專(zhuān)利名稱(chēng)：在薔薇科植物多次繼代培養(yǎng)中降低出現(xiàn)玻璃化的快繁育苗方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及組織培養(yǎng)的植物快繁技術(shù)，具體屬于一種薔薇科植物多次繼代培養(yǎng)中 降低出現(xiàn)玻璃化的快繁育苗方法。
背景技術(shù)：
組織培養(yǎng)是將植物體的一部分接種在合成培養(yǎng)基上，使其按照預(yù)定目標(biāo)生長(zhǎng)發(fā)育 成新植株。由于組織培養(yǎng)周期短，增殖率高及能全年生產(chǎn)等特點(diǎn)，加上培養(yǎng)材料和試管苗的 小型化，這就可使有限的空間培養(yǎng)出大量的植物，在短期內(nèi)培養(yǎng)出大量的幼苗。因此，近年 來(lái)組織培養(yǎng)及快繁技術(shù)越來(lái)越多地應(yīng)用于種苗繁殖生產(chǎn)。此外，隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的 研究深入，離體培養(yǎng)又是細(xì)胞無(wú)融合生殖、遺傳轉(zhuǎn)化等技術(shù)的必備手段，越來(lái)越多的植物離 體培養(yǎng)獲得成功，離體培養(yǎng)技術(shù)已成為現(xiàn)代植物生物技術(shù)必不可少的研究手段，在生物學(xué) 和農(nóng)林科研以及生產(chǎn)中發(fā)揮了巨大的作用。離體培養(yǎng)能否成功，還受基因型、培養(yǎng)基類(lèi)型、激素種類(lèi)及濃度配比等多種因素影 響。培養(yǎng)過(guò)程中試管苗還易出現(xiàn)污染、褐化、玻璃化及頑拗等現(xiàn)象，嚴(yán)重阻礙著植物細(xì)胞全 能性的實(shí)現(xiàn)和離體培養(yǎng)技術(shù)的廣泛應(yīng)用。尤其是試管苗玻璃化，表現(xiàn)為葉片和嫩稍呈透明 或半透明水浸狀，不能正常生長(zhǎng)和增殖，嚴(yán)重影響了試管苗有效增殖系數(shù)，嚴(yán)重影響了試管 苗質(zhì)量，造成人、財(cái)、物的極大浪費(fèi)。一直以來(lái)，試管苗污染、褐化和玻璃化被認(rèn)為是組織培 養(yǎng)三大主要限制因素，試管苗頑拗現(xiàn)象，也逐漸受到重視。具體表現(xiàn)為植物細(xì)胞、組織和器 官在離體條件下對(duì)培養(yǎng)操作缺乏或喪失反應(yīng)性，在非洲菊、梨等多種植物材料培養(yǎng)上均有 報(bào)道，連續(xù)培養(yǎng)多代后，增殖系數(shù)大幅降低或不能增殖，在黃冠梨上則表現(xiàn)為增殖系數(shù)降 低，玻璃化程度加重，我們?cè)诙估骐x體培養(yǎng)中也發(fā)現(xiàn)有相同的趨勢(shì)。研究認(rèn)為，玻璃化苗是在芽分化啟動(dòng)后的生長(zhǎng)過(guò)程，碳、氮代謝和水分發(fā)生生理性 異常所引起的。培養(yǎng)基類(lèi)型、碳源種類(lèi)及含量、瓊脂濃度、活性炭等因素對(duì)試管苗玻璃化的 產(chǎn)生均有一定影響。對(duì)大多數(shù)植物來(lái)說(shuō)，細(xì)胞分裂素濃度過(guò)高，高溫、高濕，光照不足等因素 均易導(dǎo)致玻璃化苗產(chǎn)生。而在香石竹、梨、非洲菊等作物上還發(fā)現(xiàn)隨著繼代次數(shù)的增加，愈 傷組織和試管苗體內(nèi)積累過(guò)量的細(xì)胞分裂素，玻璃化程度不斷升高。繼代培養(yǎng)最初幾代玻 璃化苗很少，隨著繼代次數(shù)的增加，玻璃化苗的比例越來(lái)越高。針對(duì)以上玻璃化苗的產(chǎn)生原因，降低玻璃化常用措施主要有降低培養(yǎng)基中細(xì)胞 分裂素和赤霉素濃度，添加低濃度多效唑、矮壯素等生長(zhǎng)抑制物質(zhì)；控制適宜的培養(yǎng)溫度， 避免溫度過(guò)高；使用透氣性好封口材料，改善培養(yǎng)容器的痛風(fēng)換氣條件，降低容器內(nèi)濕度； 適當(dāng)增加培養(yǎng)基瓊脂濃度，降低培養(yǎng)基的水勢(shì)；增加自然光照；控制繼代次數(shù)。雖然這些措 施在一些植物培養(yǎng)過(guò)程中，對(duì)試管苗玻璃化起到較好的控制作用，但是由于不同作物出現(xiàn) 玻璃化的原因并不相同，對(duì)應(yīng)的預(yù)防措施也不一致。有些控制措施如降低細(xì)胞分裂素，增加 活性炭、瓊脂的用量，還會(huì)顯著降低增殖系數(shù)，影響增殖效果。因而，有必要針對(duì)不同作物展 不相應(yīng)的研究，形成有針對(duì)性的行之有效的防控措施。
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薔薇科植物在地球上分布極為廣泛，其中有些為重要的果樹(shù)，例如桃、李、杏、梅、 蘋(píng)果、梨、枇杷等，有些為很好的觀賞植物，如繡線菊、繡線梅、薔薇、月季、海棠、梅花、櫻花 和白鵑梅等；有些入藥。目前，本科許多植物建立起了組培快繁體系，但在快繁過(guò)程中，在蘋(píng) 果、桃、草莓、梨、月季等植物上均有玻璃化苗報(bào)道，并且有著相近的形成機(jī)制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)薔薇科植物在組培快繁體系快繁過(guò)程中均有玻璃化苗的 實(shí)際問(wèn)題提供一種新的多次繼代培養(yǎng)中降低出現(xiàn)玻璃化的快繁育苗方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種在薔薇科植物多次繼代培養(yǎng)中降低出現(xiàn)玻璃化 的快繁育苗方法，包括外植體的消毒、芽的誘導(dǎo)、繼代增殖、生根誘導(dǎo)，其特征在于在繼代 增殖過(guò)程中，相間設(shè)置試管苗復(fù)壯培養(yǎng)，然后再選取健壯的試管苗轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo) 生根，得到完整試管植株，所述的試管苗復(fù)壯采用的是不含任何外源植物激素的啟動(dòng)培養(yǎng) 基進(jìn)行培養(yǎng)，具體步驟如下(1)外植體的消毒將薔薇科帶腋芽的幼莖作為外植體，切段，消毒，無(wú)菌水沖洗；(2)芽的誘導(dǎo)將經(jīng)上述處理的外植體切成單芽莖段，接種于不含任何外源植物 激素的MS啟動(dòng)培養(yǎng)基，在25士2°C、1500 2000Lux、12 14h/d光照培養(yǎng)20 30d得到 無(wú)根苗；(3)繼代增殖將上述無(wú)根苗分別接種在MS增殖培養(yǎng)基上，在25士2°C、1500 2000LuxU2 14h/d的環(huán)境下光照培養(yǎng)20 30d，形成正常增殖的叢生試管苗，切分后重 復(fù)繼代增殖；(4)試管苗復(fù)壯培養(yǎng)經(jīng)過(guò)1 4次繼代增殖后的叢生試管苗切割分株，接種于不 含任何外源植物激素的MS啟動(dòng)培養(yǎng)基，在25士2°C，1500 2000Lux、12 14h/d光照培養(yǎng) 20 35d，獲得復(fù)壯試管苗；(5)將復(fù)壯的試管苗重新接種在MS增殖培養(yǎng)基上按照步驟3的培養(yǎng)條件，繼代培 養(yǎng)，再將叢生試管苗分株轉(zhuǎn)入生根誘導(dǎo)；或直接將至少經(jīng)過(guò)一次試管苗復(fù)壯培養(yǎng)的復(fù)壯試 管苗轉(zhuǎn)入生根誘導(dǎo)；(6)生根誘導(dǎo)從轉(zhuǎn)入生根誘導(dǎo)的試管苗中選取Icm 3cm高的健壯苗轉(zhuǎn)入生根 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在25士2°C、暗培養(yǎng)7d IOd后，再轉(zhuǎn)入到1500 2000Lux，12 14h/d光 照培養(yǎng)，25 35d，獲得完整試管植株；所述Icm 3cm高的健壯試管苗選自轉(zhuǎn)入生根誘導(dǎo) 的由叢生試管苗分株后的試管苗，或選自轉(zhuǎn)入生根誘導(dǎo)的復(fù)壯試管苗。在本發(fā)明中，所述的在繼代增殖過(guò)程中相間設(shè)置試管苗復(fù)壯培養(yǎng)是指在多次繼 代增殖過(guò)程中，至少包括一次試管苗復(fù)壯培養(yǎng)，采用兩次或兩次以上試管苗復(fù)壯培養(yǎng)時(shí)，相 鄰的試管苗復(fù)壯培養(yǎng)之間應(yīng)該設(shè)置1 4次繼代增殖培養(yǎng)。在本發(fā)明中，采用兩次或兩次以上試管苗復(fù)壯培養(yǎng)時(shí)，相鄰的試管苗復(fù)壯培養(yǎng)之 間應(yīng)該設(shè)置1 2次繼代增殖培養(yǎng)。在本發(fā)明中，所述的外植體的消毒是指對(duì)薔薇科帶腋芽的幼莖用流水沖洗Ih 2h，剪取3cm 4cm帶芽莖段，在超凈工作臺(tái)上先以75 %酒精消毒30s，再用0. 1 %升汞消毒 5min，無(wú)菌水漂洗4 5次。所述的幼莖優(yōu)選春季萌發(fā)的新梢幼莖。在本發(fā)明中，所述的不含任何外源植物激素的MS啟動(dòng)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+25 35g/L蔗糖+5. Og/L瓊脂粉；所述的MS增殖培養(yǎng)基為:MS+0. 3 0. 6mg/L6-BA+0. 1 0. 6mg/L NAA+25-35g/L蔗糖+5. Og/L瓊脂粉，pH 5. 8 ；所述的生根培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基 +0. 5 2. Omg/L IBA+20g/L 蔗糖 +5. Og/L 瓊脂粉，pH 5. 8。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(1)縮短了豆梨選優(yōu)育苗的周期。以梨樹(shù)為例，目前南方主產(chǎn)區(qū)梨主要采用豆梨品 種為砧木，都是采用實(shí)生播種后，2年后再進(jìn)行嫁接。由于種子后代基因具有高度雜合性，很 難對(duì)篩選出優(yōu)質(zhì)抗生單株進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。本發(fā)明可以大大縮短豆梨育苗周期，并且可以 選擇優(yōu)良單株或類(lèi)型進(jìn)行大規(guī)模工廠化生產(chǎn)。(2)降低了玻璃化苗比例，提高了繁殖系數(shù)。以豆梨為例，普通豆梨繁殖到能嫁接 時(shí)周期長(zhǎng)。本發(fā)明的繁殖速度快，苗生長(zhǎng)整齊，單芽繁殖30d繼代一次，且培養(yǎng)過(guò)程中玻璃 化比例低，增殖倍數(shù)可達(dá)5 11倍。(3)以莖段作為外植體，通過(guò)芽的增殖進(jìn)行快速繁殖，保證了遺傳的穩(wěn)定性，并且 取材容易，更新方便。(4)具有普遍的適用性。本發(fā)明的技術(shù)方案在薔薇科植物的快繁育苗中均能適用。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 不同配方的MS培養(yǎng)基在多次繼代培養(yǎng)中對(duì)玻璃化率的影響不含任何外源植物激素的MS啟動(dòng)培養(yǎng)基MS+25 35g/L 蔗糖 +5. Og/L 瓊脂粉。增殖培養(yǎng)基1、MS+0. 3mg/L 6-BA+25 35g/L 蔗糖 +5. Og2、MS+0. 3mg/L 6—BA+O. 2mg/L NAA+25 35g3>MS+0. 3mg/L 6-BA+O. 5mg/L NAA+25 35g4、MS+0. 6mg/L 6-BA+25 35g/L 蔗糖 +5. Og5>MS+0. 6mg/L 6-BA+O. 2mg/L NAA+25 35g6>MS+0. 6mg/L 6-BA+O. 5mg/L NAA+25 35g7, MS+0. 9mg/L 6-BA+25 35g/L 蔗糖 +5. Og8>MS+0. 9mg/L 6-BA+O. 2mg/L NAA+25 35g9>MS+0. 9mg/L 6-BA+O. 5mg/L NAA+25 35g薔薇科植物豆梨，采集豆梨春季萌發(fā)的新梢幼莖。試驗(yàn)方法將取豆梨新梢，去葉片，用流水沖洗lh_2h，剪取3cm-4cm帶芽莖段，在超凈工作臺(tái) 上進(jìn)行外植體消毒，先以75%酒精消毒30s，再用0. 升汞消毒5min，無(wú)菌水漂洗4-5次。 通過(guò)啟動(dòng)培養(yǎng)基在25士2°C、1500 2000Lux、12 14h/d光照培養(yǎng)20 30d得到無(wú)根苗備用。采用所述的9種培養(yǎng)基對(duì)所述的無(wú)根苗進(jìn)行分組平行試驗(yàn)，6-BA選用0. 3、0. 6和 0. 9mg/L三個(gè)濃度梯度，NAA設(shè)0、0. 2和0. 5mg/L三個(gè)濃度梯度，完全區(qū)組設(shè)計(jì)。具體過(guò)程
/L瓊脂粉；
/L蔗糖+5. 0g/L瓊脂粉； /L蔗糖+5. 0g/L瓊脂粉； /L瓊脂粉；
/L蔗糖+5. 0g/L瓊脂粉； /L蔗糖+5. 0g/L瓊脂粉； /L瓊脂粉；
/L蔗糖+5. 0g/L瓊脂粉； /L蔗糖+5. 0g/L瓊脂粉；
5是將無(wú)根苗接于增殖培養(yǎng)基，在25士2°C、1500 2000LUX、12 14h/d光照培養(yǎng)，20 30d 一代，連續(xù)增殖培養(yǎng)三代，每代的試驗(yàn)數(shù)據(jù)記載于表1。表 權(quán)利要求
一種在薔薇科植物多次繼代培養(yǎng)中降低出現(xiàn)玻璃化的快繁育苗方法，包括外植體的消毒、芽的誘導(dǎo)、繼代增殖、生根誘導(dǎo)，其特征在于在繼代增殖過(guò)程中，相間設(shè)置試管苗復(fù)壯培養(yǎng)，然后再選取健壯的試管苗轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，得到完整試管植株，所述的試管苗復(fù)壯采用的是不含任何外源植物激素的啟動(dòng)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，具體步驟如下a)外植體的消毒將薔薇科帶腋芽的幼莖作為外植體，切段，消毒，無(wú)菌水沖洗；b)芽的誘導(dǎo)將經(jīng)上述處理的外植體切成單芽莖段，接種于不含任何外源植物激素的MS啟動(dòng)培養(yǎng)基，在25±2℃、1500～2000Lux、12～14h/d光照培養(yǎng)20～30d得到無(wú)根苗；c)繼代增殖將上述無(wú)根苗分別接種在MS增殖培養(yǎng)基上，在25±2℃、1500～2000Lux、12～14h/d的環(huán)境下光照培養(yǎng)20～30d，形成正常增殖的叢生試管苗，切分后重復(fù)繼代增殖；d)試管苗復(fù)壯培養(yǎng)經(jīng)過(guò)1～4次繼代增殖后的叢生試管苗切割分株，接種于不含任何外源植物激素的MS啟動(dòng)培養(yǎng)基，在25±2℃，1500～2000Lux、12～14h/d光照培養(yǎng)20～35d，獲得復(fù)壯試管苗；e)將復(fù)壯的試管苗重新接種在MS增殖培養(yǎng)基上按照步驟3的培養(yǎng)條件，繼代培養(yǎng)后再將叢生試管苗分株轉(zhuǎn)入生根誘導(dǎo)；或直接將至少經(jīng)過(guò)一次試管苗復(fù)壯培養(yǎng)的復(fù)壯試管苗轉(zhuǎn)入生根誘導(dǎo)；f)生根誘導(dǎo)從轉(zhuǎn)入生根誘導(dǎo)的試管苗中選取1cm～3cm高的健壯苗轉(zhuǎn)入生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在25±2℃、暗培養(yǎng)7d～10d后，再轉(zhuǎn)入到1500～2000Lux，12～14h/d光照培養(yǎng)，25～35d，獲得完整試管植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在薔薇科植物多次繼代培養(yǎng)中，降低出現(xiàn)玻璃化的快繁育苗 方法，其特征在于所述的在繼代增殖過(guò)程中相間設(shè)置試管苗復(fù)壯培養(yǎng)是指在多次繼代 增殖過(guò)程中，至少包括一次試管苗復(fù)壯培養(yǎng)，采用兩次或兩次以上試管苗復(fù)壯培養(yǎng)時(shí)，相鄰 的試管苗復(fù)壯培養(yǎng)之間應(yīng)該設(shè)置1 4次繼代增殖培養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的在薔薇科植物多次繼代培養(yǎng)中降低出現(xiàn)玻璃化的快繁育苗 方法，其特征在于采用兩次或兩次以上試管苗復(fù)壯培養(yǎng)時(shí)，相鄰的試管苗復(fù)壯培養(yǎng)之間應(yīng) 該設(shè)置1 2次繼代增殖培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在薔薇科植物多次繼代培養(yǎng)中降低出現(xiàn)玻璃化的快繁育苗 方法，其特征在于所述的外植體的消毒是指對(duì)薔薇科帶腋芽的幼莖用流水沖洗Ih 2h， 剪取3cm 4cm帶芽莖段，在超凈工作臺(tái)上先以75%酒精消毒30s，再用0. 升汞消毒 5min，無(wú)菌水漂洗4 5次。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的在薔薇科植物多次繼代培養(yǎng)中降低出現(xiàn)玻璃化的快繁育苗 方法，其特征在于所述的幼莖是指春季萌發(fā)的新梢幼莖。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1 5之一所述的在薔薇科植物多次繼代培養(yǎng)中降低出現(xiàn)玻璃化的 快繁育苗方法，其特征在于所述的不含任何外源植物激素的MS啟動(dòng)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基 +25 35g/L蔗糖+5. Og/L瓊脂粉；所述的MS增殖培養(yǎng)基為MS+0. 3 0. 6mg/L6_BA+0. 1 0. 6mg/L NAA+25 35g/L蔗糖+5. Og/L瓊脂粉，pH 5. 8 ；所述的生根培養(yǎng)基為:1/2MS培養(yǎng) 基 +0. 5 2. Omg/L IBA+20g/L 蔗糖 +5. Og/L 瓊脂粉，pH 5. 8。全文摘要
本發(fā)明提供了一種在薔薇科植物多次繼代培養(yǎng)中降低出現(xiàn)玻璃化的快繁育苗方法，包括外植體的消毒、芽的誘導(dǎo)、繼代增殖、生根誘導(dǎo)，其特征在于在繼代增殖過(guò)程中，相間進(jìn)行試管苗復(fù)壯培養(yǎng)，然后再選取健壯的1cm～3cm高的試管苗轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，得到完整試管植株，所述的復(fù)壯培養(yǎng)采用的是不含任何外源植物激素的啟動(dòng)培養(yǎng)基壯苗。本發(fā)明的方法快速、高效，成本低，便于推廣，遺傳穩(wěn)定性好，培養(yǎng)過(guò)程中玻璃化比例低，增殖系數(shù)維持在較高水平，適用于薔薇科植物組培快繁。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101965797SQ20101051803
公開(kāi)日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2010年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月25日
發(fā)明者常有宏, 李曉剛, 楊青松, 王宏偉, 藺經(jīng) 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院