專利名稱：小蓬竹組織培養(yǎng)過程中外植體的消毒方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于竹類組織培養(yǎng)技術(shù)，具體地說是涉及一種小蓬竹組織培養(yǎng)過程中外植 體的消毒方法。
背景技術(shù)：
^bMYi (Drepanostachyum Luodianense (Yi et R. S. Wang) Keng f. ) Μ^^^Υ 亞科鐮序竹屬竹種，又名“藤竹”，是中國特有種，在《中國物種紅色名錄》中被列為極危種。 目前只在貴州的羅甸、平塘及長(zhǎng)順有栽培或有野生分布，常成片生長(zhǎng)于海拔600 IOOOm的 石灰?guī)r裸露石山上。它的竹材柔韌可編涼椅和農(nóng)具，也可作為造紙?jiān)?；形態(tài)優(yōu)美，是良好 的園林綠化竹種，并在環(huán)境惡劣的喀斯特地區(qū)生長(zhǎng)良好，能耐干旱和瘠薄，對(duì)增強(qiáng)土壤的固 土、保水、保肥能力效果十分顯著，是喀斯特地區(qū)的適生性物種，在喀斯特生態(tài)系統(tǒng)中對(duì)水 源涵養(yǎng)、水土保持、養(yǎng)分平衡等生態(tài)功能發(fā)揮著重要作用，具有很高的生態(tài)效益。竹類的生殖周期長(zhǎng)，很少開花結(jié)實(shí)，難以獲得大規(guī)模繁殖的種子。而傳統(tǒng)的移竹、 埋鞭、竹枝扦插等繁殖方法存在消耗種竹多、種苗運(yùn)輸不便、勞動(dòng)強(qiáng)度大、繁殖系數(shù)低等問 題。采用組織培養(yǎng)的方法效率高，條件可控，生長(zhǎng)快，周期短，重復(fù)性強(qiáng)，可進(jìn)行周年試驗(yàn)或 生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，可以快速繁殖苗，適合竹子的工廠化百苗。迄今為止，國內(nèi)外竹子組織培養(yǎng)工作取得了很大的進(jìn)展，但還是存在著許多的問 題，如何通過有效的消毒方法降低外植體的污染率，就是需要首先解決的問題。與其他植物 相比，竹子外植體消毒這一環(huán)節(jié)較為困難，很難達(dá)到理想的滅菌效果。這與竹類植物的特殊 形態(tài)結(jié)構(gòu)有關(guān)。竹類植物的表皮細(xì)胞具有致密的乳突及較厚的角質(zhì)層，乳突表面蠟質(zhì)狀的 物質(zhì)及乳突間嵌附著的塵埃和各種菌類的孢子等，均阻礙了消毒液的滲透，從而影響外植 體的充分滅菌。若選用桿芽、枝芽做外植體，中空?qǐng)?jiān)硬的竹稈也導(dǎo)致外植體切割困難，細(xì)菌 和真菌孢子容易從中空部位進(jìn)入竹稈內(nèi)部組織，造成后續(xù)污染。在外植體消毒時(shí)，消毒時(shí)間 的控制也是一個(gè)重要問題，時(shí)間太短不能殺死細(xì)菌病毒，時(shí)間太長(zhǎng)在殺死病菌的同時(shí)也會(huì) 對(duì)植物造成傷害，引起褐變，影響外植體的誘導(dǎo)與增殖。因此，尋找有效的滅菌方法，減少污 染瓶的丟棄，對(duì)于降低種苗生產(chǎn)成本和實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)具有很重要的意義。目前國內(nèi)對(duì)小蓬竹研究最多的是小蓬竹的群落結(jié)構(gòu)、多樣性、水土保持功能、土壤 種子庫、葉面積指數(shù)以及其栽培技術(shù)研究應(yīng)用等領(lǐng)域，而在組織培養(yǎng)方面尤其是外植體消 毒方法的研究還是空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種小蓬竹組織培養(yǎng)過程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)， 即外植體的消毒方法，以克服小蓬竹繁殖困難，和組織培養(yǎng)過程中成活率低的問題。植物組織培養(yǎng)通常按以下步驟一、培養(yǎng)基的配制和滅菌本發(fā)明實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基為通用的MS培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配 制后在24h內(nèi)必須進(jìn)行滅菌，通常采用的滅菌方法為高壓滅菌法，其原理是通過加熱，在密閉的高壓鍋內(nèi)隨著水蒸氣壓力的不斷上升，使水的沸點(diǎn)不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之升
尚ο二、外植體的處理及消毒消毒的目標(biāo)是既要消滅材料上的病菌，又不損傷植物材料。三、外植體的接種無菌操作實(shí)驗(yàn)室中使用的無菌操作設(shè)備是超凈工作臺(tái)。接種前應(yīng)進(jìn)行地面的清潔 衛(wèi)生工作，用75%乙醇噴霧噴灑接種室，擦拭超凈工作臺(tái)臺(tái)面，培養(yǎng)皿、酒精燈和其他工具 也要事先放在超凈工作臺(tái)上，一起用紫外燈照射20min。操作前要用酒精擦洗手，操作中要 經(jīng)常用酒精擦洗手。不準(zhǔn)講話，亦不準(zhǔn)對(duì)著操作區(qū)呼吸，以免口腔中所帶的微生物污染材 料、培養(yǎng)基和用具。操作中可采用250或500mL的廣口瓶，放入95%的酒精，以便對(duì)操作工 具進(jìn)行消毒。在無菌操作時(shí)，把鑷子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒 精燈火焰上灼燒滅菌。灼燒接種工具，待冷卻后在酒精燈附近打開培養(yǎng)基瓶口，立即將所取 的外植體迅速置入固體培養(yǎng)基中。在接種時(shí)，不能用生銹的解剖刀，動(dòng)作要敏捷，隨切隨接， 減少傷口在空氣中暴露的時(shí)間。蓋瓶蓋前應(yīng)將瓶口在火焰上燒一下，再將蓋子也在火焰上 燒一下，然后蓋上。每次重新操作都要把工具在火焰上消毒。四、植物組織培養(yǎng)培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度1200LX，每日光照12h，溫度25 27°C。從接種完起每天 觀察其生長(zhǎng)和污染情況，30天后記錄結(jié)果，統(tǒng)計(jì)其污染數(shù)、成活數(shù)，進(jìn)行分析得出最佳方案。植物組織培養(yǎng)的成功與否取決于外植體的制備、無菌操作和人工培養(yǎng)環(huán)境。外植 體的制備是能否建成離體繁殖系要過的第一關(guān)。所謂的外植體是指將外界生長(zhǎng)的植物的細(xì) 胞和組織經(jīng)過一系列的無菌處理形成的有活性的無菌組織或細(xì)胞，根據(jù)工作中的不同材料 采制適宜的外植體。消毒是植物組織培養(yǎng)的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，在自然條件下作為植物的外植 體材料，不管內(nèi)部還是外部均帶有很多的細(xì)菌和霉菌。因此為了讓外植體能夠在無菌的條 件下生長(zhǎng)，消毒成了組織培養(yǎng)一個(gè)必不可少的步驟。消毒的目標(biāo)是既要消滅材料上的病 菌，又不損傷植物材料。因此一方面要考慮藥劑對(duì)各類菌類的殺滅效果，從中選出最有效的 殺菌劑；另一方面，還應(yīng)考慮植物材料對(duì)殺菌劑的忍耐力。使用什么藥劑、處理時(shí)間，要根據(jù) 植物材料種類和取用的部位進(jìn)行試驗(yàn)。本發(fā)明根據(jù)小蓬竹的特點(diǎn)，在實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，提出小蓬竹外植體的消毒方法，選擇 了最有效的殺菌劑，并根據(jù)小蓬竹材料對(duì)殺菌劑的忍耐性實(shí)驗(yàn)出藥劑濃度和處理時(shí)間。本發(fā)明外植體的消毒方法，其消毒流程按下列步驟進(jìn)行(1)將小蓬竹生長(zhǎng)健壯 的半木質(zhì)化枝條作外植體，用洗潔精溶液完全浸泡30min，(2)用自來水浸泡30min ； (3) 用流水沖洗至無泡沫產(chǎn)生為止，用濾紙吸干表面水分；(4)在超凈工作臺(tái)上把已沖洗干凈 的外植體浸入70-75%酒精中消毒Imin ； (5)用無菌水浸泡不斷搖動(dòng)沖洗3 4次；(6)最 后浸入0. 升汞或2%次氯酸鈉溶液滅菌6-12min，其間不斷搖動(dòng)；(7)然后用無菌水沖洗 后，用無菌濾紙吸干表面水分，即可用于接種。外植體一般使用乙醇濃度70% 75%。這一濃度范圍的乙醇具有較強(qiáng)的穿透力 和殺菌力。利用乙醇處理材料時(shí)，一般不超過30s。用乙醇處理外植體，除了有外植體體表 滅菌的作用外，還有浸潤(rùn)組織材料的作用。許多植物的外植體都需要先通過乙醇的浸潤(rùn)，然 后再使用其他藥品作進(jìn)一步滅菌。由于竹類植物表皮細(xì)胞具有非常致密的乳突，塵埃及各種菌類的孢子嵌著在乳突間的縫隙內(nèi)。乳突表面有一層蠟質(zhì)狀的物質(zhì)，表皮細(xì)胞還具有較 厚的角質(zhì)層，這些都阻礙了消毒液的滲透。因此在用酒精進(jìn)行消毒前還要先用洗潔精進(jìn)行 浸泡，使里面蠟質(zhì)狀物質(zhì)溶化。且用乙醇消毒時(shí)間延長(zhǎng)到Imin才能很好地浸潤(rùn)組織。本發(fā)明使用升汞濃度為0. 1%，并在實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上提出處理時(shí)間。經(jīng)過升汞處理過的 材料，由于升汞在外植體表面的殘留會(huì)導(dǎo)致外植體在培養(yǎng)過程中的壞死，甚至使培養(yǎng)失敗。 所以必須在升汞處理之后，用無菌水沖洗干凈，一般要沖洗5次以上，才可以保證外植體表 面的殘留升汞很少。本發(fā)明用2%次氯酸鈉同樣在實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上提出處理時(shí)間，處理后的外植體同樣要 用無菌水沖洗3 4次。實(shí)驗(yàn)證明當(dāng)步驟(5)酒精濃度為75%時(shí)，步驟(6)滅菌處理用0. 升汞處理外 植體lOmin，在MS培養(yǎng)基中，接種成活率最高，低于或高于lOmin，接種成活率都會(huì)降低。當(dāng)步驟(5)酒精濃度為75%時(shí)，步驟(6)滅菌處理用2%次氯酸鈉處理外植體 IOmin,在MS培養(yǎng)基中，接種成活率最高，低于或高于lOmin，接種成活率都會(huì)降低。本發(fā)明的有益效果是解決了小蓬竹繁殖困難，尤其是組織培養(yǎng)過程外植體消毒、 誘導(dǎo)的問題，外植體污染率低，可降到13. 3%，接種后未污染的外植體成活率達(dá)到73. 3%, 克服了傳統(tǒng)的母竹移栽、竹鞭移栽等繁殖方法耗費(fèi)資源、對(duì)生態(tài)環(huán)境破壞大、培植時(shí)間長(zhǎng)、 效率低、運(yùn)輸成本高等缺點(diǎn)，且不受季節(jié)的限制，為小蓬竹大面積的推廣與利用，充分發(fā)揮 其生態(tài)效益和經(jīng)濟(jì)效益提供了快速且充足供應(yīng)的有效途徑。以下通過具體實(shí)施方式
來進(jìn)一步說明本發(fā)明的有益效果。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合較佳實(shí)施例，對(duì)依據(jù)本發(fā)明提出的小蓬竹組織培養(yǎng)無菌體系的消毒方 法，的具體實(shí)施方式
、特征及其功效，詳細(xì)說明如后。(一)試驗(yàn)材料供試的材料采自從羅甸移栽于貴州大學(xué)苗圃、成活了的且生長(zhǎng)健 壯的小蓬竹植株，外植體選用當(dāng)年生枝芽飽滿的半木質(zhì)化枝條。( 二)試驗(yàn)方法1、培養(yǎng)基的滅菌選用通常使用的MS培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配制后在24h內(nèi)必須進(jìn)行滅菌，通常采用的滅 菌方法為高壓滅菌法，其原理是通過加熱，在密閉的高壓鍋內(nèi)隨著水蒸氣壓力的不斷上升， 使水的沸點(diǎn)不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之升高。首先將需要滅菌的物品放入滅菌設(shè)備中， 關(guān)閉放氣閥，通電后，待壓力上升到0. 05MPa時(shí)，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零 后，再關(guān)閉放氣閥。隨著壓力不斷上升，水的沸點(diǎn)不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之增加。壓 力表上升達(dá)0. 1 0. 15Mpa時(shí)，鍋內(nèi)溫度可達(dá)121°C。在此蒸汽溫度下，各種細(xì)菌及其高度 耐熱的枝孢被殺死。高壓滅菌后不變質(zhì)的物品如無菌水、栽培介質(zhì)、接種用具均可酌情延長(zhǎng) 滅菌時(shí)間或提高壓力，以達(dá)到良好的殺菌效果。但培養(yǎng)基一定要嚴(yán)格遵守保壓時(shí)間，既要保 壓徹底，又要防止培養(yǎng)基中的成分變質(zhì)或效力降低，不能隨意延長(zhǎng)時(shí)間。一般高壓滅菌維持 20 30min即可。2、外植體的處理及消毒小蓬竹外植體采用生長(zhǎng)健壯的半木質(zhì)化枝條，用洗潔精溶液完全浸泡30min，然后用自來水浸泡30min，流水沖洗至無泡沫產(chǎn)生，用濾紙吸干表面水分。在超凈工作臺(tái)上 把已沖洗干凈的外植體浸入75%酒精中消毒lmin，用無菌水沖洗3 4(期間不斷搖動(dòng)) 次后采用兩種消毒液之一 0. 升汞或2%次氯酸鈉溶液處理外植體。每種消毒液采用不 同消毒時(shí)間進(jìn)行處理①0. 升汞滅菌6分鐘；②0. 升汞滅菌8分鐘；③0. 升汞滅菌10分鐘； ④0. 升汞滅菌12分鐘；⑤2%次氯酸鈉滅菌6分鐘；⑥2%次氯酸鈉滅菌8分鐘；⑦2% 次氯酸鈉滅菌10分鐘；⑧2%次氯酸鈉滅菌12分鐘(期間不斷搖動(dòng))。然后用無菌水沖洗 5次(每次4分鐘，期間不斷搖動(dòng))，用無菌濾紙吸干表面水分。將消毒好的外植體剪取長(zhǎng) 約1.5cm帶芽的節(jié)枝，將外植體接種到培養(yǎng)基上，每種消毒處理接種10個(gè)，重復(fù)3次，成活 率取平均值。3、外植體的接種無菌操作實(shí)驗(yàn)室中使用的無菌操作設(shè)備是超凈工作臺(tái)。接種前應(yīng)進(jìn)行地面的清潔 衛(wèi)生工作，用75%乙醇噴霧噴灑接種室，擦拭超凈工作臺(tái)臺(tái)面，培養(yǎng)皿、酒精燈和其他工具 也要事先放在超凈工作臺(tái)上，一起用紫外燈照射20min。操作前要用酒精擦洗手，操作中要 經(jīng)常用酒精擦洗手。不準(zhǔn)講話，亦不準(zhǔn)對(duì)著操作區(qū)呼吸，以免口腔中所帶的微生物污染材 料、培養(yǎng)基和用具。操作中可采用250或500mL的廣口瓶，放入95%的酒精，以便對(duì)操作工 具進(jìn)行消毒。在無菌操作時(shí)，把鑷子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒 精燈火焰上灼燒滅菌。灼燒接種工具，待冷卻后在酒精燈附近打開培養(yǎng)基瓶口，立即將所取 的外植體迅速置入固體培養(yǎng)基中。在接種時(shí)，不能用生銹的解剖刀，動(dòng)作要敏捷，隨切隨接， 減少傷口在空氣中暴露的時(shí)間。蓋瓶蓋前應(yīng)將瓶口在火焰上燒一下，再將蓋子也在火焰上 燒一下，然后蓋上。每次重新操作都要把工具在火焰上消毒。4、培養(yǎng)條件人工培養(yǎng)環(huán)境主要與光照、溫度、滲透壓、酸堿度、通氣狀況等因子有著密切的關(guān) 系。人工培養(yǎng)環(huán)境是模擬植物的自然生長(zhǎng)環(huán)境，即光照、溫濕度和土壤。組織培養(yǎng)通常在散 射光線下進(jìn)行。將處理好的外植體材料接種到預(yù)備好的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為光照 強(qiáng)度1200Lx，每日光照12h，溫度25 27V。從接種完起每天觀察其生長(zhǎng)和污染情況，30 天后記錄結(jié)果，統(tǒng)計(jì)其污染數(shù)、成活數(shù)，進(jìn)行分析得出最佳方案。(三)觀察試驗(yàn)現(xiàn)象及結(jié)果分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1(外植體消毒處理方法及培養(yǎng)結(jié) 果)，由表1可以看出不同的消毒劑和消毒時(shí)間對(duì)外植體的污染率和成活率產(chǎn)生不同的影 響。升汞處理隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，污染率呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，處理12min時(shí)，污染率最低，成活率則 隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，處理IOmin時(shí)，成活率最高，繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間則成活率下降； 次氯酸鈉處理也隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，污染率下降，12min時(shí)污染率最低，成活率隨時(shí)間的延長(zhǎng) 升高，處理IOmin時(shí)，成活率最高。兩種消毒劑間比較，相同處理時(shí)間內(nèi)，升汞處理污染率比 次氯酸鈉處理低，且升汞處理成活率較次氯酸鈉處理成活率高，升汞的消毒效果總體好于 次氯酸鈉。綜合考慮如上試驗(yàn)結(jié)果可知，小蓬竹外植體適宜的消毒方法為上述8種處理中 的0. 升汞處理IOmin和0. 升汞處理12min，而0. 升汞處理IOmin不僅污染率較 低，而且成活率最高，因此，小蓬竹外植體最優(yōu)消毒方法為0. 升汞處理lOmin。表1外植體消毒處理方法及培養(yǎng)結(jié)果
權(quán)利要求
一種小蓬竹組織培養(yǎng)過程中外植體的消毒方法，其特征是消毒流程按下列步驟進(jìn)行，(1)將小蓬竹生長(zhǎng)健壯的半木質(zhì)化枝條作外植體，用1％洗潔精溶液完全浸泡30min，(2)用自來水浸泡30min；(3)用流水沖洗至無泡沫產(chǎn)生為止，用濾紙吸干表面水分；(4)在超凈工作臺(tái)上把已沖洗干凈的外植體浸入70 75％酒精中消毒1min；(5)用無菌水浸泡不斷搖動(dòng)沖洗3～4次；(6)最后侵入0.1％升汞或2％次氯酸鈉溶液滅菌6 12min，其間不斷搖動(dòng)；(7)然后用無菌水沖洗后，用無菌濾紙吸干表面水分，即可用于接種。
2.如權(quán)利要求1所述的消毒方法，其特征是步驟(5)酒精濃度為75%時(shí)，步驟(6)滅 菌處理用0. 升汞處理外植體IOmin。
3.如權(quán)利要求1所述的消毒方法，其特征是步驟(5)酒精濃度為75%時(shí)，步驟(6)滅 菌處理用2%次氯酸鈉處理外植體IOmin。
全文摘要
一種小蓬竹組織培養(yǎng)過程中外植體的消毒方法，(1)將小蓬竹生長(zhǎng)健壯的半木質(zhì)化枝條作外植體，用1％洗潔精溶液完全浸泡30min，(2)用自來水浸泡30min；(3)用流水沖洗至無泡沫產(chǎn)生為止，用濾紙吸干表面水分；(4)在超凈工作臺(tái)上把已沖洗干凈的外植體浸入70-75％酒精中消毒1min；(5)用無菌水浸泡不斷搖動(dòng)沖洗3～4次；(6)最后浸入0.1％升汞或2％次氯酸鈉溶液滅菌6-12min，其間不斷搖動(dòng)；(7)然后用無菌水沖洗后，用無菌濾紙吸干表面水分，即可用于接種。本發(fā)明填補(bǔ)了小蓬竹組織培養(yǎng)快速繁殖的空白，為小蓬竹的園林栽種、大面積綠化、喀斯特石漠化的恢復(fù)，奠定了迅速且充足供應(yīng)的基礎(chǔ)，為小蓬竹的工廠化大規(guī)模生產(chǎn)提供了可行的方案。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101933459SQ20101026879
公開日2011年1月5日 申請(qǐng)日期2010年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月1日
發(fā)明者何緒, 劉濟(jì)明, 孫運(yùn)剛, 廖小鋒, 張東凱, 徐國瑞, 徐雪嬌, 李敏進(jìn) 申請(qǐng)人:貴州大學(xué)