專利名稱：一種低毒性的人胚胎干細胞玻璃化凍存液以及使用該凍存液的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種細胞的凍存液，具體為一種低毒性的人胚胎干細胞玻璃化凍存液。
背景技術：
自從1998年Thomson等首次成功分離得到hESCs系以來，hESCs在未來的再生醫(yī) 學、發(fā)育生物學以及藥理學、毒理學等研究領域被寄予眾望。hESCs未來的廣泛應用意味著 細胞資源需要在不同的實驗室之間運輸和傳遞，以促進科學合作；此外就建立hESCs庫而 言，需要提供具有不同組織相容抗原分型的種子細胞用于將來的移植替代治療，以及在不 同階段保存細胞有利于保證細胞系的穩(wěn)定和細胞材料能被永久使用，這些目標的實現都需 要建立一種高效的冷凍方式來保存hESCs。目前所廣泛使用的傳統(tǒng)慢速凍存法保存hESCs 效率較低，多數hESCs解凍后死亡和易于分化。Reubinoff等首次將玻璃化冷凍應用于 hESCs的冷凍，發(fā)現其復蘇效率明顯高于慢速冷凍。因為玻璃化冷凍過程采用急速降溫，理 論上> -1500°C /min。一方面最大限度地避免了冰晶形成，另一方面減少了細胞在正常物 理溫度下接觸低溫的時間，降低了冷凍保護液對細胞的毒性。目前國際上的報道，經過玻璃 化冷凍，有大于75%的hESCs克隆能夠存活。但是有一個問題就是在hESCs玻璃化冷凍過 程中使用的冷凍保護劑DMSO對細胞的毒性較大。DMSO是一種滲透性保護劑，能夠降低細 胞冰點，減少冰晶的形成，減輕自由基對細胞損害，改變生物膜對電解質、藥物、毒物和代謝 產物的通透性。但是研究表明，DMSO存在嚴重的毒性作用，與蛋白質疏水集團發(fā)生作用，導 致蛋白質變性，具有血管毒性和肝腎毒性，因此在hESCs運用于臨床的過程中，應避免引入 DMSO的潛在影響。

發(fā)明內容
本發(fā)明將探討用一種毒性較低的冷凍保護劑對DMSO進行替代，對hESCs進行玻璃 化凍存，并取得與之相等甚至更好的冷凍復蘇效果。本發(fā)明提供的hESCs玻璃化凍存液是由下列組分組成的其由三種分開保存的混 合液組成，各混合液按體積百分比計的組成如下平衡緩沖液20%FBS+2% IM HEPES+78% DMEM-F12 ；玻璃化凍存液I 10%乙二醇+10%異丙醇+80%平衡緩沖液；玻璃化凍存液II 20%乙二醇+20%異丙醇+30% IM蔗糖溶液+30%平衡緩沖液。使用時將hESCs用平衡緩沖液平衡5-10分鐘；加入玻璃化凍存液I 1分鐘；再加 入玻璃化凍存液II 25秒，最后直接投入液氮內保存。該玻璃化凍存方法用到的凍存液去除了對細胞毒性較大的DMS0，采用乙二醇和異 丙醇按一定比例混合作為滲透性防凍劑，結合蔗糖溶液作為非滲透性保護劑用于低溫保存 hESCs，復蘇后存活率達到86. 67士 15. 28%，且91. 53士7. 50%的hESCs仍然保持了未分化特征。DMEM-F12, ^Bnn^ii^o Dulbecco' s Modified Eagle Medium =Nutrient Mixture F-12(DMEM/F12)中的 KNOCKOUT DMEM-F12 (貨號 12660-012)


中的基因和抗原名稱的中文意思對應翻譯如下Hepes :4_羥乙基哌嗪乙磺酸；0CT-4 一種干細胞轉錄因子，核內抗原；SSEA-3 階段特異性胚胎抗原_3 ；TRA-1-60 腫瘤排斥抗原_1_60SSEA-4 階段特異性胚胎抗原_3 ；TRA-1-81 腫瘤排斥抗原_1_81S0X-2、NANOG、REX-I —種干細胞轉錄因子編碼基因；TDGFl 畸胎癌來源的生長因子1 ；TERFl 端粒相關因子1FGF4 成纖維細胞生長因子4 ；LEFTYA =TGF-β家族的基因THY-I —種抑癌基因，又名CD90 ；DPPA2 發(fā)育多能性相關因子2
上述物質都是可商業(yè)化得到的。

圖1復蘇后hESCs的形態(tài)學和細胞免疫細胞化學染色結果。A復蘇后細胞在形態(tài) 上保持了未分化外觀克隆內細胞排列緊密，細胞維持高核質比。復蘇后克隆為0ct-4(B)， SSEA-3 (C)，SSEA-4 (D)，TRA-1-60 (E)，TRA-1-81 (F)陽性克?。粓D2運用本發(fā)明凍存hESCs，復蘇后表達了多能性基因Oct-4，S0X-2，Nanog, Rex 1， TDGFl，TERFl，Thy-I，LEFTYA，FGF4 和 DPPA2 ；
具體實施例方式方法和步驟1、配液1).平衡緩沖液15.6ml DMEM-F124. Oml FBS0. 4ml IM HEPES2). IM蔗糖溶液3. 42g 蔗糖8. Oml 平衡緩沖液37°C溶解后，用0. 22um規(guī)格的過濾器過濾，4°C保存?zhèn)溆?，或_20°C長期保存。3).玻璃化凍存液I800ul 平衡緩沖液IOOul 乙二醇IOOul 異丙醇4).玻璃化凍存液II300ul 平衡緩沖液
300ul IM 蔗糖溶液200ul 乙二醇200ul 異丙醇5).復蘇液I (0. 2M蔗糖溶液)800ul 平衡緩沖液200ul IM 蔗糖溶液6) ·復蘇液11 (0. IM蔗糖溶液)900ul 平衡緩沖液IOOul IM 蔗糖溶液2、細胞準備1)用 Rock inhibitor 處理 hESCs 1 小時。2)將hESCs克隆用Iml注射器切成10個約ImmXlmm大小的團塊，用TIP頭輕輕鏟 起使之懸浮。3、冷凍將10個hESCs團塊放入平衡緩沖液中平衡5-10分鐘；玻璃化凍存液I 1分鐘；玻 璃化凍存液II 25秒，最后利用毛細作用吸入凍存麥管中，直接投入液氮內。4、復蘇將凍存麥管從液氮中取出，并迅速將其中的hESCs團塊傳入復蘇液I 1分鐘；復蘇 液II 5分鐘；平衡緩沖液5分鐘；再傳入另一平衡緩沖液中5分鐘，最后將細胞團塊種入 hESCs的基礎培養(yǎng)基中。5、結果統(tǒng)計免疫細胞化學染色結果顯示為Oct-4，SSEA-3，SSEA-4，TRA-1-60，TRA-1-81陽性 (圖 IB, 1C, ID, IE, 1F)，表達了多能性基因 Oct-4, Sox-2, Nanog, Rexl, TDGFl, TERFl, Thy-I, LEFTYA，FGF4和DPPA2(圖2)，在形態(tài)上保持了未分化外觀克隆內細胞排列緊密，細胞維持 高核質比(圖1A)。本實施例重復了 3次，結果統(tǒng)計如下復蘇百分率96.67士5. 77存活百分率86.67士 15. 28未分化百分率91. 53士7. 50。
權利要求
一種低毒性的人胚胎干細胞玻璃化凍存液，其特征在于其由三種分開保存的混合液組成，各混合液按體積百分比計的組成如下平衡緩沖液20％FBS+2％1M HEPES+78％DMEM F12；玻璃化凍存液I10％乙二醇+10％異丙醇+80％平衡緩沖液；玻璃化凍存液II20％乙二醇+20％異丙醇+30％1M蔗糖溶液+30％平衡緩沖液。
2.使用上述低毒性的人胚胎干細胞玻璃化凍存液保存細胞的方法，將hESCs用平衡緩 沖液平衡5-10分鐘；加入玻璃化凍存液I 1分鐘；再加入玻璃化凍存液II 25秒，最后直接 投入液氮內保存。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種低毒性的人胚胎干細胞(hESCs)玻璃化凍存液。該凍存液由DMEM-F12液，HEPES緩存液，胎牛血清(FBS)，乙二醇，異丙醇和蔗糖按一定比例組成。與傳統(tǒng)的細胞凍存方法相比，該凍存方法中去除了對細胞毒性較大的二甲基亞砜(DMSO)，采用乙二醇和異丙醇按一定比例混合作為滲透性防凍劑，結合蔗糖溶液作為非滲透性保護劑用于低溫保存hESCs，且復蘇率和存活率都達到了較高的水平。
文檔編號A01N1/02GK101897330SQ20101026675
公開日2010年12月1日 申請日期2010年8月31日 優(yōu)先權日2010年8月31日
發(fā)明者盧光琇, 林戈, 歐陽琦 申請人:湖南光琇高新生命科技有限公司