專利名稱：苜蓿花藥懸浮培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及花藥懸浮培養(yǎng)技術(shù)，具體涉及一種苜蓿花藥懸浮培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
名稱為《用于培育肉蓯蓉愈傷組織的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)系的構(gòu)建方法》的中國專利 申請(申請?zhí)?00310113090)公開了 一種用于培育肉蓯蓉愈傷組織的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系 的構(gòu)建方法，為將固體培養(yǎng)基上生長的由肉蓯蓉種子誘導(dǎo)得到的愈傷組織轉(zhuǎn)移到添加 0. 5-10mg/L的2，4-D的B5固體培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)形成的淺黃色，半透明，松軟易碎的 愈傷組織，再轉(zhuǎn)接到相同組分和含量的液體培養(yǎng)基中，控制適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件并進(jìn)行多次繼 代培養(yǎng)，使得到本發(fā)明穩(wěn)定的用于培育肉蓯蓉愈傷組織的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系，該細(xì)胞懸浮培 養(yǎng)系生長良好，次級代謝產(chǎn)物含量高，可以達(dá)到肉蓯蓉愈傷組織的工業(yè)化規(guī)模培育生產(chǎn)的 目的。在上述方法中，肉蓯蓉(Cistanche deserticola Ma.)屬于列當(dāng)科多年生寄生草 本植物，而苜蓿為豆科多年生草本植物，兩者在遺傳、性狀方面有一定差距，并且以苜蓿Fl 代花藥為愈傷組織的誘導(dǎo)材料對外界的培養(yǎng)條件更為敏感，肉蓯蓉愈傷組織的培養(yǎng)方法顯 然不能用于苜蓿屬植物懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)體系需要重新建立。細(xì)胞懸浮培養(yǎng)分散性好、細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)大小均勻，生長迅速，重復(fù)性好。本實驗對 苜蓿采用花藥懸浮培養(yǎng)，明確苜蓿花藥懸浮培養(yǎng)條件，建立體系為苜蓿體細(xì)胞雜交提供優(yōu) 良的培養(yǎng)條件。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決苜蓿屬植物懸浮培養(yǎng)技術(shù)的空白，本發(fā)明提供了一種苜?；ㄋ帒腋∨囵B(yǎng) 方法。本發(fā)明所說的苜蓿花藥懸浮培養(yǎng)方法，包括以下步驟a.取苜蓿花蕾將其放入冰箱內(nèi)4°C低溫處理24h，然后取其花藥接種在愈傷組 織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)愈傷；所說的愈傷組織液體培養(yǎng)基為NB培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含2， 4-DO. 3mg/L、NAA0. 3mg/L、蔗糖 2-3% ；b.愈傷組織形成后，選取鮮重l_2g繼代5次以后、將第6次繼代20d左右的淡黃 色或乳白色、生長快、結(jié)構(gòu)疏松顆粒狀胚性愈傷組織置于含有NB、Ms液體培養(yǎng)基中(基本 成分同誘導(dǎo)培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基配制過程不加瓊脂)，控溫?fù)u床上遮光下培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為 110-120rpm，培養(yǎng)溫度25士 1°C?？刂茟腋∨囵B(yǎng)條件并且繼代培養(yǎng)?；ㄋ帒腋∨囵B(yǎng)是選取經(jīng)固體培養(yǎng)基誘導(dǎo)、最后一次繼代20d左右的淡黃色或乳白 色生長快，結(jié)構(gòu)疏松顆粒狀苜蓿花藥胚性愈傷組織，置于NB、MS液體培養(yǎng)基(2，4-DO. 3mg/ L+NAAO. 3mg/L)中，振蕩培養(yǎng)24h后用100目尼龍網(wǎng)過濾、離心，將所得的單細(xì)胞于液體培 養(yǎng)基培養(yǎng)?？刂婆囵B(yǎng)條件，多次繼代獲得苜?；ㄋ幏€(wěn)定懸浮細(xì)胞系。該懸浮細(xì)胞系生長良 好，可廣泛應(yīng)用于苜蓿細(xì)胞形態(tài)、生理、遺傳、凋亡等研究工作，為基因工程在植物細(xì)胞水平操作提供理想的材料和途徑。本發(fā)明通過一系列苜?；ㄋ帒腋∨囵B(yǎng)的實驗，探索了苜蓿懸浮細(xì)胞系建立的基本 條件，優(yōu)化了苜蓿懸浮細(xì)胞系建立的培養(yǎng)基組合。通過本發(fā)明的方法，以苜?；ㄋ幣囵B(yǎng)誘導(dǎo) 愈傷組織，建立苜蓿懸浮培養(yǎng)體系，從而快速高效獲得具有親本全套遺傳基因的單倍體植 株，為通過細(xì)胞懸浮培養(yǎng)建立苜蓿DH群體提供技術(shù)支持。同時細(xì)胞懸浮體系建立后有利于 提高苜蓿產(chǎn)品的質(zhì)量，控制次級代謝產(chǎn)物含量和工業(yè)化規(guī)模培育生產(chǎn)等目的。


圖1是苜蓿懸浮細(xì)胞系培養(yǎng)物生長曲線，圖2是起始密度對懸浮細(xì)胞生長的影響，圖3是2. 4-D濃度對懸浮細(xì)胞生長的影響，圖4是蔗糖質(zhì)量濃度對懸浮細(xì)胞生長的影響，圖5是苜蓿懸浮培養(yǎng)液中糖濃度的變化規(guī)律。
具體實施例方式1.試驗?zāi)繕?biāo)本試驗從不同來源苜蓿種質(zhì)中篩選出具有多葉性狀和株高性狀的苜蓿單株， 移栽至種質(zhì)資源圃進(jìn)行雜交，播種F1代，取其花藥通過花藥培養(yǎng)的方式，建立苜蓿懸浮 培養(yǎng)體系，為苜?？旆斌w系的建立提供理論依據(jù)。本試驗培養(yǎng)所用花藥來自選系多葉 0501 X Sanditi 組合。試驗品種為自選培育品系。該品系通過以下方法獲得1. 2005年從澳大利亞品系PL34HQ田間選擇多葉率較高的苜蓿品系，命名為 0501 (2005年田間移栽，編號為01)，同時選擇株高性狀優(yōu)良的Sanditi品系，確定作為目標(biāo) 性狀。2. 2007年5-6月于苜蓿初花期以0501為母本，Sanditi為父本進(jìn)行人工授粉雜
交，套袋。3. 2007 年 7 月收種。通過以上方法獲得的雜交Fl品系即為本試驗中采用的材料。因本研究中采用的原始材料為已公開品系，故以上方法也可適用于已公布品系， 公眾也可依此方法獲得相關(guān)材料。2.試驗內(nèi)容2. 1懸浮細(xì)胞系生長特性的測定各取6瓶第四次繼代后4d的穩(wěn)定懸浮細(xì)胞，倒入無菌的250ml三角瓶，分別混合 均勻，靜置2min后，按照繼代的方法，用吸管吸取密實體積約Iml的懸浮細(xì)胞至150ml的三 角瓶中，加入30ml液體培養(yǎng)基，每個品種做18瓶(共做54瓶)。每2d取2瓶進(jìn)行密實細(xì) 胞體積(PCV)、鮮重、干重測定，重復(fù)三次取平均值。2. 1. 1密實細(xì)胞體積(PCV)測定培養(yǎng)一定時間的懸浮細(xì)胞系，取其充分搖勻的懸 浮培養(yǎng)物10ml，放入刻度離心管中，IOOOrpm下離心5min，讀取密實細(xì)胞體積。2. 1. 2鮮重的測定將懸浮培養(yǎng)物倒在已知重量的濕尼龍網(wǎng)(100目)上，用去離子水洗去培養(yǎng)基。真空抽濾除去細(xì)胞上沾著的多余水分，然后稱重。2. 1. 3干重的測定懸浮細(xì)胞經(jīng)干尼龍網(wǎng)(100目)過濾，烘干(60°C，IOh)后稱重。分別以懸浮細(xì)胞的PCV (ml)、鮮重(g)、干重(g)生長量為縱坐標(biāo)，以懸浮培養(yǎng)時間 (d)橫坐標(biāo)作苜蓿懸浮細(xì)胞系培養(yǎng)物生長曲線，如圖1。2. 2懸浮細(xì)胞生長的影響因素2. 2. 1不同培養(yǎng)密度對苜蓿懸浮細(xì)胞生長的影響(從穩(wěn)定懸浮細(xì)胞系中分別吸取 密實體積為 0. Iml, 0. 5ml, 1. 0ml, 2. 0ml, 3. 0ml, 4. Oml 進(jìn)行培養(yǎng))從初始試驗材料中分別吸取以上濃度的懸浮培養(yǎng)物，6d繼代一次，在第三次繼代 后的第6d分別測定PCV，鮮重、干重的增殖數(shù)量，重復(fù)三次取平均值。以起始接種PCV (ml)量為橫坐標(biāo)，以懸浮細(xì)胞的PCV (ml)、鮮重(g)、干重(g)增殖 倍數(shù)為縱坐標(biāo)作起始密度對苜蓿懸浮細(xì)胞生長的影響曲線圖，如圖2。2. 2. 2生長調(diào)節(jié)劑對懸浮細(xì)胞生長的影響(2，4-D濃度0. 3mg/L, 0. 5mg/L, lmg/L, 2mg/L,3mg/L,4mg/L)將穩(wěn)定懸浮系培養(yǎng)物接種到附加不同2，4-D濃度的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，繼代6d后 測定PCV增殖情況。重復(fù)三次取平均值。初始接種量均為200mg/瓶。以2，4-D濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)，以PCV增殖倍數(shù)為縱坐標(biāo)作2，4_D濃度對懸浮細(xì) 胞生長的影響圖，如圖3。2. 2. 3蔗糖濃度對懸浮細(xì)胞生長的影響(蔗糖濃度分別為10g，15g，20g, 25g，30g, 35g)2. 2. 3. 1采用不同濃度蔗糖濃度(分別為10g，15g，20g，25g，30g，35g)培養(yǎng)基進(jìn)行 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，并對繼代3次達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)的懸浮細(xì)胞系進(jìn)行檢測，每6d繼代一次。以糖濃度(g/L)為橫坐標(biāo)，以同一時期懸浮細(xì)胞鮮重(g)為縱坐標(biāo)作糖的質(zhì)量濃 度對苜蓿懸浮細(xì)胞生長的影響曲線，如圖4。2. 2. 3. 2苯酚-濃硫酸法測定培養(yǎng)液中的殘?zhí)菨舛?1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精確稱取50g糖溶于比蒸餾水中，吸取01^、21^、41^、61^、81^、1011^溶液于IOOmL 容量瓶中定容，其濃度梯度分別為Og · L-1UOg · DOg · L-1JOg · Γ1、* · L-1JOg · L-1。 取上述標(biāo)準(zhǔn)液各lmL，W ImL 5%酚水溶液(5%酚水溶液精確稱取5g苯酚溶于IOOmL蒸餾 水定容)，混勻后加5mLH2S04(98% )。放置20min后，在487nm處，以第一管溶液作為空白， 測得不同濃度下吸光度值，以吸光度值為橫坐標(biāo)，糖濃度為縱坐標(biāo)作圖，如圖5，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲 線，求回歸方程。(2)培養(yǎng)液中殘?zhí)菨舛鹊亩糠治鑫悠芬篒mL按上述標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法處理樣品液，以蒸餾水為空白參比，測 定樣品液吸光度。測得吸光度值代入回歸方程式求解樣液中殘?zhí)菨舛取?.試驗方案本試驗供試材料于2008. 09. 01在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院在25°C下經(jīng)培養(yǎng)皿發(fā) 芽，于2008. 09. 06移栽至花盆培養(yǎng)。本試驗共計三個處理，每處理設(shè)三個重復(fù)，每重復(fù)預(yù)設(shè) 10個隨機(jī)區(qū)組。3. 1試驗器材
供試苜蓿種子各數(shù)粒，培養(yǎng)皿，濾紙，蒸餾水，NB (N6大量元素+B5微量元素和有機(jī) 成分)。生長素有2，4-0、離々，細(xì)胞分裂素有1(1\6-84，80 120目尼龍網(wǎng)。培養(yǎng)基的設(shè)計本試驗擬以NB為花藥愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以NB、MS液體培養(yǎng)基進(jìn)行苜蓿胚性 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，在不同階段加入不同濃度梯度的激素培養(yǎng)。3. 2細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的建立3. 2. 1花藥愈傷組織的誘導(dǎo)取試驗苜蓿品種的花蕾并將其放入4°C冰箱內(nèi)低溫處理24h，然后接種在愈傷組 織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，附加不同濃度組合的2，4-D、NAA、KT、6-BA等激素。蔗糖濃度為6%，瓊脂 為0. 7%，PH值為5. 6 6. 1。接種后將培養(yǎng)皿放入25°C的暗培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)15d后轉(zhuǎn)入 溫度為25°C、光強(qiáng)ΙΟΟΟΙχ、光照時間16h/d、濕度40%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，20d后觀察愈傷組織 誘導(dǎo)情況，并注意愈傷組織的時間和狀態(tài)。3. 2. 2繼代培養(yǎng)與篩選(增殖)應(yīng)用NB培養(yǎng)基，附加不同濃度組合的2，4_D、KT、6_BA等激素，將所誘導(dǎo)的愈傷 組織進(jìn)行繼代。每次繼代挑選顏色鮮綠或黃綠色、生長迅速的愈傷組織予以繼代。前兩次 繼代周期為25d，然后選擇顆粒較細(xì)、色澤淡黃、生長迅速的愈傷組織，加快繼代頻率(1次 /20d)。培養(yǎng)條件同上。3. 2. 3胚性細(xì)胞懸浮培養(yǎng)愈傷組織形成后，選取鮮重l_2g繼代5次以后、最后一次繼代20d左右的淡黃 色或乳白色生長快，結(jié)構(gòu)疏松顆粒狀胚性愈傷組織，置于盛有30ml NB、MS液體培養(yǎng)基 的IOOml三角瓶中，用鑷子將愈傷組織輕輕夾碎，然后置于搖床上振蕩培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為 110 120rpm，24h后用100目尼龍網(wǎng)過濾，除去愈傷組織碎片及大的細(xì)胞團(tuán)，再經(jīng)IOOOrpm 離心2min，除去上面的碎渣，將所得的單細(xì)胞放入加有30ml液體培養(yǎng)基的三角瓶中，制成 細(xì)胞懸浮液，置于搖床上在散射光下培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為110 120rpm，培養(yǎng)溫度25 士 1 °C。前 幾次繼代時，待培養(yǎng)物靜置2min后，用吸管吸出2/3左右上清液，補(bǔ)充加入新鮮液體培養(yǎng)基 至30ml。以后每次繼代，均用吸管吸取密實體積(PCV)約lml(鮮重約2g)的懸浮細(xì)胞至 IOOml的三角瓶中，加入液體培養(yǎng)基至30ml，根據(jù)細(xì)胞的生長速度，每5 8d繼代一次。5.實驗數(shù)據(jù)5. 1苜蓿懸浮細(xì)胞系生長特性的測定結(jié)果如表1和圖1表1.(初始接種量為1ml，約為2g)
權(quán)利要求
一種苜蓿花藥懸浮培養(yǎng)方法，包括以下步驟a.取苜?；ɡ俜湃氡鋬?nèi)4℃低溫處理24h，然后取其花藥接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)愈傷；所說的愈傷組織液體培養(yǎng)基為NB培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含2，4 D0.3mg/L、NAA0.3mg/L、蔗糖2 3%；b.愈傷組織形成后，選取鮮重1 2g繼代5次以后，將第6次繼代20d左右的淡黃色或乳白色、生長快、結(jié)構(gòu)疏松顆粒狀胚性愈傷組織置于含有NB 、Ms的液體培養(yǎng)基中，控溫?fù)u床上遮光下培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為110—120rpm，培養(yǎng)溫度25士1℃；控制懸浮培養(yǎng)條件并且繼代培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種苜?；ㄋ帒腋∨囵B(yǎng)方法，該方法具體是取苜?；ɡ俜湃氡鋬?nèi)4℃低溫處理24h，然后取其花藥接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)愈傷；愈傷組織形成后，選取鮮重1-2g繼代5次以后，將第6次繼代20d左右的淡黃色或乳白色、生長快、結(jié)構(gòu)疏松顆粒狀胚性愈傷組織置于含有NB、Ms的液體培養(yǎng)基中，控溫?fù)u床上遮光下培養(yǎng)，控制懸浮培養(yǎng)條件并且繼代培養(yǎng)。本發(fā)明以苜?；ㄋ幣囵B(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織，建立苜蓿懸浮培養(yǎng)體系，從而快速高效獲得具有親本全套遺傳基因的單倍體植株，為通過細(xì)胞懸浮培養(yǎng)建立苜蓿DH群體提供技術(shù)支持。同時細(xì)胞懸浮體系建立后有利于提高苜蓿產(chǎn)品的質(zhì)量，控制次級代謝產(chǎn)物含量和工業(yè)化規(guī)模培育生產(chǎn)等目的。
文檔編號A01H4/00GK101946710SQ20101026734
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月31日
發(fā)明者姚喜紅, 耿小麗, 魏臻武 申請人:揚(yáng)州大學(xué)