專利名稱：：粉虱座殼孢黃色無紡布菌劑及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種殺蟲真菌的新劑型生產(chǎn)方法，具體地說是一種分離柑桔粉虱的粉虱座殼孢[Aschersoniaaleyrodis]AsG0910菌株，能高效防治桔園、茶園剌吸式口器害蟲的黃色無紡布菌劑的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
：化學(xué)殺蟲劑以快速作用方式保護(hù)作物免受損失的同時也留下了日益嚴(yán)重的后果，引發(fā)了一系列環(huán)境和社會問題。害蟲抗藥性迅速增加，防治成本不斷抬高，農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境日趨惡化，環(huán)境污染日趨嚴(yán)重，形成了越用藥越泛濫，越泛濫越用藥的惡性循環(huán)。因此，發(fā)展生物殺蟲劑，應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)控制害蟲是21世紀(jì)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要課題。生物制劑中，殺蟲真菌制劑作用方式獨(dú)特，常通過昆蟲體壁接觸感染致死昆蟲。而細(xì)菌、病毒等昆蟲病原微生物必須經(jīng)昆蟲口器攝入到消化道內(nèi)才能感染并致死昆蟲，因此對一般的咀嚼式口器害蟲有效，而無法對作用于將口針插于植物韌皮部吸食汁液的蚜蟲類剌吸式口器害蟲。由于作用方式獨(dú)特，殺蟲真菌不僅對咀嚼式口器害蟲有效，更對剌吸式口器害蟲有效。開發(fā)和應(yīng)用真菌生物殺蟲劑受到各國的重視。目前世界上開發(fā)了蠟蚧輪枝菌、球孢白僵菌、金龜子綠僵菌、擬青霉和粉虱座殼孢等真菌殺蟲劑，注冊生產(chǎn)了20多個產(chǎn)品。粉虱座殼孢(AschersoniaaleyrodisWebber)屬絲孢菌類，腔孢綱，球孢目，鮮殼孢科，座殼屬，主要侵染粉虱、介殼蟲等剌吸式口器害蟲，廣泛分布于拉丁美洲、南亞和東南亞地區(qū)。1921年，美國人Berger發(fā)明了一種利用馬鈴薯大量生產(chǎn)該菌的技術(shù)來防治柑桔粉虱(Dialeurodescitri)。然而，由于有人對它們的效果顯著性產(chǎn)生懷疑，加上廉價廣譜化學(xué)殺蟲劑的廣泛應(yīng)用，這項研究不久便停頓下來。上世紀(jì)60年代化學(xué)農(nóng)藥的副作用暴露以后，座殼孢菌在生物防治上的應(yīng)用又重新得到重視，特別是在東歐和亞洲。20世紀(jì)60年代初前蘇聯(lián)從我國和越南等地引進(jìn)扁座殼孢和粉虱座殼孢等4個種，取得大面積防治柑桔粉虱的良好效果。福建應(yīng)用掛枝法引進(jìn)粉虱座殼孢成功防治了柑桔粉虱，10年推廣面積達(dá)10萬畝次。四川、浙江、臺灣，還有華南、西南地區(qū)的各省相繼等推廣這一技術(shù)，達(dá)到明顯效果。但是這種人工掛枝法費(fèi)工、費(fèi)時，應(yīng)用上受到時間、地點(diǎn)、條件等因素限制。前蘇聯(lián)利用分生孢子通過固體、雙相發(fā)酵的方法來進(jìn)行大規(guī)模試驗性生產(chǎn)，以商品名Aseronija登記注冊。荷蘭和前捷克斯洛伐克用芽生孢子通過液體發(fā)酵培養(yǎng)進(jìn)行小規(guī)模試驗生產(chǎn)，產(chǎn)品的主成分是芽生孢子，用于溫室等場所的粉虱和介殼蟲等害蟲防治，該菌制劑產(chǎn)品由于效果較慢，對使用環(huán)境有一定要求(如高濕度的要求)；在發(fā)展過程中，曾受到化學(xué)農(nóng)藥的競爭壓力影響，導(dǎo)致市場占有率有所下降。我國目前有該菌與化學(xué)農(nóng)藥的混合劑的報道(專利200810029251.7"虱座殼孢與高效氯氰菊酯的復(fù)配殺蟲劑"、專利200810029250.2"粉虱座殼孢與阿維菌素的復(fù)配殺蟲劑"、專利200810027583.1"粉虱座殼孢與啶蟲脒的復(fù)配殺蟲劑"、專利200710031518.1"粉虱座殼孢與吡蟲啉的復(fù)配殺蟲劑")，但是這些化學(xué)農(nóng)藥在有機(jī)茶園和果園中，仍然是禁用的，況且也會殺傷天敵。
發(fā)明內(nèi)容為了解決上述問題，本發(fā)明將生物防治與物理防治結(jié)合起來，無紡布菌條與黃色誘蟲方法相結(jié)合。無紡布作為真菌培養(yǎng)基載體，能保持和滿足在無紡布上生長的粉虱座殼孢孢子萌發(fā)所需的濕度；黃色能引誘害蟲，增加與真菌孢子的接觸機(jī)會，增強(qiáng)侵染，造成害蟲流行病的發(fā)生，以控制害蟲種群。本發(fā)明提供一種對于桔園和茶園中具趨黃習(xí)性的粉虱類剌吸式口器害蟲有良好殺滅效果的粉虱座殼孢黃色無紡布菌條生產(chǎn)工藝方法。本發(fā)明粉虱座殼孢黃色無紡布菌劑所述菌劑以粉虱座殼孢為有效成分，將粉虱座殼孢菌株經(jīng)過培養(yǎng)、發(fā)酵后后的發(fā)酵液中浸入無紡布條，并在無紡布條上培養(yǎng)出孢子得到粉虱座殼孢黃色無紡布菌劑。本發(fā)明粉虱座殼孢黃色無紡布菌劑的制備方法制備步驟包括菌種的取得、一級斜面菌種培養(yǎng)、液體種子培養(yǎng)、液體發(fā)酵罐生產(chǎn)和無紡布菌條的接種培養(yǎng)。本發(fā)明中所用到的菌種為粉虱座殼孢菌株AsG0910菌株，該菌株已經(jīng)于2009年12月16日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏號為CGMCCNo.3523，分離自柑桔粉虱的粉虱座殼孢[Aschersoniaaleyrodis]，分類命名Aschersoniaaleyrodis。該粉虱座殼孢菌株AsG0910菌株2009年10月從江西省贛州市郊柑桔園的柑桔上柑桔粉虱分離，通過如下分離方法，經(jīng)分離純化而獲得，經(jīng)分離純化而獲得。分離方法在KenjiKitazawa等(1984)方法上加以改進(jìn)，即首先將子座切成約lmm的均勻、整齊的薄片，于75%酒精中浸10s左右，取出用無菌水漂洗3次，每次約3min至5min，放置于含2%的青霉素和4%的鏈霉素的PDA平板中，每平板可放置4個薄片，培養(yǎng)2d后，觀察生長狀況；若薄片上已長出白色菌絲，而薄片周圍有雜菌長出，用手術(shù)刀小心地將薄片從原平板移到新平板中繼續(xù)培養(yǎng)；若薄片部分已被雜菌覆蓋，用無菌手術(shù)刀小心切下白色菌絲于新平板培養(yǎng)；若無雜菌出現(xiàn)，則將薄片保留在原平板培養(yǎng)。培養(yǎng)至產(chǎn)孢(7d左右)，于新平板劃線，挑單斑轉(zhuǎn)接到斜面保存。KenjiKitazawa等(1984)方法KenjiKitazawa，IchiroFujisawaandShun-ichiImabayashi(1984).Isolationof(Verticillium)lecanii(Zimm.)ViegasaffectingaphidsandgreenhousewhiteflyinJapan.Ann.Phytopath.Soc.J即an，50，574-581。由于蟲生真菌具有可觀的擴(kuò)散效果，較長的土壤宿存能力，獨(dú)特的體壁侵染方式，以及害蟲抗性發(fā)展緩慢和容易生產(chǎn)等顯著優(yōu)點(diǎn)，而且毒力測定的結(jié)果證明以粉虱座殼孢為代表的真菌殺蟲劑對桔園、茶園剌吸式口器害蟲如各種粉虱等有強(qiáng)大的毒力。只要選擇良好的施用方式和正確的劑型，就能取得優(yōu)于其他生物或化學(xué)農(nóng)藥無可比擬的良好效果。本發(fā)明工藝生產(chǎn)的黃極無紡布菌條劑型具有獨(dú)特的先進(jìn)性一是對害蟲的防治效果持久。由于無紡布上的真菌孢子生存活性遠(yuǎn)高于孢子粉，而且，真菌還可以利用無紡布上的營養(yǎng)不斷生長產(chǎn)孢，孢子存活力明顯加長，有利于殺滅害蟲；二是無紡布真菌菌條劑型在田間壽命很長，受天氣影響相對較小。無紡布上的孢子主要是靠飄移而接觸蟲體的，與昆蟲接觸的機(jī)會相對較多環(huán)境中有利因子出現(xiàn)的時間較長，只要條件具備就會侵染害蟲，受環(huán)境制約的幅度較小；三是黃色引誘害蟲，增加無紡布上的孢子與昆蟲接觸的機(jī)會；四是本發(fā)明工藝生產(chǎn)的粉虱座殼孢菌是條針對桔園、茶園剌吸式口器害蟲如各種粉虱，殺蟲效果明顯且穩(wěn)定；五是本發(fā)明生產(chǎn)工藝不復(fù)雜、工藝穩(wěn)定、易調(diào)控、成功率高。六是投資少，占地小、無三廢問題，尤其適于甲小企業(yè)采用。具體實施例方式具體制備步驟包括A、菌種的取得AsG0910菌株，其保藏號為CGMCCNo.3523，分離自柑桔粉虱的粉虱座殼孢B、一級斜面菌種培養(yǎng)將分離純化的菌種接種于PDA培養(yǎng)基斜面，放入25t:培養(yǎng)箱，培養(yǎng)20-22天，待菌絲長滿斜面并產(chǎn)孢時，轉(zhuǎn)入搖瓶進(jìn)行液體種子培養(yǎng)；C、液體種子培養(yǎng)在500ml三角瓶中，裝入200ml的液體種子培養(yǎng)基，1.5pa/kg高壓滅菌30min，待冷卻至40士rC，在超凈工作臺內(nèi)，從斜面菌種子刮取2支培養(yǎng)好的一級斜面菌種的孢子粉到無菌的體積濃度為0.01%的Tween80水溶液中，刮取試管的規(guī)格為180mmX15mm，利用高速分散器使孢子分散均勻，然后將該菌懸浮液接液體培養(yǎng)基中，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱，24-26°C，160轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)22天即可；D、液體發(fā)酵生產(chǎn)采用三級發(fā)酵。(1)、一級種子罐生產(chǎn)取50L氣升式發(fā)酵罐，裝入35L液體培養(yǎng)基，溫度95t:-IO(TC，并加入消泡劑(泡敵)10.5ml，在0.15MPa壓力下，保壓25-40min，消毒冷卻后將4瓶步驟(3)培養(yǎng)好的500ml搖瓶種子接入培養(yǎng)，24-26。C，通氣量1:0.5V/Vmin，保壓0.05-0.07MPa，經(jīng)144-168hr通氣培養(yǎng)，達(dá)到對數(shù)生長期后，接入二級種子罐；(2)、二級種子罐生產(chǎn)取100L氣升式發(fā)酵罐，裝入70L液體培養(yǎng)基，溫度95t:-10(rC，并加入消泡劑(泡敵)18ml，在0.15MPa壓力下。保壓25-40min，消毒冷卻后將一級種子罐種子35L全部接入二級種子罐培養(yǎng)，溫度24-26°C，通氣量1:0.5V/V'min，保壓0.05-0.07MPa，經(jīng)144-168hr通氣培養(yǎng)，達(dá)到對數(shù)生長期后，接入三級種子罐；(3)、三級種子罐生產(chǎn)取1T氣升式發(fā)酵罐，裝入700L液體培養(yǎng)基液體，pH6.0_7.0，加入的熱水溫度95。C-10(TC，并加入消泡劑(泡敵)21Oml，通入蒸汽加熱到121°C，保壓30min，冷卻至24-26°C，將二級種子罐培養(yǎng)好的液體種子70L全部接入，通氣培養(yǎng)，通氣量1:0.4_0.5V/V.min，攪拌轉(zhuǎn)速150r/m，罐壓0.05-0.07MPa，培養(yǎng)時間312_336hr;當(dāng)發(fā)酵液中出現(xiàn)大量菌絲及液生孢子時，殘?zhí)窃?%以下，發(fā)酵液較粘稠，另外鏡檢菌絲變細(xì)、菌絲體中無明顯的液泡，發(fā)酵液中無明顯斷裂的菌絲，可放罐；E、將黃色無紡布條在1.5Pa/Kg高壓滅菌30min后，冷卻后按700條無紡布條接入100L發(fā)酵液的比例浸入已培養(yǎng)好的發(fā)酵液，在20-28°C，濕度為RH93%的培養(yǎng)室架上平鋪培養(yǎng)5天，待菌條上長滿菌絲后，移入溫度在20-28°C，濕度為RH90%的培養(yǎng)室繼續(xù)培養(yǎng)5_7天，菌條上長滿大量孢子，風(fēng)干即可。6所述的斜面培養(yǎng)基液包括去皮馬鈴薯200g，蛋白胨10g，葡萄糖40g，瓊脂20g，水1000ml。所述的液體種子培養(yǎng)基包括在1000ml培養(yǎng)基中含10g蛋白胨、10g酵母浸膏、10gNaCl，各組分混合后加水補(bǔ)至1000ml，并用飽和NaOH水溶液調(diào)pH至7.0。所述的氣升式發(fā)酵罐中的液體培養(yǎng)基包括在1000ml培養(yǎng)基中含5g蛋白胨、10g酵母粉、10gNaCl，加麩皮煮汁，即在800ml水中加麩皮60g煮30min，一層紗布過濾，去除殘渣，各組分混合后加水補(bǔ)至1000ml，并用飽和NaOH水溶液調(diào)pH至7.0。所述的消泡劑為泡敵，用量為培養(yǎng)液，即發(fā)酵液總量的0.03%，即35L中加量為10.5ml，70L培養(yǎng)料中加21ml，700L培養(yǎng)料中加210ml。所述的無紡布條，顏色為黃色，長60cm，寬5cm，厚0.4cm。以下為本發(fā)明的幾個實施例，進(jìn)一步說明本發(fā)明，但是本發(fā)明不僅限于此。實施例1該粉虱座殼孢無紡布菌條生產(chǎn)工藝方法，包括五道生產(chǎn)工序1、菌種AsG0910菌株，其保藏號為CGMCCNo.3523，分離自柑桔粉虱的粉虱座殼孢2、一級斜面菌種培養(yǎng)將分離純化的菌種接種于PDA培養(yǎng)基斜面，放入25t:培養(yǎng)箱，培養(yǎng)20_22天，待菌絲長滿斜面并產(chǎn)孢時，轉(zhuǎn)入搖瓶培養(yǎng)；3、液體種子培養(yǎng)在500ml三角瓶中，裝入200ml的液體種子培養(yǎng)基，1.5pa/kg高壓滅菌30min，待冷卻至4(TC左右，在超凈工作臺內(nèi)，從斜面菌種子刮取2支培養(yǎng)好的一級斜面菌種(試管規(guī)格180mmX15mm)的孢子粉到無菌Tween80(體積濃度0.01%)水中，利用高速分散器使孢子分散均勻，然后將該菌懸浮液接液體培養(yǎng)基中，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱，24-26°C，160轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)22天即可；4、液體發(fā)酵生產(chǎn)該工序分為三個步驟即采用三級發(fā)酵(1)、一級種子罐生產(chǎn)取50L氣升式發(fā)酵罐，裝入35L液體培養(yǎng)基，溫度95°C，并加入消泡劑泡敵10.5ml，在0.15MPa壓力下，保壓25-40min，消毒冷卻后將4瓶上述培養(yǎng)好的500ml搖瓶種子接入培養(yǎng)，24-26°C，通氣量1:0.5，保壓0.05-0.07MPa，經(jīng)144-168hr通氣培養(yǎng)，達(dá)到對數(shù)生長期后，接入二級種子罐；(2)、二級種子罐生產(chǎn)取100L氣升式發(fā)酵罐，裝入70L液體培養(yǎng)基，溫度95t:，并加入消泡劑泡敵18ml，在0.15MPa壓力下。保壓25-40min，消毒冷卻后將一級種子罐種子35L全部接入二級種子罐培養(yǎng)，溫度24-26°C，通氣量1:0.5，保壓0.05-0.07MPa，經(jīng)144_168hr通氣培養(yǎng)，達(dá)到對數(shù)生長期后，接人三級種子罐；(3)、三級種子罐生產(chǎn)取1T氣升式發(fā)酵罐，裝入700L液體培養(yǎng)基液體，pH6.0_7.0，加入的熱水溫度95°C，并加入消泡劑泡敵210ml，通入蒸汽加熱到121°C，保壓30min，冷卻至24-26。C，將二級種子罐培養(yǎng)好的液體種子70L全部接入，通氣培養(yǎng)，通氣量1:0.4-0.5V/V.min，攪拌轉(zhuǎn)速150r/m，罐壓0.05-0.07MPa，培養(yǎng)時間312_336hr;當(dāng)發(fā)酵液中出現(xiàn)大量菌絲及液生孢子時，殘?zhí)窃?%以下，發(fā)酵液較粘稠，另外鏡檢菌絲變細(xì)、菌絲體中無明顯的液泡，發(fā)酵液中無明顯斷裂的菌絲，可放罐；5、菌條滅菌及接種培養(yǎng)將黃色無紡布條在1.5Pa/Kg高壓滅菌30min后，冷卻后按700條無紡布條接入IOOL發(fā)酵液的比例接(浸)入已培養(yǎng)好的發(fā)酵液，在20-28t:，RH93X的培養(yǎng)室架上平鋪培養(yǎng)5天，待菌條上長滿菌絲后，移入溫度在20-281:，朋90%的培養(yǎng)室繼續(xù)培養(yǎng)5-7天，菌條上長滿大量孢子，風(fēng)干即可。實施例2A、菌種的取得AsG0910菌株，其保藏號為CGMCCNo.3523，分離自柑桔粉虱的粉虱座殼孢B、一級斜面菌種培養(yǎng)將分離純化的菌種接種于PDA培養(yǎng)基斜面，放入25t:培養(yǎng)箱，培養(yǎng)20天，待菌絲長滿斜面并產(chǎn)孢時，轉(zhuǎn)入搖瓶進(jìn)行液體種子培養(yǎng)；C、液體種子培養(yǎng)在500ml三角瓶中，裝入200ml的液體種子培養(yǎng)基，1.5pa/kg高壓滅菌30min，待冷卻至40士rC，在超凈工作臺內(nèi)，從斜面菌種子刮取2支培養(yǎng)好的一級斜面菌種的孢子粉到無菌的體積濃度為0.01%的Tween80水溶液中，刮取試管的規(guī)格為180mmX15mm，利用高速分散器使孢子分散均勻，然后將該菌懸浮液接液體培養(yǎng)基中，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱，24t:，160轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)22天即可；D、液體發(fā)酵生產(chǎn)采用三級發(fā)酵。(1)、一級種子罐生產(chǎn)取50L氣升式發(fā)酵罐，裝入35L液體培養(yǎng)基，溫度95°C，并加入消泡劑泡敵10.5ml，在0.15MPa壓力下，保壓25min，消毒冷卻后將4瓶步驟(3)培養(yǎng)好的500ml搖瓶種子接入培養(yǎng)，24°C，通氣量1:0.5V/V*min，保壓0.05MPa，經(jīng)144hr通氣培養(yǎng)，達(dá)到對數(shù)生長期后，接入二級種子罐；(2)、二級種子罐生產(chǎn)取100L氣升式發(fā)酵罐，裝入70L液體培養(yǎng)基，溫度95t:，并加入消泡劑泡敵18ml，在O.15MPa壓力下。保壓25min，消毒冷卻后將一級種子罐種子35L全部接入二級種子罐培養(yǎng)，溫度24t:，通氣量1:0.5V/V^in，保壓0.05MPa，經(jīng)144hr通氣培養(yǎng)，達(dá)到對數(shù)生長期后，接人三級種子罐；(3)、三級種子罐生產(chǎn)取1T氣升式發(fā)酵罐，裝入700L液體培養(yǎng)基液體，pH6.O，加入的熱水溫度95°C，并加入消泡劑泡敵210ml，通入蒸汽加熱到12rC，保壓30min，冷卻至24。C，將二級種子罐培養(yǎng)好的液體種子70L全部接入，通氣培養(yǎng)，通氣量1:0.4V/V.min，攪拌轉(zhuǎn)速150r/m，罐壓0.05MPa，培養(yǎng)時間312hr;當(dāng)發(fā)酵液中出現(xiàn)大量菌絲及液生孢子時，殘?zhí)窃?%以下，發(fā)酵液較粘稠，另外鏡檢菌絲變細(xì)、菌絲體中無明顯的液泡，發(fā)酵液中無明顯斷裂的菌絲，可放罐；E、將黃色無紡布條在1.5Pa/Kg高壓滅菌30min后，冷卻后按700條無紡布條接入100L發(fā)酵液的比例浸入已培養(yǎng)好的發(fā)酵液，在2(TC，濕度為朋93%的培養(yǎng)室架上平鋪培養(yǎng)5天，待菌條上長滿菌絲后，移入溫度在20°C，濕度為RH90%的培養(yǎng)室繼續(xù)培養(yǎng)5天，菌條上長滿大量孢子，風(fēng)干即可。斜面培養(yǎng)基液包括去皮馬鈴薯200g，蛋白胨10g，葡萄糖40g，瓊脂20g，水1000ml。液體種子培養(yǎng)基包括在1000ml培養(yǎng)基中含10g蛋白胨、10g酵母浸膏、10gNaCl，各組分混合后加水補(bǔ)至1000ml，并用飽和NaOH水溶液調(diào)pH至7.0。氣升式發(fā)酵罐中的液體培養(yǎng)基包括在1000ml培養(yǎng)基中含5g蛋白胨、10g酵母粉、10gNaCl，加麩皮煮汁，即在800ml水中加麩皮60g煮30min，一層紗布過濾，去除殘渣，各組分混合后加水補(bǔ)至1000ml，并用飽和NaOH水溶液調(diào)pH至7.0。消泡劑為泡敵，用量為培養(yǎng)液，即發(fā)酵液總量的0.03%，即35L中加量為10.5ml，70L培養(yǎng)料中加21ml，700L培養(yǎng)料中加210ml。無紡布條，顏色為黃色，長60cm，寬5cm，厚0.4cm。實施例3A、菌種的取得AsG0910菌株，其保藏號為CGMCCNo.3523，分離自柑桔粉虱的粉虱座殼孢B、一級斜面菌種培養(yǎng)將分離純化的菌種接種于PDA培養(yǎng)基斜面，放入25t:培養(yǎng)箱，培養(yǎng)22天，待菌絲長滿斜面并產(chǎn)孢時，轉(zhuǎn)入搖瓶進(jìn)行液體種子培養(yǎng)；C、液體種子培養(yǎng)在500ml三角瓶中，裝入200ml的液體種子培養(yǎng)基，1.5pa/kg高壓滅菌30min，待冷卻至40士rC，在超凈工作臺內(nèi)，從斜面菌種子刮取2支培養(yǎng)好的一級斜面菌種的孢子粉到無菌的體積濃度為0.01%的Tween80水溶液中，刮取試管的規(guī)格為180mmX15mm，利用高速分散器使孢子分散均勻，然后將該菌懸浮液接液體培養(yǎng)基中，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱，26。C，160轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)22天即可；D、液體發(fā)酵生產(chǎn)采用三級發(fā)酵。(1)、一級種子罐生產(chǎn)取50L氣升式發(fā)酵罐，裝入35L液體培養(yǎng)基，溫度95°C，并加入消泡劑泡敵10.5ml，在0.15MPa壓力下，保壓25min，消毒冷卻后將4瓶步驟(3)培養(yǎng)好的500ml搖瓶種子接入培養(yǎng)，26°C，通氣量1:0.5V/V'min，保壓0.07MPa，經(jīng)168hr通氣培養(yǎng)，達(dá)到對數(shù)生長期后，接入二級種子罐；(2)、二級種子罐生產(chǎn)取100L氣升式發(fā)酵罐，裝入70L液體培養(yǎng)基，溫度95t:，并加入消泡劑泡敵18ml，在O.15MPa壓力下。保壓40min，消毒冷卻后將一級種子罐種子35L全部接入二級種子罐培養(yǎng)，溫度26。C，通氣量1:0.5V/V'min，保壓0.07MPa，經(jīng)168hr通氣培養(yǎng)，達(dá)到對數(shù)生長期后，接人三級種子罐；(3)、三級種子罐生產(chǎn)取IT氣升式發(fā)酵罐，裝入700L液體培養(yǎng)基液體，pH7.O，加入的熱水溫度95°C，并加入消泡劑泡敵210ml，通入蒸汽加熱到12rC，保壓30min，冷卻至26。C，將二級種子罐培養(yǎng)好的液體種子70L全部接入，通氣培養(yǎng)，通氣量1:0.5V/V.min，攪拌轉(zhuǎn)速150r/m，罐壓0.07MPa，培養(yǎng)時間336hr;當(dāng)發(fā)酵液中出現(xiàn)大量菌絲及液生孢子時，殘?zhí)窃?%以下，發(fā)酵液較粘稠，另外鏡檢菌絲變細(xì)、菌絲體中無明顯的液泡，發(fā)酵液中無明顯斷裂的菌絲，可放罐；E、將黃色無紡布條在1.5Pa/Kg高壓滅菌30min后，冷卻后按700條無紡布條接入100L發(fā)酵液的比例浸入已培養(yǎng)好的發(fā)酵液，在2『C，濕度為朋93%的培養(yǎng)室架上平鋪培養(yǎng)5天，待菌條上長滿菌絲后，移入溫度在28°C，濕度為RH90%的培養(yǎng)室繼續(xù)培養(yǎng)7天，菌條上長滿大量孢子，風(fēng)干即可。斜面培養(yǎng)基液包括去皮馬鈴薯200g，蛋白胨10g，葡萄糖40g，瓊脂20g，水1000ml。液體種子培養(yǎng)基包括在1000ml培養(yǎng)基中含10g蛋白胨、10g酵母浸膏、10gNaCl，各組分混合后加水補(bǔ)至1000ml，并用飽和NaOH水溶液調(diào)pH至7.0。氣升式發(fā)酵罐中的液體培養(yǎng)基包括在1000ml培養(yǎng)基中含5g蛋白胨、10g酵母粉、10gNaCl，加麩皮煮汁，即在800ml水中加麩皮60g煮30min，一層紗布過濾，去除殘渣，各組分混合后加水補(bǔ)至1000ml，并用飽和NaOH水溶液調(diào)pH至7.0。消泡劑為泡敵，用量為培養(yǎng)液，即發(fā)酵液總量的0.03%，即35L中加量為10.5ml，70L培養(yǎng)料中加21ml，700L培養(yǎng)料中加210ml。無紡布條，顏色為黃色，長60cm，寬5cm，厚0.4cm。使用效果實施例座殼孢菌AsG0910無紡布菌劑的使用過程和防治柑桔粉虱的效果試驗所用的桔園為典型山丘桔園，桔垅(寬約1.52.Om)呈階梯狀分布，坡度約45度，坡底至坡頂高約30m。這類桔園在南方丘陵柑桔種植區(qū)非常典型，常受柑桔粉虱為害。所用菌劑為LFZ0408黃色無紡布菌條，平均含孢量為3.9X108孢子/(^2，將菌條懸掛在柑桔樹上，每棵樹東、南、西、北、中五個方向懸掛，每個方位分上下兩個部位，每棵樹掛10條無紡布菌條。處理1，10棵樹每棵樹掛10條黃色無紡布菌；處理2，20棵樹每棵樹掛10條白色無紡布菌；處理3，每棵樹4噴LFZ0408菌株孢子懸浮液菌劑，孢子濃度為1.9X107孢子/mL;對照區(qū)不作任何處理。3個重復(fù)，每個重復(fù)0.167畝。3周后，按照東、南、西、北四個方向，每個方向分上、中、下三個層次計數(shù)蟲口密度，以藥后蟲口減退率計算校正防效，并用新復(fù)極差進(jìn)行顯著性測定。退減率(％)=[(藥前蟲口基數(shù)-處理后蟲口數(shù))/藥前蟲口基數(shù)]X100校正防效(％)=[(處理區(qū)減退率-對照區(qū)減退率)/(100-對照區(qū)減退率)]X100感染率的估計隨機(jī)取5棵樹，每棵樹按照東、南、西、北四個方向，每個方向分上、中、下三個層次，各采2片(共24片/樹)嫩葉，帶回室內(nèi)鏡檢，統(tǒng)計柑桔粉虱數(shù)亡蟲數(shù)，將死蟲移出放于盛有濕吸水紙的培養(yǎng)皿內(nèi)的載玻片上，25t:保濕培養(yǎng)，以蟲體表而長出座殼孢菌子座為有效致死，統(tǒng)計有效致死蟲數(shù)，感染率(％)=有效致死蟲數(shù)/柑桔粉虱數(shù)亡蟲數(shù)X100。上述數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計使用Systat.10.處理。表1田間釋放座殼孢菌AsG0910菌株菌劑的防治柑桔粉虱效果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>*注后面字母為Duncan多重比較的檢驗結(jié)果，同一列中凡有相同字母者，表示在0.05水平上差異不顯著，否者為差異顯著。結(jié)果表表明，釋放黃色無紡布菌條的小區(qū)柑桔粉虱密度降到了一個很低水平(分別降低16.33倍)，蟲口退減率達(dá)93.51%，防治效果達(dá)到92.07%，比白色無紡布菌條的小區(qū)防治效果高2.53倍，比噴孢子懸浮液的小區(qū)防效高1.6倍。由于黃色對柑桔粉虱的誘集效應(yīng)增加對菌條孢子的接觸機(jī)會，感染率大大提高，由40.031%增加75.75%，由從而提高了防治效果；由于無紡布吸收空氣中水份，提供了孢子萌發(fā)所需的高濕度微環(huán)境，感染率大大提高，由47.07%增加75.75%，從而提高了防治效果。權(quán)利要求一種粉虱座殼孢黃色無紡布菌劑，其特征在于所述菌劑以粉虱座殼孢為有效成分，將粉虱座殼孢菌株經(jīng)過培養(yǎng)、發(fā)酵后的發(fā)酵液中浸入無紡布條，并在無紡布條上培養(yǎng)出孢子得到粉虱座殼孢黃色無紡布菌劑。2.—種如權(quán)利要求1所述的粉虱座殼孢黃色無紡布菌劑的制備方法，其特征在于制備步驟包括菌種的取得、一級斜面菌種培養(yǎng)、液體種子培養(yǎng)、液體發(fā)酵罐生產(chǎn)和無紡布菌條的接種培養(yǎng)。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的粉虱座殼孢黃色無紡布菌劑的制備方法，其特征在于具體制備步驟包括A、菌種的取得AsG0910菌株，其保藏號為CGMCCNo.3523，分離自柑桔粉虱的粉虱座殼孢[Aschersoniaaleyrodis]B、一級斜面菌種培養(yǎng)將分離純化的菌種接種于PDA培養(yǎng)基斜面，放入25。C培養(yǎng)箱，培養(yǎng)20-22天，待菌絲長滿斜面并產(chǎn)孢時，轉(zhuǎn)入搖瓶進(jìn)行液體種子培養(yǎng)；C、液體種子培養(yǎng)在500ml三角瓶中，裝入200ml的液體種子培養(yǎng)基，1.5pa/kg高壓滅菌30min，待冷卻至40士rC，在超凈工作臺內(nèi)，從斜面菌種子刮取2支培養(yǎng)好的一級斜面菌種的孢子粉到無菌的體積濃度為0.01%的Tween80水溶液中，刮取試管的規(guī)格為180mmX15mm，利用高速分散器使孢子分散均勻，然后將該菌懸浮液接液體培養(yǎng)基中，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱，24-26°C，`160轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)22天即可；D、液體發(fā)酵生產(chǎn)采用三級發(fā)酵；(1)、一級種子罐生產(chǎn)取50L氣升式發(fā)酵罐，裝入35L液體培養(yǎng)基，溫度95t:-IO(TC，并加入消泡劑10.5ml，在0.15MPa壓力下，保壓25-40min，消毒冷卻后將4瓶步驟(3)培養(yǎng)好的500ml搖瓶種子接入培養(yǎng)，24-26°C，通氣量1:0.5V/Vmin，保壓0.05-0.07MPa，經(jīng)144_168hr通氣培養(yǎng)，達(dá)到對數(shù)生長期后，接入二級種子罐；(2)、二級種子罐生產(chǎn)取IOOL氣升式發(fā)酵罐，裝入70L液體培養(yǎng)基，溫度95°C-IO(TC，并加入消泡劑18ml，在0.15MPa壓力下；保壓25-40min，消毒冷卻后將一級種子罐種子35L全部接入二級種子罐培養(yǎng)，溫度24-26。C，通氣量1:0.5V/Vmin，保壓0.05-0.07MPa，經(jīng)144-168hr通氣培養(yǎng)，達(dá)到對數(shù)生長期后，接入三級種子罐；(3)、三級種子罐生產(chǎn)取1T氣升式發(fā)酵罐，裝入700L液體培養(yǎng)基液體，pH6.0-7.0，加入的熱水溫度95。C-10(TC，并加入消泡劑21Oml，通入蒸汽加熱到121°C，保壓30min，冷卻至24-26°C，將二級種子罐培養(yǎng)好的液體種子70L全部接入，通氣培養(yǎng)，通氣量`1:0.4-0.5V/V.min，攪拌轉(zhuǎn)速150r/m，罐壓0.05-0.07MPa，培養(yǎng)時間312_336hr;當(dāng)發(fā)酵液中出現(xiàn)大量菌絲及液生孢子時，殘?zhí)窃?%以下，發(fā)酵液較粘稠，另外鏡檢菌絲變細(xì)、菌絲體中無明顯的液泡，發(fā)酵液中無明顯斷裂的菌絲，可放罐；E、將黃色無紡布條在1.5Pa/Kg高壓滅菌30min后，冷卻后按700條無紡布條接入100L發(fā)酵液的比例浸入已培養(yǎng)好的發(fā)酵液，在20-2『C，濕度為朋93%的培養(yǎng)室架上平鋪培養(yǎng)5天，待菌條上長滿菌絲后，移入溫度在20-28°C，濕度為RH90%的培養(yǎng)室繼續(xù)培養(yǎng)5_7天，菌條上長滿大量孢子，風(fēng)干即可。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的粉虱座殼孢黃色無紡布菌劑的制備方法，其特征在于所述的斜面培養(yǎng)基液包括去皮馬鈴薯200g，蛋白胨10g，葡萄糖40g，瓊脂20g，水1000ml。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的粉虱座殼孢黃色無紡布菌劑的制備方法，其特征在于所述的液體種子培養(yǎng)基包括在1000ml培養(yǎng)基中含10g蛋白胨、10g酵母浸膏、10gNaCl，各組分混合后加水補(bǔ)至1000ml，并用飽和NaOH水溶液調(diào)pH至7.0。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的粉虱座殼孢黃色無紡布菌劑的制備方法，其特征在于所述的氣升式發(fā)酵罐中的液體培養(yǎng)基包括在1000ml培養(yǎng)基中含5g蛋白胨、10g酵母粉、10gNaCl，加麩皮煮汁，即在800ml水中加麩皮60g煮30min，一層紗布過濾，去除殘渣，各組分混合后加水補(bǔ)至1000ml，并用飽和NaOH水溶液調(diào)pH至7.0。7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的粉虱座殼孢黃色無紡布菌劑的制備方法，其特征在于所述液體發(fā)酵生產(chǎn)步驟中三級發(fā)酵過程中采用的消泡劑均為泡敵，用量為培養(yǎng)液，即發(fā)酵液總量的0.03%，即35L中加量為10.5ml，70L培養(yǎng)料中加21ml，700L培養(yǎng)料中加210ml。8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的粉虱座殼孢黃色無紡布菌劑的制備方法，其特征在于所述的無紡布條，顏色為黃色，長60cm，寬5cm，厚0.4cm。9.一種如權(quán)利要求3采用的粉虱座殼孢菌株，其特征在于所述粉虱座殼孢菌株AsG0910菌株，分離自柑桔粉虱的粉虱座殼孢[Aschersoniaaleyrodis]，其保藏號為CGMCCNo.3523。全文摘要本發(fā)明提供一種粉虱座殼孢黃色無紡布菌劑及制備方法，即高效防治桔園、茶園刺吸式口器害蟲的真菌殺蟲劑——粉虱座殼孢黃色無紡布菌劑的生產(chǎn)工藝方法。該方法包括五道生產(chǎn)工序，即菌種的取得、一級斜面菌種培養(yǎng)、液體種子培養(yǎng)、液體發(fā)酵罐生產(chǎn)和黃色無紡布菌條的接種培養(yǎng)。本發(fā)明生產(chǎn)的殺蟲劑，對害蟲的防治效果持久，對于桔園和茶園中趨黃習(xí)性的粉虱類害蟲殺蟲效果明顯且穩(wěn)定，受天氣影響相對較小，工藝穩(wěn)定，投資少，占地小，生產(chǎn)無三廢問題。文檔編號A01N63/04GK101779679SQ20101030113公開日2010年7月21日申請日期2010年2月3日優(yōu)先權(quán)日2010年2月3日發(fā)明者姜榮良,尤民生,林成輝,王聯(lián)德,黃建申請人:福建農(nóng)林大學(xué)