專利名稱：一種百合脫毒籽球的快速培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了切花百合脫毒培養(yǎng)的組培方法和利用鼓泡式生物反應(yīng)器快速膨大脫毒小鱗莖(種球)的培養(yǎng)方法，屬于植物組培快繁技術(shù)領(lǐng)域和植物細(xì)胞工程的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
百合是重要的觀賞花卉，主要用于切花品種生產(chǎn)。百合在開放條件下生長，不可避免地被病毒侵染，百合無癥病毒Lily symptomless virus (LSV)、黃瓜花葉病毒Cucumber mosaic virus (CMV)、百合斑駁病毒 Lily mottle virus (LMoV)、郁金香碎花病毒 Tulip breaking virus (TBV)和百合叢簇病毒Lily rosettle virus (LRV)是影響百合花卉生產(chǎn)的常見病毒。病毒侵染植株會造成百合農(nóng)藝性狀嚴(yán)重退化，極大地影響了百合的生產(chǎn)。寄生在百合鱗莖中的病毒，隨著鱗莖芽眼萌發(fā)長成植株的生長過程，病毒會在百合植株體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制繁殖，但在代謝活躍的莖尖分生組織中沒有病毒。百合脫毒技術(shù)就是利用莖尖部分沒有病毒的特性，在無菌環(huán)境條件下，利用人工配置的培養(yǎng)基，培育出無病毒試管苗或籽球，然后將組培苗和籽球在人工隔離或天然隔離條件下，生長成為供切花使用的商品種球。 近年來國內(nèi)百合的消費(fèi)量逐年增大，但目前我國百合生產(chǎn)中，將近90%以上的種球依賴進(jìn)口。少量的國產(chǎn)脫毒種球的生產(chǎn)，絕大多數(shù)采用傳統(tǒng)組培方式，不但生產(chǎn)周期長，而且還需要投入大量的人力，頻繁的更換培養(yǎng)基，生產(chǎn)過程需要很大的培養(yǎng)空間，為了保證培養(yǎng)空間溫濕度，滿足培養(yǎng)條件需要消耗很多能源。為了解決國產(chǎn)脫毒種球生產(chǎn)中存在的問題，特開展利用生物反應(yīng)器快速培養(yǎng)百合脫毒籽球方法的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明包括外植體滅菌和生長點(diǎn)的剝?nèi)?；脫毒培養(yǎng)；組培各階段培養(yǎng)基的配比； 脫毒籽球在反應(yīng)器中的膨大培養(yǎng)；冷藏春化；馴化移栽幾個過程。本發(fā)明選用花卉市場大眾喜愛的“西伯利亞”(Siberia)、“索幫”(Sorborme)、“馬可波羅”(Marco polo)、“曼妮莎” (Manissa)、“康伽德奧” (Concad' 0) 5個品種為材料，采用綜合脫毒技術(shù)，即將熱處理、 抗病毒藥劑和莖尖培養(yǎng)相結(jié)合的方法。優(yōu)化了脫毒百合種球組培培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)程序， 快速培養(yǎng)得到脫毒組培籽球，縮短了百合脫毒優(yōu)質(zhì)種球的快繁時間，同時籽球的定植成活率較高。本發(fā)明易于在切花百合原種的規(guī)模化快繁生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)利用生物反應(yīng)器快速培養(yǎng)百合脫毒種球的方法，按如下步驟進(jìn)行(1)百合種球的栽種在35-38°C條件下種植百合種球，栽種后經(jīng)7_15天的培養(yǎng)， 待芽長高葉集生莖的中部形似蓮座狀(2)外植體滅菌和生長點(diǎn)的剝?nèi)〔杉襟E(1)的百合莖尖，用中性肥皂水清洗 3-5分鐘，自來水沖洗過夜，0. 升汞滅菌5-10分鐘，然后在70%酒精浸泡10-15秒。取出莖尖，先用加吐溫滅菌水沖洗2-3分鐘，再用滅菌水沖洗5-6遍。外植體清洗干凈后，開始剝?nèi)∩L點(diǎn)，先將莖尖的葉片全部剝除，用解剖針挑取百合莖尖生長點(diǎn)，生長點(diǎn)長度為
40. 4-0. 8 (mm)，將剝?nèi)〉纳L 點(diǎn)作為組培培養(yǎng)外植體。(3)脫毒培養(yǎng)將步驟(3)剝?nèi)〉耐庵搀w百合莖尖生長點(diǎn)接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基 (1/2MS+6-BA 1. 0-2. 0mg/L+NAA0. 2-0. 5mg/L+4%蔗糖 + 瓊脂粉 6g/L (pH 5. 8))，經(jīng)過 40-60 天培養(yǎng)，生長點(diǎn)膨大成直徑2-3cm的葉叢。②將葉叢切成0. 5cm小塊，接種于含病毒唑的培養(yǎng)基(MS+NAA0. 2-0. 5mg/L+4%蔗糖 + 病毒唑(Ribavirin) 5-lOmg/L+ 瓊脂粉 5g/L+0. 5%活性炭(pH5. 8))，經(jīng)過40-60天培養(yǎng)，形成帶球的瓶苗。(4)病毒檢測將步驟②瓶苗進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測定實(shí)驗(yàn)(ELISA)和RT-PCR檢測，確認(rèn)無百合無癥病毒(LSV)、黃瓜花葉病毒(CMV)和百合斑駁病毒(LMoV)病毒。(5)脫毒籽球誘導(dǎo)培養(yǎng)將步驟②經(jīng)過病毒檢測無病毒脫毒瓶苗轉(zhuǎn)移到籽球誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+KT 2-5mg/L+NAA0. 2-0. 5mg/L+4% 蔗糖 + 瓊脂粉 5g/L+0. 5% 活性炭(pH 5.8)), 在溫度22士 1°C，光照強(qiáng)度1500Lx，光照12h/d的環(huán)境條件下培養(yǎng)40_60d，直接誘導(dǎo)出脫毒籽球。(6)增殖培養(yǎng)將步驟(4)組培籽球，切去葉片和部分基部組織后，縱切成3-4塊直徑0. 3-0. 5cm材料，接種于和籽球誘導(dǎo)培養(yǎng)相同的培養(yǎng)基上，在溫度22士 1°C，光照12h/ d，光照強(qiáng)度1000-1500LX的環(huán)境條件下培養(yǎng)2個月，可以擴(kuò)繁3_4倍。(7)脫毒籽球的膨大培養(yǎng)將步驟(5)培養(yǎng)的組培籽球分開，形成單個的小籽球， 大約直徑0. 3-0. 5cm，接種于籽球膨大培養(yǎng)基(MS+NAA 0. 2-0. 5mg/L+吡效隆CPPU l_4mg/ L+6%蔗糖(pH 5.8))，在22士11、15001^ 12h光照、12h黑暗條件下培養(yǎng)45天，培養(yǎng)籽球直徑可達(dá)1. 0-1. 4cm，根系在3-5條/粒，籽球重0. 7-1. 2g/粒。(8)冷藏取出步驟(6)培養(yǎng)的脫毒籽球，用清水沖洗掉培養(yǎng)液，包裹于消毒草炭中，經(jīng)3-4°C冷藏處理30-40天打破休眠。(9)移栽馴化將步驟(7)籽球取出，用2000倍阿米西達(dá)藥液浸泡籽球20分鐘， 然后定植到80-90穴的穴盤中，穴盤基質(zhì)草炭1份、蛭石1份加少量促生根的菌肥拌勻裝盤。定植后澆透水，并用地膜覆蓋穴盤。放到網(wǎng)室內(nèi)養(yǎng)護(hù)，晝溫20-25°C，夜溫10-15°C，盤土保持濕潤，定植成活后，每周噴一次1/2MS營養(yǎng)液。(10)待籽球直徑長到2cm以上，可選擇具夏季冷涼氣候的800 1000米海拔地區(qū)，在避雨和防蟲隔離條件下，3月下旬至4月中旬定植到苗床里。
權(quán)利要求
1.利用生物反應(yīng)器快速培養(yǎng)百合脫毒種球的方法，按如下步驟進(jìn)行(1)外植體滅菌和生長點(diǎn)的剝?nèi)≡?5-38°C條件下種植百合種球，經(jīng)過7-15天的培養(yǎng)，待芽長高并綻開成蓮座狀，開始采集百合莖尖，用中性肥皂水清洗3-5分鐘，自來水沖洗過夜，0. 升汞滅菌5-10分鐘，然后在70%酒精浸泡10-15秒。取出莖尖，先用加吐溫滅菌水沖洗2-3分鐘，再用滅菌水沖洗5-6遍。外植體清洗干凈后，開始剝?nèi)∩L點(diǎn)，先將莖尖的葉片全部剝除，用解剖針挑取百合莖尖生長點(diǎn)，生長點(diǎn)長度為0. 4-0. 8 (mm)，將剝?nèi)〉纳L點(diǎn)立即接種。(2)脫毒培養(yǎng)，步驟①誘導(dǎo)培養(yǎng)，剝?nèi)〉陌俸锨o尖生長點(diǎn)接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基 (1/2MS+6-BA 1. 0-2. 0mg/L+NAA0. 2-0. 5mg/L+4%蔗糖 + 瓊脂粉 6g/L (pH 5. 8))，經(jīng)過 40-60 天培養(yǎng)，生長點(diǎn)膨大成直徑2-3 (cm)的葉叢。②將葉叢切成0.5 (em)小塊，接種于含病毒唑的培養(yǎng)基(MS+NAA0. 2-0. 5mg/L+4% 蔗糖 + 病毒唑(Ribavirin) 5_10mg/L+ 瓊脂粉 5g/ L+0. 5%活性炭(pH5. 8))，經(jīng)過40-60天培養(yǎng)，形成帶球的瓶苗。(3)病毒檢測將步驟②瓶苗送到，農(nóng)業(yè)部花卉產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心(昆明)，經(jīng)檢測確認(rèn)無任何病蟲害現(xiàn)象并不帶百合無癥病毒(LSV)、黃瓜花葉病毒(CMV)和百合斑駁病毒(LMoV)等病毒，才確認(rèn)是百合脫毒種苗。(4)脫毒籽球誘導(dǎo)培養(yǎng)經(jīng)過病毒檢測，將步驟②脫毒瓶苗轉(zhuǎn)移到籽球誘導(dǎo)培養(yǎng)基 (MS+KT 2-5mg/L+NAA0. 2-0. 5mg/L+4% 蔗糖 + 瓊脂粉 5g/L+0. 5% 活性炭(pH 5.8)),在溫度 22士 1°C，光照強(qiáng)度1500Lx，光照12h/d的環(huán)境條件下培養(yǎng)40_60d，直接誘導(dǎo)出脫毒籽球。(5)增殖培養(yǎng)將步驟(4)組培籽球，切去葉片和部分基部組織后，縱切成3-4塊直徑 0. 3-0. 5cm材料，接種于和籽球誘導(dǎo)培養(yǎng)相同的培養(yǎng)基上，在溫度22士 1°C，光照12h/d，光照強(qiáng)度1000-1500LX的環(huán)境條件下培養(yǎng)2個月，可以擴(kuò)繁3_4倍。(6)脫毒籽球在生物反應(yīng)器內(nèi)液體培養(yǎng)將步驟( 培養(yǎng)的組培籽球分開，形成單個的小籽球，大約直徑0. 3-0. 5cm，然后接種于反應(yīng)器內(nèi)。液體培養(yǎng)基(MS+NAA 0. 2-0. 5mg/L+吡效隆CPPU Hmg/L+6%蔗糖(pH 5. 8))，在22士 l°C、1500Lx和2L/min通氣量條件下培養(yǎng) 45天，培養(yǎng)籽球直徑可達(dá)1. 0-1. 4cm，根系在3-5條/粒，籽球重0. 7-1. 2g/粒。(7)冷藏取出步驟(6)培養(yǎng)的脫毒籽球，用清水沖洗掉培養(yǎng)液，包裹于消毒草炭中，經(jīng) 3-4°C冷藏處理30-40天打破休眠。(8)移栽馴化將步驟(7)籽球取出，用2000倍阿米西達(dá)藥液浸泡籽球20分鐘，然后定植到80-90穴的穴簽中，穴盤基質(zhì)草炭1份、蛭石1份加少量促生根的菌肥拌勻裝盤。定植后澆透水，并用地膜覆蓋穴盤。放到網(wǎng)室內(nèi)養(yǎng)護(hù)，晝溫20-25°C，夜溫10-15°C，盤土保持濕潤，定植成活后，每周噴一次1/2MS營養(yǎng)液。(9)待籽球直徑長到2cm以上，可選擇具夏季冷涼氣候的800 1000米海拔地區(qū)，在避雨和防蟲隔離條件下，3月下旬至4月中旬定植到苗床里。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特點(diǎn)在于采用綜合脫毒技術(shù)，即將熱處理、抗病毒藥劑和莖尖培養(yǎng)相結(jié)合的方法。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特點(diǎn)在于培養(yǎng)材料為“西伯利亞”(Siberia)、“索幫”(Sorbonne)、“馬可波羅”(Marco polo)、“曼妮莎”(Manissa)、“康伽德奧”(Concad' 0)5 個品種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特點(diǎn)在于在35-38°C條件下種植百合種球，經(jīng)過7-15天的培養(yǎng)，待芽長高并綻開成蓮座狀，開始采集百合莖尖，用中性肥皂水清洗3-5分鐘，自來水沖洗過夜，0. 升汞滅菌5-10分鐘，然后在70%酒精浸泡10-15秒。取出莖尖，先用加吐溫滅菌水沖洗2-3分鐘，再用滅菌水沖洗5-6遍。外植體清洗干凈后，開始剝?nèi)∩L點(diǎn)，先將莖尖的葉片全部剝除，用解剖針挑取百合莖尖生長點(diǎn)，生長點(diǎn)長度為0. 4-0. 8 (mm)， 將剝?nèi)〉纳L點(diǎn)立即接種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特點(diǎn)在于優(yōu)化了脫毒百合種球組培培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)程序。誘導(dǎo)培養(yǎng)基(1/2MS+6-BA 1.0-2. 0mg/L+NAA0. 2-0. 5mg/L+4%蔗糖 + 瓊脂粉 6g/L)； 脫毒培養(yǎng)基(MS+NAA0. 2-0. 5mg/L+4% 蔗糖 + 病毒唑(Ribavirin) 5-lOmg/L+瓊脂粉 5g/L+0.5% 活性炭)；籽球誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)基(MS+KT 2-5mg/L+NAA0. 2-0. 5mg/L+4 %蔗糖+瓊脂粉5g/ L+0.5%活性炭)；液體培養(yǎng)基(MS+NAA 0. 2-0. 5mg/L+吡效隆 CPPU l_4mg/L+6%蔗糖)； 培養(yǎng)程序脫毒培養(yǎng)一病毒檢測一籽球誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng)一生物反應(yīng)器內(nèi)液體培養(yǎng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特點(diǎn)在于所述籽球膨大液體培養(yǎng)，采用鼓泡式可控光溫生物反應(yīng)器，反應(yīng)器運(yùn)行環(huán)境為22士 l°C、1500Lx和2L/min通氣量。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特點(diǎn)在于移栽馴化，用穴盤定植，草炭1份、蛭石1份加少量促生根的菌肥拌勻裝盤。定植后澆透水，并用地膜覆蓋穴盤。放到網(wǎng)室內(nèi)養(yǎng)護(hù)，晝溫 20-250C，夜溫10-15°C，盤土保持濕潤，定植成活后，每周噴一次1/2MS營養(yǎng)液。
全文摘要
本發(fā)明公開了百合籽球生產(chǎn)的綜合脫毒技術(shù)，即通過在35-38℃條件熱處理栽種百合種球7-15天、剝?nèi)崽幚砗蟀俸戏N球莖尖生長點(diǎn)為外植體，接種于病毒唑(Ribavirin)含量5-10mg/L的培養(yǎng)基中脫毒培養(yǎng)，用酶聯(lián)免疫吸附測定實(shí)驗(yàn)(ELISA)和RT-PCR檢測對脫毒組培苗進(jìn)行百合無癥病毒(LSV)、黃瓜花葉病毒(CMV)和百合斑駁病毒(LMoV)病毒病毒的檢測，此發(fā)明通過綜合脫毒技術(shù)確保培養(yǎng)出的百合籽球去除病毒感染，并優(yōu)化了脫毒百合種球組培培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)程序，快速培養(yǎng)得到脫毒組培籽球，屬于植物組培快繁技術(shù)領(lǐng)域和植物細(xì)胞工程領(lǐng)域技術(shù)。
文檔編號A01H4/00GK102440185SQ20101050628
公開日2012年5月9日 申請日期2010年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月14日
發(fā)明者安利清, 徐佳, 楊凱, 王春城, 王樹棟, 趙祥云 申請人:王春城, 王樹棟, 趙祥云