專利名稱：2-o-葡糖糖苷抗壞血酸在制備性別控制精液中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及2-0-葡糖糖苷抗壞血酸的新用途，具體地說(shuō)，涉及2-0-葡糖糖苷抗壞 血酸在制備性別控制精液中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
2-0-葡萄糖苷抗壞血酸(AA-2G)是抗壞血酸(VC)的一種衍生物，其是將抗壞血 酸2位上的羥基用葡萄糖基取代后形成的。由于2位上有葡萄糖基掩蔽，所以AA-2G不易 發(fā)生氧化，在水溶液中特別穩(wěn)定；并且AA-2G沒(méi)有直接還原性，但在酶的作用下能很快的釋 放出高活性的VC，VC能很快與自由基反應(yīng)從而降低脂質(zhì)過(guò)氧化作用。目前，AA-2G作為抗氧化劑在化妝品、準(zhǔn)藥品和食品等諸多領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用，且 在繁殖領(lǐng)域也應(yīng)用于家畜精子的冷凍保存。性別控制(sex control)技術(shù)，即X/Y精子分離技術(shù)，是利用X、Y精子中DNA 含量的差異，借助特異性染色劑染色，然后根據(jù)發(fā)出的熒光強(qiáng)度，通過(guò)計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)精子類 別，給液滴附加電荷，根據(jù)靜電原理，將X、Y精子分離開(kāi)來(lái)(例如，Johnson LA, Pinkel D. Modificationof a laser-based flow cytometer for high resolution DNA analysis ofmammalian spermatozoa. Cytometry 1986，7 :268 273)。該技術(shù)在畜牧生產(chǎn)中意義重 大，該技術(shù)可以按照生產(chǎn)需求人為地控制動(dòng)物后代的性別，快速繁育高產(chǎn)家畜，加速家畜育 種進(jìn)程，提高畜牧業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，促進(jìn)畜牧業(yè)發(fā)展。目前還沒(méi)有將AA-2G應(yīng)用于制備性別控制精液的制備過(guò)程中的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供2-0-葡糖糖苷抗壞血酸的新用途。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供2-0-葡糖糖苷抗壞血酸(AA-2G)在制備性別控制 精液中的應(yīng)用，優(yōu)選為2-0-葡糖糖苷抗壞血酸在制備哺乳動(dòng)物的性別控制精液中的應(yīng)用。 所述哺乳動(dòng)物優(yōu)選為家畜，所述家畜優(yōu)選為豬或羊。本發(fā)明中所述性別控制精液是將精子進(jìn)行性別分離制得的單一性別精液。其是 通過(guò)X/Y精子分離技術(shù)，利用X、Y精子中DNA含量的差異，借助特異性染色劑染色，然后根 據(jù)發(fā)出的熒光強(qiáng)度，通過(guò)計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)精子類別，然后給液滴附加電荷，根據(jù)靜電原理，將X、Y 精子分離開(kāi)來(lái)，從而對(duì)精子進(jìn)行性別分離，制得單一性別精液。其具體操作過(guò)程如下1、取一定量原精液，用H印es緩沖液稀釋至200X 106精子/mL，然后加入終濃度為 0. llmM H33342 及終濃度為 150 250 ii MAA-2G，在 34°C水浴中染色 45min ；2、用含有4% (重量體積比g/ml)提純卵黃和5% (重量體積比g/ml)食品紅的 Hepes緩沖液進(jìn)一步稀釋至100 X 106精子/mL ；其中，添加食品紅的目的是減弱死精子上的H33342熒光，使這部分精子在分離過(guò) 程中被棄除，提高分離精子的活力；3、然后用SX-MoFlo流式細(xì)胞分離儀進(jìn)行精子分離和回收，對(duì)收集得到的單一性別精子進(jìn)行檢測(cè)。其中，AA-2G的終濃度優(yōu)選為200 u M。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，本發(fā)明將AA-2G應(yīng)用于性別控制精液的制備過(guò)程中，能夠抑 制制備過(guò)程中產(chǎn)生的大量的自由氧；并且由于AA-2G在水溶液中穩(wěn)定，因此能最大限度地 避免精子在制備過(guò)程中因分離和離心等處理過(guò)程造成的損傷；從而能夠明顯提高精子活 力、頂體完整性、質(zhì)膜完整性等精子質(zhì)量參數(shù)，從作用效果和作用時(shí)間上都明顯優(yōu)于本領(lǐng)域 中現(xiàn)有的抗氧化劑。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例3中不同抗氧化劑對(duì)豬性別控制精液的頂體完整性的影響 (17°C )。圖2為本發(fā)明實(shí)施例3中不同抗氧化劑對(duì)豬性別控制精液的質(zhì)膜完整性的影響 (17°C )。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。(注實(shí) 施例中的百分?jǐn)?shù)均為重量體積比，單位g/ml)實(shí)施例11、取一定量豬的原精液，用H印es緩沖液稀釋至200X 106精子/mL，然后加入終濃 度為 0. llmM H33342 及終濃度為 200 u M AA-2G (0. 068mg/ml)，在 34°C水浴中染色 45min ；2、用含有4% (g/ml)提純卵黃和5%食品紅(g/ml)的H印es緩沖液進(jìn)一步稀釋 至 100X 106 精子 /mL ；3、然后用SX-MoFlo流式細(xì)胞分離儀進(jìn)行精子分離和回收，對(duì)收集得到的單一性 別精子進(jìn)行檢測(cè)，制得豬性別控制精液。實(shí)施例21、取一定量豬的原精液，用H印es緩沖液稀釋至200 X 106精子/mL，然后加入終濃 度為 0. llmM H33342 及終濃度為 250 u M AA-2G(0. 085mg/ml)，在 34°C水浴中染色 45min ；2、用含有4% (g/ml)提純卵黃和5%食品紅(g/ml)的H印es緩沖液進(jìn)一步稀釋 至 100X 106 精子 /mL ；3、然后用SX-MoFlo流式細(xì)胞分離儀進(jìn)行精子分離和回收，對(duì)收集得到的單一性 別精子進(jìn)行檢測(cè)，制得豬性別控制精液。用熒光顯微鏡檢測(cè)制得的豬性別控制精液，結(jié)果表明，精子的頂體完整性、質(zhì)膜完 整性均良好。實(shí)施例3與實(shí)施例1方法相同，只是將AA-2G的終濃度調(diào)整為150 uM(0. 051mg/ml)，制得豬 性別控制精液。用熒光顯微鏡檢測(cè)制得的豬性別控制精液，結(jié)果表明，精子的頂體完整性、質(zhì)膜完 整性均良好。實(shí)施例4
用羊的原精液代替豬的原精液，按照實(shí)施例1方法，制得羊性別控制精液。用熒光顯微鏡檢測(cè)制得的羊性別控制精液，結(jié)果表明，精子的頂體完整性、質(zhì)膜完 整性均良好。實(shí)施例5為了進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的效果，根據(jù)實(shí)施例1的豬性別控制精液的制備方法，進(jìn) 行了 8組試驗(yàn)，分別在步驟1中染色前添加不同的抗氧化劑，其中，對(duì)照組不添加任何抗氧 化劑、也不添加精清；P組不添加任何抗氧化劑、只添加10%精清；A組添加AA-2G、不添加 精清；E組添加維生素E、不添加精清；G組添加谷胱甘肽(GSH)、不添加精清；P+A組添加 AA-2G及10%精清；P+E組添加VE及10%精清；P+G組添加GSH及10%精清。抗氧化劑的 用量如表1所示，各組添加藥品用等量hepes緩沖液進(jìn)行溶解，其余步驟均與實(shí)施例1方法 相同。其中，GSH及VE的劑量是在參考現(xiàn)有文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定得到的；在該劑 量下，GSH及VE對(duì)豬精子的保護(hù)效果最好，當(dāng)劑量大于或小于該值時(shí)，GSH及VE對(duì)豬精子的 保護(hù)效果均比該值時(shí)差。將制得的豬性別控制精液在37°C條件下，熒光顯微鏡檢測(cè)精子活力、頂體完整性、 質(zhì)膜完整性。結(jié)果如表1、圖1 2所示。表1不同抗氧化劑對(duì)豬精子活力及存活時(shí)間的影響
權(quán)利要求
2 O 葡糖糖苷抗壞血酸在制備性別控制精液中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是指2-0-葡糖糖苷抗壞血酸在 制備哺乳動(dòng)物的性別控制精液中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物為家畜。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述家畜為豬或羊。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述性別控制精液是將精子 進(jìn)行性別分離制得的單一性別精液。
全文摘要
本發(fā)明提供了2-O-葡糖糖苷抗壞血酸在制備性別控制精液中的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，本發(fā)明將AA-2G應(yīng)用于性別控制精液的制備過(guò)程中，能夠抑制制備過(guò)程中產(chǎn)生的大量的自由氧；并且由于AA-2G在水溶液中穩(wěn)定，因此能最大限度地避免精子在制備過(guò)程中因分離和離心等處理過(guò)程造成的損傷，從而能夠明顯提高精子活力、頂體完整性、質(zhì)膜完整性等精子質(zhì)量參數(shù)，從作用效果和作用時(shí)間上都明顯優(yōu)于本領(lǐng)域中現(xiàn)有的抗氧化劑。
文檔編號(hào)A01K67/02GK101971797SQ20101027792
公開(kāi)日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2010年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月9日
發(fā)明者夏春梅, 揚(yáng)升, 田見(jiàn)暉 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)