專利名稱：溫郁金1號(hào)的組織培養(yǎng)法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種溫郁金1號(hào)的組織培養(yǎng)法。
背景技術(shù)：
溫郁金具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗艾滋病等多種藥理活性，臨床上用于治療肺 癌、肝癌、乳腺癌、胸腹水等。其在浙南有一千多年的栽培歷史，主產(chǎn)地浙江瑞安，且多栽培， 少野生。但因多年種植、管理混亂，并隨著環(huán)境污染及土壤營(yíng)養(yǎng)貧瘠等日趨嚴(yán)重，導(dǎo)致溫郁 金藥材種質(zhì)退化、品質(zhì)下降，這嚴(yán)重影響了溫郁金藥材產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。溫郁金1號(hào)作為溫郁金的品種之一，可由樂(lè)清市源生中藥材種植有限公司提供。 目前現(xiàn)有的溫郁金1號(hào)的培育法為種莖繁殖，該方法具有如下缺陷年繁殖率僅為25倍左 右ο溫郁金脫毒組織培養(yǎng)技術(shù)研究(汪洪，2009，藥物生物技術(shù))公開了一種溫郁金的 培養(yǎng)方法，該方法具有如下不足之處不定芽的繁殖系數(shù)低，僅為2 4倍；增殖周期長(zhǎng)，約 為4周；而且在不定芽增殖過(guò)程中，根原基被誘導(dǎo)，發(fā)育成大量根系，不定芽和不定根的同 時(shí)生長(zhǎng)不僅嚴(yán)重影響了增殖效率，而且使不定芽的繼代分割不易操作，最終導(dǎo)致種苗質(zhì)量 下降，移栽成活率低，僅達(dá)85%。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種溫郁金1號(hào)的組織培養(yǎng)法，采用該方法能快 速獲得大量的溫郁金1號(hào)組培種苗。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種溫郁金1號(hào)的組織培養(yǎng)法，依次包括以 下步驟1)、將無(wú)病斑、無(wú)蟲癭且健壯飽滿的溫郁金1號(hào)塊根放入生化培養(yǎng)箱進(jìn)行催芽，直 至長(zhǎng)成0. 5 2. Ocm高的小芽；培養(yǎng)條件為26 28°C暗培養(yǎng)；2)、割取上述小芽進(jìn)行流水沖洗；3)、將上述流水沖洗后的小芽經(jīng)常規(guī)消毒后，剝?nèi)? 5毫米大小的莖尖作為外植 體接種到無(wú)菌苗培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)條件為16小時(shí)光照，光照強(qiáng)度30 40μπιΟ1 m_2. s—1，溫度為27 士 1°C ；8小時(shí)暗培養(yǎng)，溫度為21 士 1°C ；上述光照和暗培養(yǎng)交替進(jìn)行；4)、待上述莖尖長(zhǎng)至1. 0 2. Ocm高時(shí)進(jìn)行割取作為小苗I ；將上述小苗I接種到 不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)條件為16小時(shí)光照，光照強(qiáng)度30 40μπιΟ1 nTU， 溫度為27士 1°C ；8小時(shí)暗培養(yǎng)，溫度為21 士 1°C ；上述光照和暗培養(yǎng)交替進(jìn)行；5)、待從小苗I上誘導(dǎo)出的不定芽I長(zhǎng)到1.0 3. Ocm高時(shí)，割取不定芽I作為 小苗II ；將上述小苗II接種到增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)條件為16小時(shí)光照，光照強(qiáng)度 30 40 μ mol πΓ2. s—1，溫度為26 28°C ；8小時(shí)暗培養(yǎng)，溫度為20 22°C ；上述光照和暗 培養(yǎng)交替進(jìn)行；6)、待上述小苗II上長(zhǎng)出的不定芽II長(zhǎng)到3. 0 6. Ocm高時(shí)，割取不定芽II作為小苗III ；將此小苗III接種到生根培養(yǎng)基中；培養(yǎng)條件為16小時(shí)光照，光照強(qiáng)度40 50μπιΟ1 m_2. s—1，溫度為26 28°C ；8小時(shí)暗培養(yǎng)，溫度為20 22°C ；上述光照和暗培養(yǎng)交替進(jìn)行；7)待上述小苗III長(zhǎng)到高4 8cm且具有至少3條長(zhǎng)于2cm的根時(shí)，得可出瓶種植 的種苗。作為本發(fā)明的溫郁金1號(hào)的組織培養(yǎng)法的改進(jìn)將溫郁金1號(hào)的小芽放入紗袋中， 無(wú)菌水沖洗1 2小時(shí)。作為本發(fā)明的溫郁金1號(hào)的組織培養(yǎng)法的進(jìn)一步改進(jìn)步驟3)中的無(wú)菌苗培養(yǎng)基為1/2MS基本培養(yǎng)基+白砂糖20 30g/l+瓊脂4 9g/l, pH 為 5. 5 6. 0 ；步驟4)中的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+TDZ 0. 05 0. 5mg/l+白砂糖 20 30g/l+ 瓊脂 4 9g/l, pH 為 5. 5 6. 0。步驟5)中的增殖培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+TDZ 0. 05 0. 5mg/l+白砂糖20 30g/l+ 瓊脂 4 9g/l，pH 為 5. 5 6. 0。步驟6)中的生根培養(yǎng)基為=IAMS基本培養(yǎng)基+白砂糖15 20g/l+瓊脂4 10g/l, pH 為 5. 5 6. 0。在本發(fā)明中無(wú)菌苗培養(yǎng)基的制作方法具體如下以1/2MS基本培養(yǎng)基(即溶液中所有物質(zhì)的 含量為MS基本培養(yǎng)基的一半)為基礎(chǔ)，分別加入白砂糖、瓊脂均勻混合，利用lmol/L的KOH 或lmol/L的HCl調(diào)節(jié)pH為5. 5 6. 0 ；每IL的1/2MS基本培養(yǎng)基中加20 30g白砂糖、 4 9g瓊脂。不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的制作方法具體如下以MS基本培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別加入N-苯 基-N' -1,2, 3-噻二唑-5脲(TDZ)、白砂糖、瓊脂均勻混合，利用lmol/L的KOH或lmol/L 的HCl調(diào)節(jié)pH為5. 5 6. 0 ；每IL的MS基本培養(yǎng)基加入0. 05 0. 5mg的TDZ、20 30g 白砂糖、4 9g瓊脂。增殖培養(yǎng)基的制作方法具體如下以MS基本培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別加入N-苯 基-N' -1,2, 3-噻二唑-5脲(TDZ)、白砂糖、瓊脂均勻混合，利用lmol/L的KOH或lmol/L 的HCl調(diào)節(jié)pH為5. 5 6. 0 ；每IL的MS基本培養(yǎng)基加入0. 05 0. 5mg的TDZ、20 30g 白砂糖、4 9g瓊脂。生根培養(yǎng)基的制作方法具體如下以1/2MS基本培養(yǎng)基(即溶液中所有物質(zhì)的含 量為MS基本培養(yǎng)基的一半)為基礎(chǔ)，分別加入白砂糖、瓊脂均勻混合，利用lmol/L的KOH或 lmol/L的HCl調(diào)節(jié)pH為5. 5 6. 0 ；每IL 1/2MS基本培養(yǎng)基中加15 20g白砂糖、4 IOg瓊脂。本發(fā)明的溫郁金1號(hào)組織培養(yǎng)法，屬于一種離體快速繁殖的組織培養(yǎng)方法。依照 植物組織培養(yǎng)中細(xì)胞全能性的原理，可以在短時(shí)間內(nèi)生產(chǎn)大量遺傳背景相同、長(zhǎng)勢(shì)一致的 優(yōu)質(zhì)種苗(種子)，而且依靠實(shí)驗(yàn)室可以實(shí)現(xiàn)周年的長(zhǎng)期提供優(yōu)質(zhì)種苗。在本發(fā)明的方法 中，將健康飽滿的溫郁金1號(hào)塊根進(jìn)行催芽，并割取小芽進(jìn)行消毒；再通過(guò)合適的誘導(dǎo)培養(yǎng) 基進(jìn)行誘導(dǎo)不定芽以及增殖不定芽，可以獲得大量的無(wú)菌苗。采用本發(fā)明的方法，一般僅需 45 60天即可得到可出瓶種植的種苗；因此溫郁金1號(hào)組培苗一周年內(nèi)的繁殖系數(shù)理論 上為61(1倍以上。所以，本發(fā)明的溫郁金的組織培養(yǎng)法，是一種不受季節(jié)等因素影響，高效、快速提供優(yōu)質(zhì)溫郁金種苗的方法，可以加速良種推廣速度，提高田間品種種植產(chǎn)量。綜上所述，本發(fā)明建立的溫郁金1號(hào)組織培養(yǎng)體系將為良種(溫郁金1號(hào))工廠 化育苗提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。本發(fā)明所得的種苗可采用以下常規(guī)方法進(jìn)行種植待種苗高4 8cm且具有至少 3條長(zhǎng)于2cm的根時(shí)，進(jìn)行煉苗馴化，在室溫下(25°C左右)放置2 3d后開瓶，然后在自 然光下放置2 3d后取出小苗，用溫水(30°C左右)洗凈根部瓊脂，并晾干至根系發(fā)白，移 栽入營(yíng)養(yǎng)土中，(泥炭珍珠巖蛭石=4 3 3的重量比)，于人工氣候箱室培養(yǎng)，培養(yǎng) 條件溫度20 25°C，濕度85% 90%，光照強(qiáng)度15 25μπι01 πΓ2. s—1 ；3 5周后光照 強(qiáng)度30 40 μ mo 1 πΓ2. s—1 ；2個(gè)月后，存活率達(dá)到95%以上。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 一種溫郁金1號(hào)的組織培養(yǎng)法，依次進(jìn)行以下步驟1)、將無(wú)病斑、無(wú)蟲癭且健壯飽滿的溫郁金1號(hào)塊根放入生化培養(yǎng)箱進(jìn)行催芽，直 至長(zhǎng)成0. 5 2. Ocm高的小芽；培養(yǎng)條件為26 28°C暗培養(yǎng)。2)、割取上述小芽轉(zhuǎn)入紗袋，無(wú)菌水流水沖洗1 2小時(shí)。3)、將上述流水沖洗后的小芽經(jīng)常規(guī)消毒后(即0. w/v HgCl2處理6 10分 鐘后，無(wú)菌水沖洗5 8遍，然后用無(wú)菌濾紙吸干)，剝?nèi)?-5毫米大小的莖尖作為外植體接 種到無(wú)菌苗培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)條件為16小時(shí)光照，光照強(qiáng)度30 40μπιΟ1 nrU， 溫度為27士 1°C ；8小時(shí)暗培養(yǎng)，溫度為21 士 1°C ；上述光照和暗培養(yǎng)交替進(jìn)行；無(wú)菌苗培養(yǎng)基為1/2MS基本培養(yǎng)基+白砂糖25g/l+瓊脂7g/l，pH為5. 5 6.0。4)、待上述莖尖長(zhǎng)至1. 0 2. Ocm高時(shí)，割取成單株的小苗I ；將上述小苗I接種 到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)條件為16小時(shí)光照，光照強(qiáng)度30 40μπιΟ1 m_2. s—1，溫度為27 士 1°C ；8小時(shí)暗培養(yǎng)，溫度為21 士 1°C ；上述光照和暗培養(yǎng)交替進(jìn)行；不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+TDZ 0. 2mg/l+白砂糖25g/l+瓊脂7g/l，pH 為 5. 5 6. 0。5)、待從小苗I上誘導(dǎo)出的不定芽I長(zhǎng)到1.0 3. Ocm高時(shí)，割取成2 5株叢生 的小苗II ；將上述小苗II接種到增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)條件為16小時(shí)光照，光照強(qiáng) 度30 40 μ mol πΓ2. s—1，溫度為26 28°C ；8小時(shí)暗培養(yǎng)，溫度為20 22°C ；上述光照和 暗培養(yǎng)交替進(jìn)行；增殖培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+TDZ 0. 25mg/l+白砂糖25g/l+瓊脂6g/l，pH為 5. 5 6. O06)、待上述小苗II長(zhǎng)出的不定芽II長(zhǎng)到3. 0 6. Ocm時(shí)，割取得小苗III ；將此小苗 III接種到生根培養(yǎng)基中；培養(yǎng)條件為16小時(shí)光照，光照強(qiáng)度40 50μπιΟ1 nTU，溫度為 26 28°C ；8小時(shí)暗培養(yǎng)，溫度為20 22°C ；上述光照和暗培養(yǎng)交替進(jìn)行；生根培養(yǎng)基為:1/2MS基本培養(yǎng)基+白砂糖17g/l+瓊脂7g/l，pH為5. 5 6. 0。7)待上述小苗III長(zhǎng)到高4 8cm且具有至少3條長(zhǎng)于2cm的根時(shí)，得可出瓶種植 的種苗。依照上述方法，只需45 50天即可獲得試管苗；因此采用本發(fā)明的方法可以長(zhǎng)期 得到大量的試管苗。
實(shí)施例2、一種溫郁金1號(hào)的組織培養(yǎng)法，僅對(duì)培養(yǎng)基的配方進(jìn)行如下更改，其余 同實(shí)施例1 無(wú)菌苗培養(yǎng)基為1/2MS基本培養(yǎng)基+白砂糖20g/l+瓊脂9g/l，pH為5. 5 6.0。不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+TDZ 0. 05mg/l+白砂糖30g/l+瓊脂4g/l， pH 為 5. 5 6. 0。增殖培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+TDZ 0. 45mg/l+白砂糖30g/l+瓊脂4g/l，pH為 5. 5 6. O0生根培養(yǎng)基為:1/2MS基本培養(yǎng)基+白砂糖15g/l+瓊脂10g/l, pH為5. 5 6. 0。依照上述方法，只需45 50天即可獲得試管苗；因此采用本發(fā)明的方法可以長(zhǎng)期 得到大量的試管苗。實(shí)施例3、一種溫郁金1號(hào)的組織培養(yǎng)法，僅對(duì)培養(yǎng)基的配方進(jìn)行如下更改，其余 同實(shí)施例1 無(wú)菌苗培養(yǎng)基為1/2MS基本培養(yǎng)基+白砂糖30g/l+瓊脂4g/l，pH為5. 5 6.0。不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+TDZ 0. 5mg/l+白砂糖20g/l+瓊脂9g/l，pH 為 5. 5 6. 0。增殖培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+TDZ 0. 06mg/l+白砂糖20g/l+瓊脂9g/l，pH為 5. 5 6. O0生根培養(yǎng)基為:1/2MS基本培養(yǎng)基+白砂糖20g/l+瓊脂4g/l，pH為5. 5 6. 0。依照上述方法，只需45 50天即可獲得試管苗；因此采用本發(fā)明的方法可以長(zhǎng)期 得到大量的試管苗。綜上所述，本發(fā)明的溫郁金1號(hào)的組織培養(yǎng)法具有如下特點(diǎn)1、繁殖系數(shù)高(5-8 倍)，增值周期短(14-20天)；2、增值階段不誘導(dǎo)根原基發(fā)育，不定芽的增殖一致性好。3、 激素TDZ的成本降低50倍左右，且種苗質(zhì)量好，移栽成活率高達(dá)95%以上。對(duì)比例將溫郁金1號(hào)塊根改成按照現(xiàn)有的溫郁金脫毒組織培養(yǎng)技術(shù)研究(汪洪， 2009，藥物生物技術(shù))進(jìn)行培養(yǎng)，然后進(jìn)行相同的移栽種植，結(jié)果為不定芽的繁殖系數(shù)低， 僅為2-4倍，增值周期長(zhǎng)，約為4周；而且在不定芽增殖過(guò)程中，根原基被誘導(dǎo)，發(fā)育成大量 根系，不定芽和不定根的同時(shí)生長(zhǎng)不僅嚴(yán)重影響了增殖效率，而且使不定芽的繼代分割不 易操作，最終導(dǎo)致種苗質(zhì)量下降，移栽成活率低，僅達(dá)85%。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā) 明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容 直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
溫郁金1號(hào)的組織培養(yǎng)法，其特征是依次包括以下步驟1)、將無(wú)病斑、無(wú)蟲癭且健壯飽滿的溫郁金1號(hào)塊根放入生化培養(yǎng)箱進(jìn)行催芽，直至長(zhǎng)成0.5～2.0cm高的小芽；培養(yǎng)條件為26～28℃暗培養(yǎng)；2)、割取上述小芽進(jìn)行流水沖洗；3)、將上述流水沖洗后的小芽經(jīng)常規(guī)消毒后，剝?nèi)?～5毫米大小的莖尖作為外植體接種到無(wú)菌苗培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)條件為16小時(shí)光照，光照強(qiáng)度30～40μmol m 2.s 1，溫度為27±1℃；8小時(shí)暗培養(yǎng)，溫度為21±1℃；上述光照和暗培養(yǎng)交替進(jìn)行；4)、待上述莖尖長(zhǎng)至1.0～2.0cm高時(shí)進(jìn)行割取作為小苗Ⅰ；將上述小苗Ⅰ接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)條件為16小時(shí)光照，光照強(qiáng)度30～40μmol m 2.s 1，溫度為27±1℃；8小時(shí)暗培養(yǎng)，溫度為21±1℃；上述光照和暗培養(yǎng)交替進(jìn)行；5)、待從小苗Ⅰ上誘導(dǎo)出的不定芽Ⅰ長(zhǎng)到1.0～3.0cm高時(shí)，割取所述不定芽Ⅰ作為小苗Ⅱ；將上述小苗Ⅱ接種到增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)條件為16小時(shí)光照，光照強(qiáng)度30～40μmol m 2.s 1，溫度為26～28℃；8小時(shí)暗培養(yǎng)，溫度為20～22℃；上述光照和暗培養(yǎng)交替進(jìn)行；6)、待上述小苗Ⅱ上長(zhǎng)出的不定芽Ⅱ長(zhǎng)到3.0～6.0cm高時(shí)，割取所述不定芽Ⅱ作為小苗Ⅲ；將此小苗Ⅲ接種到生根培養(yǎng)基中；培養(yǎng)條件為16小時(shí)光照，光照強(qiáng)度40～50μmol m 2.s 1，溫度為26～28℃；8小時(shí)暗培養(yǎng)，溫度為20～22℃；上述光照和暗培養(yǎng)交替進(jìn)行；7)待上述小苗Ⅲ長(zhǎng)到高4～8cm且具有至少3條長(zhǎng)于2cm的根時(shí)，得可出瓶種植的種苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的溫郁金1號(hào)的組織培養(yǎng)法，其特征是所述步驟2)為將溫郁 金1號(hào)的小芽放入紗袋中，無(wú)菌水沖洗1 2小時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的溫郁金1號(hào)的組織培養(yǎng)法，其特征是步驟3)中的無(wú)菌苗培養(yǎng) 基為1/2MS基本培養(yǎng)基+白砂糖20 30g/l+瓊脂4 9g/l，pH為5. 5 6. 0。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的溫郁金1號(hào)的組織培養(yǎng)法，其特征是步驟4)中的不定芽誘 導(dǎo)培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+TDZ 0. 05 0. 5mg/l+白砂糖20 30g/l+瓊脂4 9g/l，pH 為 5. 5 6. 0。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的溫郁金1號(hào)的組織培養(yǎng)法，其特征是步驟5)中的增殖培養(yǎng)基 為MS基本培養(yǎng)基+TDZ 0. 05 0. 5mg/l+白砂糖20 30g/l+瓊脂4 9g/l，pH為5. 5 6. 0。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的溫郁金1號(hào)的組織培養(yǎng)法，其特征是步驟6)中的生根培養(yǎng) 基為1/2MS基本培養(yǎng)基+白砂糖15 20g/l+瓊脂4 10g/l，pH為5. 5 6. 0。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種溫郁金1號(hào)的組織培養(yǎng)法，依次包括以下步驟1)將無(wú)病斑、無(wú)蟲癭且健壯飽滿的溫郁金1號(hào)塊根放入生化培養(yǎng)箱進(jìn)行催芽；2)割取小芽進(jìn)行流水沖洗；3)將小芽經(jīng)常規(guī)消毒后，剝?nèi)?～5毫米大小的莖尖進(jìn)行培養(yǎng)；4)割取莖尖作為小苗Ⅰ接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)；5)割取小苗Ⅰ上誘導(dǎo)出的不定芽Ⅰ作為小苗Ⅱ進(jìn)行增殖培養(yǎng)；6)割取小苗Ⅱ上長(zhǎng)出的不定芽Ⅱ作為小苗Ⅲ進(jìn)行生根培養(yǎng)；7)待上述小苗Ⅲ長(zhǎng)到高4～8cm且具有至少3條長(zhǎng)于2cm的根時(shí)，得可出瓶種植的種苗。采用該方法能快速獲得大量的溫郁金1號(hào)組培種苗。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101953300SQ201010265480
公開日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2010年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月24日
發(fā)明者毛碧增, 陳麗閩 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)