專利名稱：小蓬竹組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基組合物及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于竹類組織培養(yǎng)技術，具體地說是涉及一種小蓬竹組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基組 合物及其應用。
背景技術：
/jN^tt (Drepanostachyum Luodianense (Yi et R. S. Wang) Keng f. )
亞科鐮序竹屬竹種，又名“藤竹”，是中國特有種，在《中國物種紅色名錄》中被列為極危種。 目前只在貴州的羅甸、平塘及長順有栽培或有野生分布，常成片生長于海拔600 1000m的 石灰?guī)r裸露石山上。它的竹材柔韌可編涼椅和農(nóng)具，也可作為造紙原料；形態(tài)優(yōu)美，是良好 的園林綠化竹種，并在環(huán)境惡劣的喀斯特地區(qū)生長良好，能耐干旱和瘠薄，對增強土壤的固 土、保水、保肥能力效果十分顯著，是喀斯特地區(qū)的適生性物種，在喀斯特生態(tài)系統(tǒng)中對水 源涵養(yǎng)、水土保持、養(yǎng)分平衡等生態(tài)功能發(fā)揮著重要作用，具有很高的生態(tài)效益。竹類的生殖周期長，很少開花結實，難以獲得大規(guī)模繁殖的種子。而傳統(tǒng)的移竹、 埋鞭、竹枝扦插等繁殖方法存在消耗種竹多、種苗運輸不便、勞動強度大、繁殖系數(shù)低等問 題。采用組織培養(yǎng)的方法效率高，條件可控，生長快，周期短，重復性強，可進行周年試驗或 生產(chǎn)等優(yōu)點，可以快速繁殖苗，適合竹子的工廠化育苗。迄今為止，國內(nèi)外竹子組織培養(yǎng)工作取得了很大的進展，但還是存在著許多的問 題，培養(yǎng)基類型和植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的組合就是關鍵問題。培養(yǎng)基是組織培養(yǎng)中最重要的 基質(zhì)，選擇合適的培養(yǎng)基對培養(yǎng)成功與否關系很大。目前適合不同外植體組織培養(yǎng)的基礎 培養(yǎng)基多達數(shù)十種，人們針對不同外植體材料的生物學特性和培養(yǎng)目的，設計建立了各種 類型的培養(yǎng)基，目前常用的類型有MS、N6、sH、ws等培養(yǎng)基，這些培養(yǎng)基均是在植物組織培 養(yǎng)發(fā)展過程中，根據(jù)人們的認識和培養(yǎng)的需要，不斷改進產(chǎn)生的。大量研究表明，竹子組織 培養(yǎng)較為適用的培養(yǎng)基主要為MS培養(yǎng)基或改良MS培養(yǎng)基。植物生長調(diào)節(jié)劑對植物組織培 養(yǎng)的誘導與分化過程具有重要作用。用于組織培養(yǎng)誘導階段誘導與分化的植物生長調(diào)節(jié)物 質(zhì)通常為細胞分裂素和生長素，細胞分裂素促進細胞分裂與分化，延遲組織衰老，促進側芽 生長，常用的有6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)和KT(6-糠氨基嘌呤)；生長素主要誘導愈傷組織 的形成，體細胞胚的發(fā)生及試管苗的生根，常用的有2，4-D(2，4-二氯苯基乙酸)、NAA(萘 乙酸)和IBA(吲哚丁酸)等。同一種植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的不同濃度及不同植物生長調(diào)節(jié) 物質(zhì)間的配比對植物的誘導與分化會產(chǎn)生重要影響，提高細胞分裂素的濃度有利于芽的誘 導，提高生長素的濃度有利于組織和器官的生長。因此，探索細胞分裂素和生長素的優(yōu)選組 合，保證試管苗既有較高的增殖率又有較好的長勢，對于提高種苗質(zhì)量和實現(xiàn)工廠化生產(chǎn) 具有很重要的意義。目前國內(nèi)對小蓬竹研究最多的是小蓬竹的群落結構、多樣性、水土保持功能、土壤 種子庫、葉面積指數(shù)以及其栽培技術研究應用等領域，而在組織培養(yǎng)方面的研究還是空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種小蓬竹組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基組合物及其應 用，以克服小蓬竹繁殖困難，誘導難的問題。上述目的可通過如下措施實現(xiàn)本發(fā)明的小蓬竹組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基組合物，是由基本培養(yǎng)基MS、誘導培養(yǎng)基、瓊脂 和蔗糖配制而成，所指誘導培養(yǎng)基為細胞分裂素6-BA或6-BA與激動素KT的混合物，在每 升的MS基本培養(yǎng)基中含細胞分裂素6-BA l-5mg,或同時含細胞分裂素6_BA l_5mg與激動 素KT 0. 5mg,含瓊脂7g，含蔗糖30g ；培養(yǎng)基組合物溶液pH值5. 8。試驗證明，當所說培養(yǎng)基組合物在每升MS基本培養(yǎng)基中含細胞分裂素6-BA 3mg, 含瓊脂7g和含蔗糖30g ；培養(yǎng)基組合物溶液pH值5. 8時，小蓬竹組織培養(yǎng)的成活率最高。同樣試驗證明，當所說培養(yǎng)基組合物在每升MS基本培養(yǎng)基中含細胞分裂素6-BA 2mg和激動素KT 0. 5mg,含瓊脂7g和含蔗糖30g ；培養(yǎng)基組合物溶液pH值5. 8時，小蓬竹 組織培養(yǎng)的成活率也很好。將所述的培養(yǎng)基組合物用于小蓬竹的組織培養(yǎng)，培養(yǎng)條件溫度25 27°C，光照 時間12h/d，光照強度1200Lx。本發(fā)明的有益效果是解決了小蓬竹繁殖困難，克服了傳統(tǒng)的母竹移栽、竹鞭移栽 等繁殖方法耗費資源、對生境破壞大、培植時間長、效率低、運輸成本高等缺點，且不受季節(jié) 的限制，為小蓬竹大面積的推廣與利用，充分發(fā)揮其生態(tài)效益和經(jīng)濟效益提供了快速且充 足供應的有效途徑。本發(fā)明所述的“MS培養(yǎng)基”是指Murashige和Skoog研制的培養(yǎng)基，其成分配方見表1。本發(fā)明所述的“1/2MS培養(yǎng)基”和“1/4MS培養(yǎng)基”是指大量元素用量分別為MS培 養(yǎng)基中大量元素用量的1/2量和1/4量，其他成分用量與MS培養(yǎng)基相同。表IMS培養(yǎng)基成分 以下通過具體實施方式
來進一步說明本發(fā)明的有益效果。
具體實施例方式以下結合較佳實施例，對依據(jù)本發(fā)明提出的一種小蓬竹組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基組合物 的具體實施方式
、特征及其功效，詳細說明如后。一、試驗材料供試的材料采自從羅甸移栽于貴州大學苗圃、成活了的且生長健壯 的小蓬竹植株，外植體選用當年生枝芽飽滿的半木質(zhì)化枝條。二、試驗方法小蓬竹組織培養(yǎng)過程按以下步驟進行培養(yǎng)基的配制和滅菌，本發(fā)明試驗所用的 培養(yǎng)基為培養(yǎng)基組合物，是由基本培養(yǎng)基MS、誘導培養(yǎng)基、瓊脂和蔗糖配制而成，所指誘導 培養(yǎng)基為細胞分裂素6-BA或6-BA與激動素KT的混合物，在每升的MS基本培養(yǎng)基中含細 胞分裂素6-BA l_5mg，或同時含細胞分裂素6-BA l_5mg與激動素KT 0. 5mg，含瓊脂7g，含 蔗糖30g ；培養(yǎng)基組合物溶液pH值5. 8。本發(fā)明試驗所用的培養(yǎng)基以基礎培養(yǎng)基MS或1/2MS和1/4MS為參照對比試驗效 果，所述1/2MS和1/4MS是指MS中大量元素用量分別為MS基本培養(yǎng)基中大量元素的1/2量或1/4量，其他成分用量與MS相同。 本發(fā)明試驗所用的細胞分裂素6-BA，化學名稱6_芐氨基嘌呤，分子式為C12H11N5, 本發(fā)明試驗所用的激動素KT，化學名稱N6-呋喃甲氨基嘌呤，分子式=CltlH9ON5結構式 培養(yǎng)基組合物試驗共做10個，試驗序號分別為1-10，每個培養(yǎng)基組合物是在1升 的MS基本培養(yǎng)基溶液中加入不同量的6-BA，或不同量的6-BA和KT，在相同試驗條件下測 定外植體成活率，如表3，與相同條件試驗的基本培養(yǎng)基MS或1/2MS或1/4MS成活率結果如 表2比較。1、培養(yǎng)基配制后在24h內(nèi)必須進行滅菌，通常采用的滅菌方法為高壓滅菌法，其 原理是通過加熱，在密閉的高壓鍋內(nèi)隨著水蒸氣壓力的不斷上升，使水的沸點不斷提高，從 而鍋內(nèi)溫度也隨之升高。2、外植體的處理和消毒小蓬竹外植體采用生長健壯的半木質(zhì)化枝條，用洗潔精溶液浸泡30min，然后 用自來水浸泡30min，流水沖洗至無泡沫產(chǎn)生，用濾紙吸干表面水分。在超凈工作臺上把已 沖洗干凈的外植體浸入75%酒精中消毒lmin，用無菌水沖洗3 4(期間不斷搖動)次后， 采用0. 升汞溶液處理外植體10分鐘，無菌水沖洗5次，用無菌濾紙吸干表面水分，剪取 長約1. 5cm帶芽的節(jié)枝，將外植體接種到上述MS、1/2MS、1/4MS和試驗序號1_10培養(yǎng)基上。3、外植體接種無菌操作實驗室中使用的無菌操作設備是超凈工作臺。接種前應進行地面的清潔 衛(wèi)生工作，用75%乙醇噴霧噴灑接種室，擦拭超凈工作臺臺面，培養(yǎng)皿、酒精燈和其他工具 也要事先放在超凈工作臺上，一起用紫外燈照射20min。操作前要用酒精擦洗手，操作中要 經(jīng)常用酒精擦洗手。不準講話，亦不準對著操作區(qū)呼吸，以免口腔中所帶的微生物污染材 料、培養(yǎng)基和用具。操作中可采用250或500mL的廣口瓶，放入95%的酒精，以便對操作工 具進行消毒。在無菌操作時，把鑷子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒 精燈火焰上灼燒滅菌。灼燒接種工具，待冷卻后在酒精燈附近打開培養(yǎng)基瓶口，立即將所取 的外植體迅速置入固體培養(yǎng)基中。在接種時，不能用生銹的解剖刀，動作要敏捷，隨切隨接， 減少傷口在空氣中暴露的時間。蓋瓶蓋前應將瓶口在火焰上燒一下，再將蓋子也在火焰上 燒一下，然后蓋上。每次重新操作都要把工具在火焰上消毒。4、培養(yǎng)條件溫度25 27°C，光照時間12h/d，光照強度1200Lx。表2不同濃度基本培養(yǎng)基及培養(yǎng)結果 表3在一升基本培養(yǎng)基中加不同誘導培養(yǎng)基及培養(yǎng)結果 三、觀察試驗現(xiàn)象及結果分析小蓬竹外植體最優(yōu)消毒方法為0. 升汞處理lOmin。由表2可以看出，不同類型的誘導培養(yǎng)基本培養(yǎng)基對小蓬竹成活率的影響不同。 采用MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基時，芽的成活率可達到73. 0%;1/2MS培養(yǎng)基的成活率較低，為 27.0% ；1/4MS培養(yǎng)基的成活率最低，僅為23.0%。綜合以上數(shù)據(jù)可知，足夠的大量元素是 外植體誘導的保障，誘導小蓬竹外植體的最佳基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基。由表3可以看出，在一升MS培養(yǎng)基中不加入KT時，隨著6-BA濃度的升高，芽的 成活率增高，當6-BA濃度為3. Omg/L時，成活率最高，若6-BA濃度再升高，則成活率下降； 當在一升MS培養(yǎng)基中加入含量為0. 5mg/L的KT時，成活率在6-BA濃度為2. Omg/L時達 到最高，為89. 7 %，繼續(xù)提高6-BA濃度則成活率呈下降趨勢，說明KT對小蓬竹的誘導具 有促進作用，但促進效果沒有6-BA顯著。綜合考慮如上試驗結果可知，適宜小蓬竹誘導 的培養(yǎng)基為上述10種誘導培養(yǎng)基中的6-BA3. Omg/L和6-BA2. 0mg/L+KT0. 5mg/L,最佳為 MS+6-BA3. 0mg/L。以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，任 何未脫離本發(fā)明技術方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修 改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術方案的范圍內(nèi)。
權利要求
一種小蓬竹組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基組合物，其特征是是由基本培養(yǎng)基MS、誘導培養(yǎng)基、瓊脂和蔗糖配制而成，所指誘導培養(yǎng)基為細胞分裂素6 BA或6 BA與激動素KT的混合物，在每升的MS基本培養(yǎng)基中含細胞分裂素6 BA1 5mg，或同時含細胞分裂素6 BA 1 5mg與激動素KT 0.5mg，含瓊脂7g，含蔗糖30g；培養(yǎng)基組合物溶液pH值5.8。
2.如權利要求1所述的培養(yǎng)基組合物，其特征是所說培養(yǎng)基組合物在每升MS基本培 養(yǎng)基中含細胞分裂素6-BA 3mg,含瓊脂7g和含蔗糖30g ；培養(yǎng)基組合物溶液pH值5. 8。
3.如權利要求1所述的培養(yǎng)基組合物，其特征在于所說培養(yǎng)基組合物在每升MS基本 培養(yǎng)基中含細胞分裂素6-BA 2mg和激動素KTO. 5mg,含瓊脂7g和含蔗糖30g ；培養(yǎng)基組合 物溶液pH值5. 8。
4.如權利要求1所述的培養(yǎng)基組合物的應用，其特征在于將所述的培養(yǎng)基組合物用 于小蓬竹的組織培養(yǎng)，培養(yǎng)條件溫度25 27°C，光照時間12h/d，光照強度1200Lx。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種小蓬竹組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基組合物及其應用，是由基本培養(yǎng)基MS、誘導培養(yǎng)基、瓊脂和蔗糖配制而成，所指誘導培養(yǎng)基為細胞分裂素6-BA或6-BA與激動素KT的混合物，在每升的MS基本培養(yǎng)基中含細胞分裂素6-BA 1-5mg，或同時含細胞分裂素6-BA 1-5mg與激動素KT0.5mg，含瓊脂7g，含蔗糖30g；培養(yǎng)基組合物溶液pH值5.8；用于小蓬竹的組織培養(yǎng)，培養(yǎng)條件溫度25～27℃，光照時間12h/d，光照強度1200Lx。本發(fā)明填補了小蓬竹組織培養(yǎng)快速繁殖的空白，為小蓬竹的園林栽種、大面積綠化、喀斯特石漠化的恢復，奠定了迅速且充足供應的基礎，為小蓬竹的工廠化大規(guī)模生產(chǎn)提供了可行的方案。
文檔編號A01H4/00GK101926286SQ20101026879
公開日2010年12月29日 申請日期2010年9月1日 優(yōu)先權日2010年9月1日
發(fā)明者何緒, 劉濟明, 孫運剛, 廖小鋒, 張東凱, 徐國瑞, 徐雪嬌, 李敏進 申請人:貴州大學