專利名稱：一種節(jié)能型海參養(yǎng)殖方法
一種節(jié)能型海參養(yǎng)殖方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于海參類養(yǎng)殖技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種提高海參免疫力，促進海參快速 生長，改善水質(zhì)，節(jié)水節(jié)能，綠色低碳的海參無公害養(yǎng)殖方法。
背景技術(shù)：
全世界海參約有1200多種，均為海洋種類，可供食用的有40余種。我國有海參 140種，約20余種可以食用。海參的蛋白含量高，且不含糖類和膽固醇，營養(yǎng)價值極高。此 外，海參藥性甘溫，有“補腎經(jīng)，益精髓，消痰涎，壯陽療痿”之功效，有“海中人參”之美譽， 具有獨特的藥用價值。隨著人們生活水平的提高以及醫(yī)療保健意識的增強，海參消費逐漸 升溫，其價格也不斷上漲，海參的人工養(yǎng)殖在我國北方沿海已經(jīng)形成繼海帶、對蝦、扇貝、海 水魚之后又一次新的海水養(yǎng)殖浪潮。
隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)集約化程度的不斷加深，加上缺乏科學(xué)的的管理和規(guī)范化的操 作，養(yǎng)殖方法落后，導(dǎo)致暴發(fā)性病害頻繁發(fā)生，出現(xiàn)了多種明顯病癥和大規(guī)模死亡現(xiàn)象，嚴(yán) 重制約了海參養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的持續(xù)、穩(wěn)定、健康發(fā)展。
多年來，人們主要采用抗生素對其病癥進行預(yù)防和治療，但抗生素的大量使用會 造成耐藥性的產(chǎn)生，使疾病的治愈難度越來越大。同時，也可能產(chǎn)生藥物殘留影響產(chǎn)品質(zhì)量 和人類的健康。其它化學(xué)類消毒劑的使用也會嚴(yán)重污染水質(zhì)，破壞環(huán)境。
中草藥雖然能夠具有無藥物殘留、經(jīng)濟效益高的優(yōu)點，但見效慢較慢，短期內(nèi)解決 不了流行性疾病。
另一方面，目前海參的養(yǎng)殖模式需要大量的換水和頻繁的倒池，不僅浪費了人力 物力資源，而且大量的用水容易引起海岸帶海水入侵，導(dǎo)致土地鹽堿化，給生態(tài)環(huán)境造成了 危害。按照常用的方法對廢水進行處理循環(huán)使用，則需要較高的投資，增加了養(yǎng)殖成本。
因而尋求一種更高效、更經(jīng)濟的辦法來提高海參的成活率和免疫力，顯得極為迫 切?！熬G色養(yǎng)殖”不但克服了抗生素濫用帶了的副作用，還能夠改善水質(zhì)，增強苗種免疫力， 提高海參的成活率和質(zhì)量，成為近年來國家的重大需求，引起水產(chǎn)界的廣泛關(guān)注。目前，用 游泳體和蛭弧菌游泳體和蛭質(zhì)體的混合菌液來進行海參養(yǎng)殖的方式在國內(nèi)外尚未見報道。
已有的研究表明，作為一種有益微生物制劑，無論是在食品工業(yè)還是在(海洋) 水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域，蛭弧菌的應(yīng)用均是安全的。例如在國外，Lenz and Hespell (1978) 研究發(fā)現(xiàn)，蛭弧菌及對動物及人的細(xì)胞不具侵染性[Lenz R. W. , Hespell R. B. Attempts to grow bedellovibrios micurgically-injected into animal cells. Archives of Microbiology, 1978,119(3) :245-248]。在國內(nèi)，林茂等(2006)研究了蛭弧菌對魚類細(xì) 胞的作用，發(fā)現(xiàn)它對魚類細(xì)菌沒有侵染作用[林茂，楊先樂，薛暉，曹海鵬，邱軍強。蛭弧菌 BDH2102對魚類細(xì)胞及病原菌的作用。微生物學(xué)通報，2006，33(1) :7_11]。發(fā)明內(nèi)容
為克服上述現(xiàn)有養(yǎng)殖技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種節(jié)能型海參(Apostichopus japonicus)養(yǎng)殖方法；該方法通過在飼料和水體中添加蛭弧菌游泳體和 蛭質(zhì)體的混合菌液實現(xiàn)，具體包括養(yǎng)殖水源選擇，池水的處理，飼料的處理，換水周期的控 制，其特征按照養(yǎng)殖生態(tài)學(xué)原理，海洋生物的生長環(huán)境要求，生物之間的相互關(guān)系及無公害 養(yǎng)殖標(biāo)準(zhǔn)，人工創(chuàng)造養(yǎng)殖環(huán)境，減少投入成本，改善水質(zhì)，提高海參免疫力，促進海參快速生 長，提高經(jīng)濟效益。
本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案來實現(xiàn)一種節(jié)能型海參養(yǎng)殖方法，包括以下操 作步驟
(1)取海域無污染的深海水作為養(yǎng)殖用水；養(yǎng)殖用水經(jīng)砂濾、沉淀和消毒后，注入 養(yǎng)殖池；養(yǎng)殖池中放置經(jīng)過消毒的波紋板(用于海參的附著生長)；
(2)在養(yǎng)殖池中加入蛭弧菌游泳體和蛭質(zhì)體的混合體菌液，并加大曝氣，攪拌均 勻，使池水中的蛭弧菌游泳體和蛭質(zhì)體的混合體菌液的濃度達(dá)10 107pfu/mL ；
(3)向養(yǎng)殖池中投放海參苗；
(4)養(yǎng)殖期間正常曝氣，控制水溫在15 30°C，池水的鹽度保持在23%。 30%。， 日投餌量為海參體重的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)3 5%，餌料在投入前，用濃度為10 l(fpfu/mL的蛭 弧菌游泳體和蛭質(zhì)體的混合體菌液浸泡15 30min ；每隔5 40天換掉池水(全池)一 次，每次換(全池)水后加入蛭弧菌游泳體和蛭質(zhì)體的混合體菌液，使池水中的蛭弧菌游泳 體和蛭質(zhì)體的混合體濃度達(dá)到10 107pfu/mL。
步驟(1)所述養(yǎng)殖池在注入養(yǎng)殖用水之前清洗消毒干凈；所述養(yǎng)殖池中3m2 4m2 布置1個散氣石(用于充氣)。
步驟( 和(4)所述加入蛭弧菌游泳體和蛭質(zhì)體的混合體菌液的方法為用養(yǎng)殖 池中的池水稀釋菌液后，均勻潑灑全池。
步驟(2)所述加大曝氣的曝氣量為90 100L/h/m3 ；步驟(4)所述正常曝氣的曝 氣量為70 80L/h/m3。
步驟C3)所述投放海參苗在水溫15 30°C時按照以下標(biāo)準(zhǔn)海參苗規(guī)格為400頭 /kg時，投放密度為600頭/m2 ；海參苗規(guī)格為200頭/kg時，投放密度為400尾/m2 ；海參苗 規(guī)格為100頭/kg時，投放密度為300尾/m2。
步驟(4)所述餌料為配合餌料，每天投餌兩次；每隔5 7天，采用虹吸法進行養(yǎng) 殖池底的吸污。
步驟(2)和(4)所述蛭弧菌為蛭弧菌(Bdellovibrio sp. Mrain) BDMOl，所述蛭 弧菌于2008年4月觀日保藏于湖北省武漢市珞珈山武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中 心，保藏編號為CCTCC NO =M 208066。BDMOl由蛭弧菌BDJOl (保藏編號為CCTCC M 208011) 進行紫外誘變得到，對其進行負(fù)染后于電子顯微鏡下形態(tài)觀察蛭弧菌BDMOl呈單細(xì)胞，弧 形，大小為1. 7X 1. 0 μ m，端生鞭毛，鞭毛長度為3. 5 μ m ；將其以雙層平板法于培養(yǎng)三 天可形成直徑3-4mm的透明圓形噬菌斑。
步驟( 和(4)所述混合體菌液為蛭弧菌游泳體菌液和蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液按細(xì)菌 個數(shù)1 1混合而成。
所述蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液按照以下方法制備得到接種0. 5mL濃度為107cfu/mL嗜 水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila，購于廣東省微生物所菌種保藏中心，編號GIM1. 172) 于營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，26 30°C培養(yǎng)20h，培養(yǎng)液經(jīng)5000 8000rpm離心10 20min5后，沉淀用ImL生理鹽水懸浮后，加入至DNB液體培養(yǎng)基中，再接入ImL含103pfu/mL蛭弧 菌BDMOl的菌液，于25 ;35°C、150 300rpm培養(yǎng)36 48h，培養(yǎng)液在4°C下經(jīng)6000 SOOOrpm離心15 20min后，去除含蛭弧菌游泳體的上清液，沉淀用DNB液體培養(yǎng)基、水、生 理鹽水或0. 2mol/L pH值為7. 2 7. 6的磷酸鹽緩沖液懸浮，得到濃度為109pfu/mL的蛭 弧菌蛭質(zhì)體菌液；
所述蛭弧菌游泳體菌液按照以下方法制備得到將蛭弧菌蛭質(zhì)體制備方法中的含 蛭弧菌游泳體的上清經(jīng)16000 18000rpm離心15 20min后，沉淀用DNB液體培養(yǎng)基、 水、生理鹽水或0. 2mol/L pH值為7. 2 7. 6的磷酸鹽緩沖液懸浮，得到濃度為109pfu/mL 的蛭弧菌游泳體菌液。
所述DNB液體培養(yǎng)基是將營養(yǎng)肉湯0. Sg、酪蛋白酸水解物0. 5g和酵母精提物 0. Ig溶于IOOOml蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值至7. 2 7. 6。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果
(1)蛭弧菌的生活史可分為脫離宿主細(xì)菌、具有鞭毛、自由游泳的游泳體狀態(tài)和在 宿主細(xì)菌內(nèi)生長發(fā)育的蛭質(zhì)體狀態(tài)。蛭弧菌游泳體侵入宿主時，在宿主細(xì)胞壁上產(chǎn)生一個 孔隙，當(dāng)蛭弧菌侵入到宿主的周質(zhì)空間后孔隙重新封閉。游泳體失去鞭毛，和宿主細(xì)胞一起 被稱為“蛭質(zhì)體”。接下來，宿主周質(zhì)空間水解，蛭弧菌細(xì)胞變長，并分裂成多個短節(jié)段，長出 鞭毛，通過釋放溶解性酶從宿主細(xì)胞中脫離出來，重新形成游泳體。
與游泳體相比，蛭質(zhì)體不僅具有制備、保存更為方便，環(huán)境耐受力強，作用時間雖 略慢但更久的特點，同時還具有潛在的滅活疫苗功能。當(dāng)游泳體蛭弧菌入侵宿主細(xì)胞后，宿 主細(xì)胞的呼吸作用(respiration)很快被停止。蛭弧菌也進入蛭質(zhì)體狀態(tài)，開始分泌多種 酶，消解宿主細(xì)胞的大分子為小分子物質(zhì)，進而整合為自身的營養(yǎng)物質(zhì)，使自身生長，變長。 最終，長條狀的蛭質(zhì)體分成很多短的節(jié)段，長出鞭毛，重新成為游泳體。之后，它們分泌必需 的酶類，破壁而出，再次成為脫離宿主細(xì)菌、具有鞭毛、自由游泳的游泳體。在此蛭質(zhì)體發(fā)育 期間，蛭弧菌并不改變宿主細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)，使原宿主仍具有抗原作用，可刺激生物體，產(chǎn) 生免疫應(yīng)答反應(yīng)。這一潛在功能使得應(yīng)用蛭質(zhì)體蛭弧菌于海參養(yǎng)殖中，可有效預(yù)防參苗細(xì) 菌病的產(chǎn)生，提高養(yǎng)殖成活率等。
本發(fā)明所述蛭弧菌游泳體和蛭質(zhì)體蛭弧菌的混合菌液兼具有游泳體和蛭質(zhì)體的 共同優(yōu)點，能起到滅活的疫苗的作用，效果更佳。
(2)本發(fā)明采用營養(yǎng)配制、蛭弧菌混合菌液預(yù)防和調(diào)節(jié)、環(huán)境和飼料調(diào)控相結(jié)合 的方案，達(dá)到了提高海參的成活率和免疫力，促進海參的攝食和快速生長，改善水質(zhì)，降低 生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟效益的效果。
(3)本發(fā)明所述蛭弧菌游泳體和蛭質(zhì)體的混合菌液能裂解大多數(shù)的水產(chǎn)致病菌或 者潛在的致病菌，用蛭弧菌混合菌液浸泡飼料，并在池水中潑灑一定濃度的蛭弧菌混合菌 液，既能促進海參的生長，提高免疫力，又能凈化水質(zhì)，最長可達(dá)到40天不換水。從而克服 了抗生素濫用帶來的副作用和對養(yǎng)殖廢水進行處理的高成本，為人類提供安全、綠色、無公 害的水產(chǎn)品，提高養(yǎng)殖戶的收入。
(4)本發(fā)明所述蛭弧菌游泳體和蛭質(zhì)體混合菌液在海參的應(yīng)用中安全性好；蛭弧 菌通過裂解而消除致病菌的方法是生物方法，綠色、安全、無污染。蛭弧菌可侵染、裂解宿主 細(xì)菌的特性使之適合作為抑止或清除生物體及其環(huán)境中致病菌的生物凈化因子，且其在裂解完宿主菌后，會因饑餓而自動消亡，現(xiàn)有的研究表明蛭弧菌對棘皮動物類無毒性作用，對 人類無致病性。
(5)本發(fā)明所述蛭弧菌游泳體和蛭質(zhì)體混合體在海參的應(yīng)用中作用效果好，且應(yīng) 用廣泛，可推廣到其他產(chǎn)業(yè)；用蛭弧菌來促進海參的生長是一種有發(fā)展前景的養(yǎng)殖新方法。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
本發(fā)明的具體實施地點為山東某海參養(yǎng)殖場，海參種類為仿刺參(Apostichopus japonicus) 0實施時間為4個月。試驗地海域的水源水質(zhì)符合中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)漁 業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(GB11607-89)要求，海水經(jīng)過砂濾、沉淀處理后進入養(yǎng)殖池，符合農(nóng)業(yè)部《無公 害食品海水養(yǎng)殖用水水質(zhì)》(NY5052-2001)要求。海參的養(yǎng)殖池建在養(yǎng)殖大棚內(nèi)，挑選體質(zhì) 健康、個體大小均勻的幼參，平均體長4 6cm，采用隨機區(qū)組試驗設(shè)計，按照55 70頭/ m2的養(yǎng)殖密度投入池中。
平均分為A-D 4個試驗組，B、C、D每個試驗組有8個小組，分別為Bi、Cl、Dl ；B2、 C2、D2 ；、B3、C3、D3 ；B4、C4、D4 ；B5、C5、D5 ；B6、C6、D6 ；B7、C7、D7 ；B8、C8、B8 ；B1-D8 每小組 再分為4組，即Bl-I B1-4…D8-1 D8-4，每組2個重復(fù)。試驗的處理如下
A組正常流水，投喂配合飼料飼料(工廠生產(chǎn)的養(yǎng)殖方式)；
B組在水中潑灑蛭弧菌游泳體和蛭質(zhì)體的混合菌液，使水體中蛭弧菌游泳體和 蛭質(zhì)體混合菌液濃度分別達(dá)到10、103、105、107pfu/mL，投喂配合飼料；
C組投喂?jié)舛葹?0、ΙΟ3、105、107pfu/mL的蛭弧菌游泳體和蛭質(zhì)體混合菌液浸泡 后的配合飼料；
D組在水中加入蛭弧菌游泳體和蛭質(zhì)體混合菌液，使菌體濃度分別達(dá)到10、103、 105U07pfu/mL,同時分別投喂?jié)舛葹?0、103、105、l(fpfu/mL的蛭弧菌游泳體和蛭質(zhì)體混合 菌液浸泡后的配合飼料；
Bi、Cl、Dl組每5天換(全池)水一次，換水后重新加菌；
B2、C2、D2組每10天換(全池)水一次，換水后重新加菌；
B3、C3、D3組每15天換(全池)水一次，換水后重新加菌；
B4、C4、D4組每20天換(全池)水一次，換水后重新加菌；
B5、C5、D5組每25天換(全池)水一次，換水后重新加菌；
B6、C6、D6組每30天換(全池)水一次，換水后重新加菌；
B7、C7、D7組每35天換(全池)水一次，換水后重新加菌；
B8、C8、D8組每40天換(全池)水一次，換水后重新加菌；
B1-1、α-1、01-Ρ..08_1 投放的菌液濃度為 10pfu/mL ；
Bl-2、Cl-2、D1-2…D8-2 投放的菌液濃度為 103pfu/mL ；
B 1-3、Cl-3、D1-3…D8-3 投放的菌液濃度為 105pfu/mL ；
B 1-4、C1-4、D1-4...D8_4 投放的菌液濃度為 l(fpfu/mL ；
所用飼料符合中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《無公害食品漁用配合飼料安全限 量》(NY5072-2002)的規(guī)定。試驗期間，每日投喂2次，早、晚各一次。試驗結(jié)束測量海參的 生長指標(biāo)、免疫指標(biāo)及微生物情況。
1、海參生長指標(biāo)的測定方法如下
歷經(jīng)4個月后，統(tǒng)計最終每口池子所存活的海參數(shù)目，分別從每口池子各隨機抽 取100頭海參，用游標(biāo)卡尺測量其體長(mm)，電子天平測其重量(g)，計算以下參數(shù)
(1)成活率(% ) = Nt/NoX100% ；
(2)增重率(% ) = (Wt-W0)/W0X 100% ；
(3)體長增長率(％ ) = (Lt-L0)/L0X 100% ；
式中N。為試驗開始時海參總頭數(shù)；Nt為試驗結(jié)束時海參總頭數(shù)；W。為試驗開始時 海參體重；Wt為試驗結(jié)束時海參體重；L。為試驗開始時海參體長；Lt為試驗結(jié)束時海參體 長；
2、海參的免疫指標(biāo)的測定
(1)堿性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)活性均采用Kruzel (1982)的磷酸苯二 鈉法
從海參的腹面口后1/3穿刺抽取血液，置于離心管中，于4°C，3000r/min離心 lOmin，取上清，即為海參的血清。置于冰盒中保存。
酸性磷酸酶(ACP)的測定采用磷酸苯二鈉法。以每IOOmL血清在37°C與底物磷酸 苯二鈉作用60min，產(chǎn)生Img酚者定義為一個酶活力單位。
堿性磷酸酶(AKP)的測定采用磷酸苯二鈉法。以每IOOmL血清在37°C與底物磷酸 苯二鈉作用15min，產(chǎn)生Img酚者定義為一個酶活力單位。
(2)感染試驗于預(yù)先消毒的盛有1噸砂濾海水(鹽度四 30%。)的水池中進 行。從實驗A組、Bl-U B1-2-D8-3, D8-4共97組中每個組隨機取海參100頭，體長為 10 士 lcm。用無菌注射器經(jīng)海參腹腔注射300uL濃度為108cfu/mL嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila，購于廣東省微生物所菌種保藏中心，編號GIM1. 172)，對海參進行感染。試驗 水溫保持在15 30°C，流水養(yǎng)殖，充氣培養(yǎng)。人工感染后，記錄海參的運動、攝食及死亡情 況。連續(xù)觀察10天，最終計算成活率，采用相對存活率(Relative Percentage Survival, RPS)計算式
RPS (% ) = (1-免疫組死亡率/對照組死亡率)X 100%
3、水質(zhì)的測定
氨態(tài)氮用次溴酸納氧化法測定(GB12763. 4-91)；
亞硝酸鹽氮用重氮-偶氮光度法測定(GB12763. 4-91)
4、弧菌總數(shù)的測定
用TCBS培養(yǎng)基檢測弧菌總數(shù)
具體步驟為用磷酸緩沖鹽(PBS)對所取水樣樣品進行10稀釋，至10_4。取原液 和各濃度的稀釋液(10人10_2、10_3、IO-4) 0. 5mL,涂布于TCBS固體培養(yǎng)基上，菌落計數(shù)，計算 水中的弧菌總數(shù)。
海參的生長指標(biāo)、免疫活性指標(biāo)及水質(zhì)情況的測定結(jié)果見表一 表四
從表中可以看出，A組成活率、增重率、體長增長率、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷 酸酶(AKP)分別為 83. 25 %,843. 78 %,282. 89 %,0. 033U/mL、0. 037U/mL,弧菌總數(shù)為 5. 90X 102CFU/mL。與A組相比，C、D、E組的成活率、增重率、體長增長率、酸性磷酸酶(ACP)、 堿性磷酸酶(AKP)都明顯升高，而弧菌總數(shù)明顯降低。說明在常規(guī)的養(yǎng)殖方式下，不換水會影響海參的成活率、增重率、體長增長率、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活力。在相同的換水周 期下，隨著蛭弧菌混合菌液的濃度升高，成活率、增重率、體長增長率、酸性磷酸酶和堿性磷 酸酶活力在逐漸的升高，弧菌總數(shù)明顯降低；說明蛭弧菌蛭質(zhì)體的濃度越高，海參的免疫力 越強，成活率越高，患病機率越小。Bl-I B8-1…D1-4 D8-4之間的成活率、增重率、體 長增長率、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、弧菌總數(shù)幾乎無明顯差異，
說明在水中或者是在飼料中添加濃度為10 l(fpfu/mL蛭弧菌游泳體和蛭質(zhì)體 混合菌液，5-40天換(全池)水一次，對海參的育苗成活率、增重率、體長增長率、酸性磷酸 酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、弧菌總數(shù)影響不大，均可達(dá)到提高成活率和免疫力，促進生長 的目的。
感染實驗的結(jié)果顯示，A組的相對存活率(Relative Percentage Survival, RPS) 為0，與A組相比，B、C、D組的相對存活率均有明顯提高，從表五可以看出，在相同的換水周 期下，隨著蛭弧菌混合菌液濃度的升高，相對存活率逐漸升高，且都明顯高于工廠生產(chǎn)的A 組，說明采用新型的添加蛭弧菌混合菌液的養(yǎng)殖方法，能明顯提高海參的相對存活率，即提 高海參的免疫抵抗力；從不同換水周期來看，相同濃度下的各組海參相對存活率沒有顯著 的變化。說明新型養(yǎng)殖方法中，5-40天不換水，蛭弧菌混合體菌液都能增強海參的免疫能 力。就B、C、D三組不同處理方式而言，均能提高海參的相對存活率，且在水體與飼料中同時 添加，效果最佳。
因此，無論在水中還是飼料中添加一定濃度的蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液，長達(dá)40天不換 水，都會提高海參的免疫抵抗力，在水中與飼料中同時添加，效果最好。從而進一步表明蛭 弧菌混合體也具有潛在的疫苗作用，能夠刺激海參產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，抵御氣單胞菌的侵 害，有助于提高海參的成活率。
經(jīng)過測定，A組水池中的各項水質(zhì)測定值均高于試驗組B、C、D組的。其中，A組氨 態(tài)氮的檢測結(jié)果為0. 288mg/L,高于B組的0. 123 0. 212mg/L, C組的0. 128 0. 23Img/ L、D組的0. 093 0. 197mg/L ；A組的亞硝酸鹽氮的檢測結(jié)果為0. 079mg/L,高于B組的 0. 023 0. 053mg/L、C 組的 0. 029 0. 060mg/L、D 組的 0. 015 0. 031mg/L。由以上結(jié)果 分析可知，應(yīng)用濃度為10-l(fpfU/mL蛭弧菌游泳體和蛭質(zhì)體混合菌液可有效改善養(yǎng)殖水體 環(huán)境，調(diào)節(jié)水中氨態(tài)氮、亞硝酸鹽氮的含量，從而提供有利于海參生存的水體環(huán)境，并且在 水體和飼料中同時添加，效果最佳。
由此可見，無論在水中還是在飼料中添加濃度為10 107pfu/mL的蛭弧菌蛭弧菌 游泳體和蛭質(zhì)體的混合體菌液，40天換(全池)水一次，都能夠達(dá)到提高海參的免疫力和成 活率，促進生長，且可控制水中細(xì)菌數(shù)量，調(diào)節(jié)水中氨態(tài)氮、亞硝酸鹽氮的含量，改善水質(zhì)。 在水中和飼料中同時添加，效果更佳。即能夠節(jié)約地下水資源，保護環(huán)境，又能夠減少能源 消耗，節(jié)省成本，提高經(jīng)濟效益，促進養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展。
表一海參的生長指標(biāo)、免疫指標(biāo)及水質(zhì)的測定
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權(quán)利要求
1.一種節(jié)能型海參養(yǎng)殖方法，其特征在于包括以下操作步驟(1)取海域無污染的深海水作為養(yǎng)殖用水；養(yǎng)殖用水經(jīng)砂濾、沉淀和消毒后，注入養(yǎng)殖 池；養(yǎng)殖池中放置經(jīng)過消毒的波紋板；(2)在養(yǎng)殖池中加入蛭弧菌游泳體和蛭質(zhì)體的混合體菌液，并加大曝氣，攪拌均勻，使 池水中的蛭弧菌游泳體和蛭質(zhì)體的混合體的濃度達(dá)10 107pfu/mL ；(3)向養(yǎng)殖池中投放海參苗；(4)養(yǎng)殖期間正常曝氣，控制水溫在15 30°C，池水的鹽度保持在23%。 30%。，日投 餌量為海參體重的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)3 5%，餌料在投入前，用濃度為10 l(fpfu/mL的蛭弧菌 游泳體和蛭質(zhì)體的混合體菌液浸泡15 30min ；每隔5 40天換掉池水一次，每次換水后 加入蛭弧菌游泳體和蛭質(zhì)體的混合體菌液，使池水中的蛭弧菌游泳體和蛭質(zhì)體的混合體濃 度達(dá)到10 107pfu/mLo
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種節(jié)能型海參養(yǎng)殖方法，其特征在于步驟(1)所述養(yǎng)殖 池在注入養(yǎng)殖用水之前清洗消毒干凈；所述養(yǎng)殖池中3m2 4m2布置1個散氣石。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種節(jié)能型海參養(yǎng)殖方法，其特征在于步驟⑵和⑷所 述加入蛭弧菌游泳體和蛭質(zhì)體的混合體菌液的方法為用養(yǎng)殖池中的池水稀釋菌液后，均 勻潑灑全池。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種節(jié)能型海參養(yǎng)殖方法，其特征在于步驟( 所述加大 曝氣的曝氣量為90 100L/h/m3 ；步驟(4)所述正常曝氣的曝氣量為70 80L/h/m3。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種節(jié)能型海參養(yǎng)殖方法，其特征在于步驟C3)所述投放 海參苗在水溫15 30°C時按照以下標(biāo)準(zhǔn)海參苗規(guī)格為400頭/kg時，投放密度為600頭 /m2 ；海參苗規(guī)格為200頭/kg時，投放密度為400尾/m2 ；海參苗規(guī)格為100頭/kg時，投放 密度為300尾/m2。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種節(jié)能型海參養(yǎng)殖方法，其特征在于步驟(4)所述餌料 為配合餌料，每天投餌兩次；每隔5 7天采用虹吸法進行養(yǎng)殖池底的吸污。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種節(jié)能型海參養(yǎng)殖方法，其特征在于步驟⑵和⑷所 述蛭弧菌為蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDMOl，所述蛭弧菌于2008年4月28日保藏于中國 典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :M208066。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種節(jié)能型海參養(yǎng)殖方法，其特征在于步驟( 和(4)所 述混合物菌液為蛭弧菌游泳體菌液和蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液按細(xì)菌個數(shù)11混合而成。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種節(jié)能型海參養(yǎng)殖方法，其特征在于所述蛭弧菌蛭質(zhì)體 菌液按照以下方法制備得到接種0. 5mL濃度為IO7CfuAiL的嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)于營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，26 30°C培養(yǎng)20h，培養(yǎng)液經(jīng)5000 8000rpm離 心10 20min后，沉淀用ImL生理鹽水懸浮后，加入至DNB液體培養(yǎng)基中，再接入ImL含 103pfu/mL蛭弧菌BDM01的菌液，于25 !35°C、150 300rpm培養(yǎng)36 48h，培養(yǎng)液在4°C 下經(jīng)6000 8000rpm離心15 20min后，去除含蛭弧菌游泳體的上清液，沉淀用DNB液 體培養(yǎng)基、水、生理鹽水或0. 2mol/L pH值為7. 2 7. 6的磷酸鹽緩沖液懸浮，得到濃度為 109pfu/mL的蛭弧菌蛭質(zhì)體菌液；所述蛭弧菌游泳體菌液按照以下方法制備得到將蛭弧菌蛭質(zhì)體制備方法中的含蛭弧 菌游泳體的上清經(jīng)16000 18000rpm離心15 20min后，沉淀用DNB液體培養(yǎng)基、水、生理鹽水或0. 2mol/L pH值為7. 2 7. 6的磷酸鹽緩沖液懸浮，得到濃度為108pfu/mL的蛭 弧菌游泳體菌液。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種節(jié)能型海參育苗方法，其特征在于所述DNB液體培養(yǎng) 基是將營養(yǎng)肉湯0. Sg、酪蛋白酸水解物0. 5g和酵母精提物0. Ig溶于IOOOml蒸餾水中，調(diào) 節(jié)PH值至7. 2 7. 6。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種節(jié)能型海參養(yǎng)殖方法。該方法包括養(yǎng)殖水源選擇，池水的處理，飼料的處理，換水周期的控制，按照養(yǎng)殖水體生態(tài)學(xué)原理，海洋生物的生長環(huán)境要求，生物之間的相互關(guān)系及無公害養(yǎng)殖標(biāo)準(zhǔn)，采用生物生態(tài)學(xué)的方法控制養(yǎng)殖環(huán)境。關(guān)鍵技術(shù)是在水體中添加蛭弧菌游泳體和蛭質(zhì)體混合菌液，同時飼料也用蛭弧菌游泳體和蛭質(zhì)體混合體菌液浸泡，養(yǎng)殖期間可達(dá)到40天換掉池水一次。本發(fā)明為生物養(yǎng)殖方法，綠色、安全、無污染，效果顯著，能夠改善水質(zhì)，促進海參攝食，提高免疫力，促進生長，并提高成活率，有極好的發(fā)展前景。對提高經(jīng)濟效益和食用安全性，保障人類健康具有十分重要的意義。
文檔編號A01K61/00GK102027883SQ20101027092
公開日2011年4月27日 申請日期2010年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月31日
發(fā)明者何偉杰, 蔡俊鵬 申請人:華南理工大學(xué)