專利名稱：紫花苜蓿高效組織培養(yǎng)再生的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種紫花苜蓿高效組織培養(yǎng)再生方法，尤其是涉及一種通過添加TDZ 和連續(xù)繼代實現(xiàn)紫花苜蓿植株高效再生的培養(yǎng)方法，屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
紫花苜蓿(Medicago sativa L.)為多年生豆科植物，是世界上重要的栽培牧草， 在我國已有兩千多年的栽培歷史，其營養(yǎng)價值被列在各種牧草的首位，有“牧草之王”的美 譽，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中占有重要的地位。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，利用基因工程培育和改良植物品種成為便捷和實用的手 段。轉(zhuǎn)基因技術(shù)通過引入少量有用基因取代了傳統(tǒng)育種中大量基因的介入，減少了無用基 因?qū)π誀罡牧嫉牟涣加绊?，從而可以快速實現(xiàn)育種目標(biāo)。因此，通過轉(zhuǎn)基因手段將優(yōu)良基因 轉(zhuǎn)移到栽培品種中，可以加速培育新品種。而轉(zhuǎn)基因的前提就是要建立高效組培再生體系。 苜蓿組織培養(yǎng)最早見于Saunders等的報道，通過器官形成和體胚愈傷組織發(fā)育2條途徑， 最終分化成完整的植株，這標(biāo)志著苜蓿組織培養(yǎng)研究的開始。盡管國內(nèi)外對苜蓿離體再生 體系的研究已經(jīng)比較深入，但是再生頻率低、受基因型影響大、再生周期長等問題目前仍有 待于進(jìn)一步研究解決。利用現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行紫花苜蓿組織培養(yǎng)，其愈傷組織易褐化、再生率低，針對其不 足，

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種通過添加TDZ和連續(xù)繼代實現(xiàn)紫花苜蓿高效組織培 養(yǎng)再生的方法。本發(fā)明的目的由如下技術(shù)方案實施紫花苜蓿高效組織培養(yǎng)再生的方法，其依次 包括有如下步驟(1)無菌苗的培養(yǎng)；(2)將紫花苜蓿無菌苗葉片接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中 培養(yǎng)；(3)將愈傷組織轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基1中進(jìn)行培養(yǎng)；(5)挑選生長狀態(tài)好的愈傷組織轉(zhuǎn) 入分化培養(yǎng)基中進(jìn)行分化培養(yǎng)；(6)待分化出苗后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)；在所 述步驟(3)和步驟(5)之間增加步驟(4)，其中步驟(4)是將步驟(3)經(jīng)愈傷組織轉(zhuǎn)入繼 代培養(yǎng)基1中進(jìn)行培養(yǎng)后，即將要長出綠色芽點的愈傷組織轉(zhuǎn)入愈傷組織繼代培養(yǎng)基2中 進(jìn)行繼代培養(yǎng)5-8天；其中所述愈傷組織繼代培養(yǎng)基2 :MS+0. 01-0. 5mg/LTDZ+20g/L蔗糖 +7. 5g/L 瓊脂，PH 值5. 8-6.0。術(shù)語解釋TDZ為新型植物生長調(diào)節(jié)劑，TDZ (N-苯基-N' -1,2, 3~噻二唑_5_脲)能夠誘導(dǎo) 外植體從愈傷組織形成到體細(xì)胞胚胎發(fā)生的一系列不同反應(yīng)，具有植物細(xì)胞生長素和植物 細(xì)胞分裂素的雙重功效作用的特殊功能，在組織培養(yǎng)中TDZ通過單獨或與其它生長調(diào)節(jié)物 質(zhì)共同對植物細(xì)胞起作用。本發(fā)明的優(yōu)點在于本發(fā)明通過添加合適劑量的TDZ和連續(xù)繼代實現(xiàn)了紫花苜蓿組織培養(yǎng)中植株的高效再生，應(yīng)用本發(fā)明方法可以提高紫花苜蓿愈傷組織分化率，比現(xiàn)有 技術(shù)的分化率平均高出12.3%。該方法操作簡單、植株再生成功率高。本發(fā)明為進(jìn)一步利 用基因工程對其進(jìn)行遺傳改良奠定了基礎(chǔ)。


圖1為紫花苜蓿高效組織培養(yǎng)再生的方法的工藝流程圖。
具體實施例方式實施例1 紫花苜蓿高效組織培養(yǎng)再生的方法，其依次包括有如下步驟(1)無菌苗的培養(yǎng)；選擇飽滿、種皮完整無破損的優(yōu)良紫花苜蓿種子，自來水沖 洗種子30miη，70 %的酒精消毒Imin，無菌水漂洗30S，然后轉(zhuǎn)入20 %的次氯酸鈉中消 毒20min，再用無菌水沖洗5次，用滅菌濾紙吸干種子表面的液體后接種到用于無菌苗培 養(yǎng)的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至長出無菌苗。培養(yǎng)條件為溫度25°C，光照時間16h/d，光照強(qiáng)度 1000-2000Lux ；無菌苗培養(yǎng)基為大量元素減半的MS (配方見附表1)(簡稱1/2MS)培養(yǎng)基 +20g/L 蔗糖 +7. 5g/L 瓊脂。(2)將紫花苜蓿無菌苗葉片接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)將無菌苗的葉片從中 脈剪開，接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)20-30d。培養(yǎng)條件為溫度25°C，光照時間 16h/d，光照強(qiáng)度1000-2000Lux ；誘導(dǎo)培養(yǎng)基為SH(配方見附表2)+4. Omg/L 2,4-D+O. 5mg/ L6-BA+20g/L 蔗糖 +7. 5g/L 瓊脂。(3)將愈傷組織轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基1中進(jìn)行培養(yǎng)；愈傷組織產(chǎn)生后轉(zhuǎn)移到繼代 培養(yǎng)基1中進(jìn)行繼代培養(yǎng)20-30d。培養(yǎng)條件為溫度25°C，光照時間16h/d，光照強(qiáng)度 1000-2000Lux ；繼代培養(yǎng)基 1 為MS0 (配方見附表 3)+0. 5mg/LNAA+0. 5mg/L 6-BA+l. Omg/ LAgN03+20g/L 蔗糖 +7. 5g/L 瓊脂。(4)將要長出綠色芽點的愈傷組織轉(zhuǎn)入愈傷組織繼代培養(yǎng)基2中進(jìn)行繼代培養(yǎng) 5-8天；培養(yǎng)條件為溫度25°C，光照時間16h/d，光照強(qiáng)度1000-2000LUX ；其中愈傷組織繼 代培養(yǎng)基 2 :MS+0. 01mg/LTDZ+20g/L 蔗糖 +7. 5g/L 瓊脂，PH 值5. 8-6. O ；(5)挑選生長狀態(tài)好的愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中進(jìn)行分化培養(yǎng)將繼代培養(yǎng)II 后的愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，直至分化出苗，每15d繼代一次。培養(yǎng)條件為溫 度25°C，光照時間16h/d，光照強(qiáng)度1000-2000LUX ；分化培養(yǎng)基為MS+20g/L蔗糖+7. 5g/L 瓊脂。(6)待分化出苗后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)待小苗長至3_5cm時轉(zhuǎn)入生 根培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度25°C，光照時間16h/d，光照強(qiáng)度1000-2000LUX ；生根 培養(yǎng)基為l/2MS+20g/L蔗糖+7. 5g/L瓊脂。其中附表1MS基本培養(yǎng)基成分
組分成分含量(mg/L)大量元素硝酸鉀1900硝酸銨1650七水合硫酸鎂370二水合氯化鈣440磷酸二氫鉀170微量元素四水合硫酸錳22.3七水合硫酸鋅8.6硼酸6.2碘化鉀0.83二水合鉬酸鈉0.25五水合硫酸銅0.025六水合氯化鈷0.025有機(jī)元素肌醇100甘氨酸2.0鹽酸吡哆醇0.5鹽酸硫胺素0.1煙酸0.5鐵鹽乙二胺四乙酸二鈉37.3七水合硫酸亞鐵27.8附表2SH基本培養(yǎng)基成分
權(quán)利要求
紫花苜蓿高效組織培養(yǎng)再生的方法，其依次包括有如下步驟(1)無菌苗的培養(yǎng)；(2)將紫花苜蓿無菌苗葉片接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)；(3)將愈傷組織轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基1中進(jìn)行培養(yǎng)；(5)挑選生長狀態(tài)好的愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中進(jìn)行分化培養(yǎng)；(6)待分化出苗后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)；其特征在于在所述步驟(3)和步驟(5)之間增加步驟(4)，其中步驟(4)是將步驟(3)經(jīng)愈傷組織轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基1中進(jìn)行培養(yǎng)后，即將要長出綠色芽點的愈傷組織轉(zhuǎn)入愈傷組織繼代培養(yǎng)基2中進(jìn)行繼代培養(yǎng)5 8天；其中所述愈傷組織繼代培養(yǎng)基2MS+0.01 0.5mg/LTDZ+20g/L蔗糖+7.5g/L瓊脂，PH值5.8 6.0。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種紫花苜蓿高效組織培養(yǎng)再生方法，其依次包括有如下步驟(1)無菌苗的培養(yǎng)；(2)將紫花苜蓿無菌苗葉片接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)；(3)將愈傷組織轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基1中進(jìn)行培養(yǎng)；(4)將要長出綠色芽點的愈傷組織轉(zhuǎn)入愈傷組織繼代培養(yǎng)基2中進(jìn)行繼代培養(yǎng)(5)挑選生長狀態(tài)好的愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中進(jìn)行分化培養(yǎng)；(6)待分化出苗后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。本發(fā)明的優(yōu)點在于本發(fā)明通過添加合適劑量的TDZ和連續(xù)繼代實現(xiàn)了紫花苜蓿組織培養(yǎng)中植株的高效再生，應(yīng)用本發(fā)明方法可以提高紫花苜蓿愈傷組織分化率，比現(xiàn)有技術(shù)的分化率平均高出12.3％。該方法操作簡單、植株再生成功率高。本發(fā)明為進(jìn)一步利用基因工程對其進(jìn)行遺傳改良奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號A01H4/00GK101946711SQ201010270899
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月28日
發(fā)明者徐春波, 李興酉, 王勇, 趙來喜, 趙海霞 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所