料2. 5kg和95%工業(yè)酒精90kg按重量1 36比例浸泡提取4次，每次浸泡3天； 在45°C水浴中減壓濃縮得酒精粗提取物250g ；步驟(3)石油醚萃取物的制備酒精粗提取 物250g與1.5L 70%乙醇水溶液的重量體積比為Ikg 6L ；再加入等體積石油醚萃取3次， 每次4h ；經(jīng)40°C水浴減壓濃縮后得香根草石油醚萃取物產(chǎn)品20g ；母液減壓濃縮除乙醇后 用水定容至1. 5L ；步驟(4)乙酸乙酯萃取物的制備將母液用1. 5L乙酸乙酯萃取3次，每 次4h ；乙酸乙酯層過(guò)濾后在45°C水浴中減壓濃縮得香根草乙酸乙酯萃取物產(chǎn)品18g ；其余 工藝、條件同于實(shí)施例1。實(shí)施例4 (石油醚和乙酸乙酯萃取物對(duì)供試植物病原真菌的抑菌作用測(cè)定)1.供試病原真菌水稻紋枯病菌，香蕉炭疽病菌，葡萄炭疽菌，黃瓜立枯絲核菌， 黃瓜枯萎病菌，番茄早疫病菌；2、石油醚和乙酸乙酯萃取物采用實(shí)施例1、2或3的提取物；3.試驗(yàn)方法采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定。具體方法參考文獻(xiàn)(吳振宇，王燕，艾啟俊。鹿蹄草 素對(duì)桃褐腐病菌的抑制作用及其抑菌機(jī)理[J]。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42 (8) =2784-2792) 0 方法簡(jiǎn)述為①將石油醚和乙酸乙酯萃取物(各1. 25g)用2ml乙醇溶解，備用；②IOOOml PDA (馬鈴薯葡萄糖瓊脂)培養(yǎng)基配制好后121°C滅菌30min，溫度降至80°C后取出加入Img 硫酸鏈霉素防止細(xì)菌污染培養(yǎng)基；③將各部分已溶解好的提取物加入到250ml培養(yǎng)基中， 充分搖勻后配制成5. Omg/ml的帶藥培養(yǎng)基，然后將該培養(yǎng)基用移液管移入到直徑5cm的 培養(yǎng)皿中，每皿8ml，以純PDA和與樣品相同體積的乙醇加入的250ml培養(yǎng)基平板作空白對(duì) 照，凝固后待用；④用直徑0. 5cm的打孔器在供試菌菌落外緣切下生長(zhǎng)一致的帶菌培養(yǎng)基 柱，即菌餅，將菌餅帶菌絲的一面接種到培養(yǎng)皿中央；⑤將各處理置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)。每個(gè)處理設(shè)三次重復(fù)。待對(duì)照組菌絲即將長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿時(shí)，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。用下式求出抑菌率抑菌率=(對(duì)照菌落直徑_菌餅直徑)“(處理菌落直徑_菌餅直徑)/ (對(duì)照菌落 直接-菌餅直徑)X100%利用spss數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行不同處理與對(duì)照間的差異顯著性檢驗(yàn)。3.試驗(yàn)結(jié)果抑制作用結(jié)果見(jiàn)表1。表1石油醚和乙酸乙酯萃取物對(duì)供試植物病原真菌的抑制作用
權(quán)利要求
從香根草中提取防治植物病原真菌活性物質(zhì)的方法，其特征在于該方法按以下步驟進(jìn)行(1)原料預(yù)處理將香根草的莖葉陰干至含水量少于5％，再切斷成1 2cm長(zhǎng)后，備用；(2)酒精粗提取物的制備在室溫下將預(yù)處理后的原料和工業(yè)酒精按重量1∶25 40比例浸泡提取2 4次，每次浸泡3 8天；過(guò)濾、合并提取液后在45 55℃水浴中減壓濃縮得膏狀酒精粗提取物；(3)石油醚萃取物的制備先將酒精粗提取物按重量體積1kg∶2 6L比例溶于70％乙醇水溶液中；再加入等體積60 90沸程的石油醚攪動(dòng)、萃取三次，每次4h；靜置分層后，取石油醚層過(guò)濾后在35 48℃水浴中減壓濃縮得黑色膏狀物即為香根草石油醚萃取物；余下的母液減壓濃縮除去70％乙醇后用水定容至原體積、備用；(4)乙酸乙酯萃取物的制備將石油醚萃取物母液用等體積的乙酸乙酯萃取三次，每次4h；乙酸乙酯層過(guò)濾后在40℃ 50℃水浴中減壓濃縮得深褐色無(wú)定型物即為香根草乙酸乙酯萃取物。
2.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述香根草提取物是指從香根草植物莖葉中 的提取物。
3.香根草提取物在防治植物真菌病害中的應(yīng)用，其特征在于按權(quán)利要求1提取的香根 草石油醚萃取物和香根草乙酸乙酯萃取物，對(duì)水稻紋枯病菌，香蕉炭疽病菌，葡萄炭疽菌， 黃瓜立枯絲核菌，黃瓜枯萎病菌及番茄早疫病菌具有抑菌活性；并能用于對(duì)水稻紋枯病，香 蕉炭疽病，葡萄炭疽病，黃瓜立枯絲核菌病，黃瓜枯萎病及番茄早疫病病害的防治。
全文摘要
本發(fā)明公開了從香根草中提取防治植物病原真菌活性物質(zhì)的方法，屬于農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。方法包括(1)原料預(yù)處理；(2)酒精粗提取物的制備；(3)石油醚萃取物的制備；(4)乙酸乙酯萃取物的制備等步驟。本發(fā)明將香根草植物作為植物源殺菌劑資源，提出了從中制備提取物的方法，并明確該提取物對(duì)6種植物病原真菌具有明顯的抑制作用和一定的防治效果。該提取物其毒性低，不易產(chǎn)生耐藥性及環(huán)境污染，有望進(jìn)一步開發(fā)成新的植物源殺菌劑。本發(fā)明可在農(nóng)藥開發(fā)技術(shù)領(lǐng)域中應(yīng)用。
文檔編號(hào)A01P3/00GK101933526SQ20101025647
公開日2011年1月5日 申請(qǐng)日期2010年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月17日
發(fā)明者呂仲賢, 徐紅星, 楊亞軍, 王艷麗, 邱海萍, 鄭許松, 高廣春 申請(qǐng)人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院