專利名稱：水稻細(xì)條斑病菌HpaG_xooc基因片段hpaG_28-126的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及水稻細(xì)條斑病菌HpaGx。。?；蚱蝖paG28_126的 應(yīng)用。
背景技術(shù)：
Hrp基因廣泛分布于革蘭氏陰性植物病原體中，其中它們是成簇的、保守的并在某 些情況下是可互換的。每個hrp基因都含有三類基因，分別編碼構(gòu)成III型分泌系統(tǒng)的因 子、被III型分泌系統(tǒng)分泌的效應(yīng)分子以及對III型效應(yīng)因子表達(dá)與分泌起調(diào)控作用的因 子。Harpins蛋白質(zhì)是III型效應(yīng)分子的重要成員，該類蛋白質(zhì)非常特別，性質(zhì)活躍而且功 能多樣。Harpins類激發(fā)子都具有相似的生化特征富含甘氨酸、不含半胱氨酸、熱穩(wěn)定、對 蛋白酶敏感，其主要共同生物效應(yīng)是在煙草等非寄主植物上誘導(dǎo)過敏反應(yīng)。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)了一種新的Harpins蛋白HpaGx。。。蛋白。HpaGx。。。蛋白均 含有一個半胱氨酸殘基，而HrpNEa和HrpZPss等其他harpin蛋白均不含有半胱氨酸殘基。 盡管HpaGx。。。蛋白的結(jié)構(gòu)同其他harpin蛋白有所不同，但他們在植物上具有相同的效應(yīng)。 HpaGxooc蛋白無論體外施用于植物還是進(jìn)行轉(zhuǎn)基因之后，HpaGxooc都能激活不同的信號途徑 而促進(jìn)植物生長、誘導(dǎo)HCD的產(chǎn)生及誘導(dǎo)植物防衛(wèi)反應(yīng)。HpaGxooc的體外噴施，能增加水稻抗 病性，促進(jìn)植物生長，并伴隨有伸展素(expansin)基因OsEXPl的表達(dá)(Ren et al，2006)。HpaGxooc蛋白編碼基因hpaGx。。。來自于水稻細(xì)菌性條斑病菌(Xanthimonas. oryzae. Oryzicola)，全長413bp，編碼137個氨基酸，分子量約為15. 18kD，它包含的兩個 GRM結(jié)構(gòu)域分別位于72到77位氨基酸和107到112位氨基酸(劉芳等，“HpaGx。。。中的富含甘 氨酸基序和半胱氨酸抑制了其在植物上的很多作用” Phytopathol96 1052-1059 (2006))； 本實驗室通過大量實驗研究獲得了水稻細(xì)條斑病菌HpaGx。。。蛋白編碼基因hpaGx。。。的9個部 分缺失片段hpaG ι-315、hpaGi—282、hpaG^ss、IipaG1H4、hpaG19—138、hpaG184—414、hpaG28—126、hpaG283—414、 hpaG25Q_282，這九個片段分別依次對應(yīng)蛋白片段HpaGH^HpaGBpHpaGimHpaGH^HpaG^p HpaG62-137、!1ρ&010—42、!1ρ&095—137、!1ρ&084—94。HpaG10_42 不會在水稻和煙草上引起過敏反 應(yīng)，但卻可以增加這些作物的抗病性，并增強水稻的生長，增加水稻的產(chǎn)量。但是，到目前為 止尚無關(guān)于HpaG1(1_42抗蟲性功能的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供水稻細(xì)條斑病菌HpaGx。。?；蚱蝖paG28_126的應(yīng)用。本發(fā)明的另一目的是提供該基因編碼的蛋白片段HpaG1(l_42的應(yīng)用。本發(fā)明的又一目的是提供一種包含基因hpaG28_126的重組表達(dá)載體及其應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案如下核苷酸序列為SEQ ID NO. 1的水稻細(xì)條斑病菌HpaGx。。。蛋白片段基因hpaG28_126在 導(dǎo)入植物獲得抗蟲害脅迫的品種中的應(yīng)用。一種基因hpaG28_126編碼的水稻細(xì)條斑病菌HpaGx。。。蛋白片段HpaG1(1_42在植物抗蟲
3害脅迫中的應(yīng)用，其氨基酸序列為SEQ ID NO. 2。一種重組表達(dá)載體，該重組表達(dá)載體由SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列與44P啟 動子聯(lián)合形成表達(dá)組合和HYG基因被替換為manA基因的pCAMBIA1300載體組成。所述的轉(zhuǎn)基因植物為轉(zhuǎn)基因小麥。所述的重組表達(dá)載體在提高轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物抗病性中的應(yīng)用。所述的重組表達(dá)載體在提高轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物抗病性和產(chǎn)量中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果由水稻細(xì)條斑病菌HpaGx。。。基因片段hpaG28_126編碼的蛋白片 段HpaG1(1_42能夠增強一些抗蚜蟲相關(guān)基因的表達(dá)，擬南芥噴施HrpG1(1_42相對于噴施EVP，蚜 蟲數(shù)量明顯減少；而且噴施HrpG1(1_42后相對于噴施EVP能明顯減少小菜蛾對擬南芥的取食 量，因此水稻細(xì)條斑病菌HpaGx。。。蛋白片段HpaG1(1_42、其編碼基因hpaG28_126可在導(dǎo)入植物獲 得抗病蟲害脅迫的品種中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的含水稻細(xì)條斑病菌HpaGx。。?；蚱蝖paG28_126的重組表達(dá)載體，能 夠明顯提高小麥的產(chǎn)量，增強小麥的抗病能力。


圖lhpaG28_126基因的酶切圖譜。圖2HpaG1Q_42純化蛋白電泳圖。圖3噴施HrpG1Q_42后抗蚜蟲效果。圖4HrpG1Q_42對生長相關(guān)基因的影響。
圖5噴施HrpG1(1_42后抗對小菜蛾取食影響。圖6重組載體中轉(zhuǎn)基因單元結(jié)構(gòu)示意圖，manA: :6his 帶有6個組氨酸標(biāo)簽的磷酸甘露糖轉(zhuǎn)移酶基因；44P :Myb44基因啟 動子。圖 7pCAMBIA1300: :ManA: :44P 載體酶切驗證，其中1300::44p*pCAMBIA1300::ManA::44P，M*marker。圖 8pCAMBIA1300: :ManA: :44P: :hpaG28_126: :6His 的酶切圖譜，其中1300: :hrf99 為 pCAMBIA1300: :ManA: :44P: :hpaG28_126: :6His，M 為 marker。
具體實施例方式實施例lhpaG28_126基因的獲得方法水稻條斑病菌基因組DNA提取取Iml過夜培養(yǎng)的水稻條斑病菌培養(yǎng)物于 1.5mlEP管中，室溫8000rpm離心5min，棄上清，沉淀重新懸浮于Iml TE(pH8. 0)中，加 入6μ1 50mg/ml的溶菌酶(生興，中國)，37°C作用2h。再加2mol/L NaCl 50μ 1,10% SDSllOy l,20mg/ml的蛋白酶K(生興，中國)3 μ 1，50°C作用3h (此時菌液應(yīng)為透明粘稠液 體)。菌液均分到兩個1.5ml EP管，加等體積的酚氯仿異戊醇(25 24 1)，混勻，室 溫放置5-lOmin。12000rpm離心lOmin，進(jìn)行抽提，抽提兩次，加0. 6倍體積的異丙醇，混勻， 室溫放置lOmin。12000rpm離心lOmin，沉淀用75%的乙醇洗滌，抽干后，溶于50 μ 1 ddH20 中作PCR模板用。PCR擴增hpaG28_126基因引物序列為上游引物SEQ ID NO. 3，下游引物:SEQ
4IDN0. 4 ；在上游引物的5，端加入EcoRI酶切位點，在下游引物的5，端加入HindIII酶切位 點，在下游引物中加入兩個連續(xù)的終止密碼子(CTA和TTA)。利用上述引物進(jìn)行PCR，25 μ L 反應(yīng)體系為10XEx taq buffer 2. 5 μ L，dNTP 2. O μ L，Mg2+L 5 μ L，上、下游引物各 1 μ L， Ex taq 0. 2 μ L，水稻條斑病菌基因組DNA 1 μ L, ddH2015. 8 μ L。反應(yīng)程序為95°C 3min, 95°C 50sec，58°C 50sec，72°C lmin，72°C IOmin0 PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化回收后，連接到 pMD 19-T Simple Vector載體(Takara，Japan)上，使用EcoRI和HindIII進(jìn)行雙酶切，獲得酶切圖 譜如圖1，重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 α (Takara, Japan)，送上海invitrogen公 司測序。實施例2水稻細(xì)條斑病菌HpaGx。。。蛋白片段HpaG1(1_42的獲得方法使用EcoRI和HindiII對實施例1中構(gòu)建的插入hpaG28_126基因片段的pMD 19-TSimple Vector載體進(jìn)行雙酶切，獲得hpaG28_126基因片段，以正確方向插入到 pET30a(+) (invitrogen USA)載體中，重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (Takara，Japan)。菌體接 種于LB液體培養(yǎng)基中，在28°C條件下，200rpm振蕩培養(yǎng)18-20小時，用分光光度計測定細(xì) 菌濃度，要求0D620彡2. O。此時加入終濃度為0. 4mM的IPTG(生興中國)誘導(dǎo)培養(yǎng)隔夜， 進(jìn)行菌體收集。同樣的方法轉(zhuǎn)化pET30a(+)空載體，產(chǎn)生的無活性蛋白溶液(EVP)作為對 照。蛋白按照常規(guī)方法提取(Bauer et al,1995 ；Liu et al，2006)。5，OOOXg離心15分 鐘以收集菌體，重懸于二十分之一或十分之一體積的咪唑結(jié)合緩沖液中。加入終濃度1 μ 1/ ml 的 Ready-Lyse (Epicenter Biotech. , Rockford, IL, USA)和 100 μ g/ml 的蛋白酶抑制劑 苯甲基磺酰氟(Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride，PMSF)，冰上放置10分鐘。菌液用超聲 波進(jìn)行破碎，在冰浴的條件下破碎菌液至澄清透明。再用4°C，10，OOOg離心20分鐘去沉淀。 上清液在沸水浴中煮10分鐘，12，000 X g，離心20分鐘，去除沉淀所得的上清液于_20°C冷 凍過夜，解凍后離心(12，OOOXg，20分鐘)，獲得新的上清液即為不含細(xì)胞的蛋白制備液。 蛋白使用 HisTrap HP Kit (Amersham Biosci Corp, Piscataway, NJ, USA)的柱子進(jìn)行鎳 柱親合層析純化。鎳柱用IOmL咪唑結(jié)合緩沖液先結(jié)合，注意濃度與溶解蛋白的咪唑結(jié)合緩 沖液一致。使用DANStar軟件預(yù)測蛋白質(zhì)的分子量，然后利用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)確 證蛋白分子大小如圖2。實施例3HrpG1(1_42蛋白片段對蚜蟲的抗性HrpG10^42蛋白使用鎳柱親合層析純化后，按照(Dong, H.，Delaney，T. P.，Bauer, D. W. ,and Beer,S. V. 1999. Harpin induces disease resistance in Arabidopsis through thesystemic acquired resistance pathway mediated by salicylic acid and the NIMl gene. Plant J. 20 :207_215.)的方法確定濃度，蛋白配制成12 μ g/ml的濃度，并加入 0. 03Silwet-77 (Momentive Performance Materials Inc. ,China Branch, Beijing)噴施生長30天的擬南芥，以噴施EVP做對照。每株擬南芥接種1齡蚜蟲15頭于 于心葉，接種后使用網(wǎng)罩套起，每天記錄葉片蚜蟲的數(shù)量，連續(xù)記錄1周，每個實驗做10個 重復(fù)。如圖3，從圖3可以看出噴施HrpG1Q_42相對于噴施EVP的蚜蟲數(shù)量明顯減少。實施例4HrpG1(1_42蛋白片段誘導(dǎo)抗蚜蟲相關(guān)基因表達(dá)將擬南芥培養(yǎng)30天，然后噴施12 μ g/ml HrpG10^42 (實施例3制備)和EVP 1天后， 接種蚜蟲，分別于0天，3天取樣，取植株完全展開的頂部嫩葉lOOmg，液氮冷凍研磨；將勻 漿轉(zhuǎn)移至2mL Eppendorf管中，加入Trizol (Takara，Japan)溶劑lmL，混勻，室溫放置5分鐘；加入氯仿0. 2mL，旋渦振蕩器15秒；室溫放置2-15分鐘；4°C, 12000rpm離心15分鐘； 將上層無色的水相轉(zhuǎn)移至新的Eppendorf管中；加入0. 5mL異丙醇，顛倒幾次混勻；室溫放 置5-10分鐘，使RNA沉淀；4°C，12，OOOrpm離心15分鐘；加入ImL 75%乙醇沖洗或保存； 4°C, 12, OOOrpm離心15分鐘，棄上清；室溫干燥去除多余乙醇；加入適量的DEPC處理的無 RNase超純水；在RNA溶液中加入無RNAase的DNase，至終濃度為0. IU/ μ L，37°C處理0. 5 小時；苯酚/氯仿/異戊醇(25 24 1)抽提；4°C，12，OOOrpm離心15分鐘；取上層水 相加入2倍體積的無水乙醇，輕輕混勻，-20°C過夜；4°C，12，OOOrpm離心20分鐘，棄上清； 70%冰乙醇洗沉淀，室溫干燥后用DEPC處理過的超純水溶解RNA。RT-PCR從得到的總RNA 中擴增抗蚜蟲相關(guān)基因AtEXPU AtEXP2、Hell、PDFl. 2、EFl α，PCR反應(yīng)體系為25 μ L反 應(yīng)體系為10XEx taq buffer 2. 5 μ L, dNTP 2. 0 μ L，Mg2+L 5 μ L，上、下游引物各 1 μ L，Ex taq 0. 2 μ L，基因組 DNA 1 μ L，ddH2015. 8 μ L。反應(yīng)程序95°C 3min，95°C 50s，58°C 50s， 72°C 50s, 72°C lOmin，30cycles?；駻tEXPl的PCR擴增上、下游引物序列分別為SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6;基因AtEXP2的PCR擴增上、下游引物序列分別為SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8 ；基因Hell的PCR擴增上、下游引物序列分別為SEQ ID N0. 9，SEQ ID NO. 10 ；基因 PDFl. 2的PCR擴增上、下游引物序列分別為SEQ ID N0. 11，SEQ ID NO. 12 ；基因EFl α的 PCR擴增上、下游引物序列分別為SEQ ID Ν0. 13, SEQ ID NO. 14。擴增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電 泳，如圖4所示在噴施HrpG1Q_42下AtEXPl，AtEXP2，Hel 1，PDFl. 2這三個基因明顯增強表達(dá)， 表明HrpG1(l_42可以增強一些抗蚜蟲相關(guān)基因的表達(dá)。實施例5HrpG10_42蛋白片段對小菜蛾取食影響分別用EVP和12 μ g/ml hrpG10_42 (實施例3制備)處理擬南芥3天后，接種2頭 孵育72h的小菜蛾幼蟲(2齡，2-3mm)到擬南芥新葉上，每天觀察記錄擬南芥的被取食情況。 如圖5所示，噴施HrpG10-42后相對于噴施EVP明顯減少了小菜蛾對擬南芥的取食量。實施例6轉(zhuǎn)基因單元的構(gòu)建使用 pN0V2820 (Syngenta, Research Triangle Park, North Carolina)載體 上的PMI (ManA)基因替換pCAMBIA1300 (購自CAMBIA公司)載體上的HYG基因成為 PCAMBIA1300: ManA (此過程有金思特公司完成)。 44P啟動子的獲得1)擬南芥基因組DNA的獲得液氮研磨0. 1 g葉片，加 ImlCTAB(國藥中國)(2% )，65°C水浴lh，隔10-20min，混勻樣品一次加入等體積苯酚，混 勻，室溫，7000rpm，IOmin取上清，加入等體積氯仿/異丙醇(24 1)，混勻，4°C，lOOOOrpm， IOmin取上清，重復(fù)上步，再次抽提，至兩液面無雜質(zhì)，取上清，加入1/10體積預(yù)冷的3M NaAC(pH7. 0)及2倍體積的冷無水乙醇，緩慢搖勻，_20°C過夜。4°C，12000rpm，15min，棄 上清12000rpm，15min，分別用75 %和95 %冷無水乙醇洗滌一次，之后，風(fēng)干DNA。加入 100 μ LddH2O 及 0. 5 μ LRNase(10y g/ml)，37°C，30minl %膠檢測，-20°C保存。
2)PCR擴增44P 設(shè)計上游引物SEQ ID N0. 15，和下游引物SEQ ID N0. 16，在上 游引物的5’端加入EcoRI酶切位點，在下游引物的5’端加入SacI酶切位點。以上述引 物進(jìn)行 PCR，25 μ L 反應(yīng)體系為10 X Ex taq buffer 2. 5 μ L, dNTP 2. 0 μ L，Mg2+1. 5 μ L， 上、下游引物各lyL，Ex taq 0. 2 μ L，擬南芥基因組DNA 1 μ L，ddH2015. 8 μ L。反應(yīng) 程序如下為 95 °C 3min，95°C 50sec，58°C 50sec，72°C lmin，72°C IOmin0 PCR 產(chǎn)物經(jīng)純 化回收后，進(jìn)行EcoRI/SacI雙酶切得到44P啟動子，插入到pCAMBIA1300: :ManA，成為PCAMBIA1300: :ManA: :44P。酶切驗證如圖 7，其中 1300: 44P 為 pCAMBIA1300 :ManA: :44P, M為marker。送上海invitrogen公司測序。以實施例1構(gòu)建的插入hpaG28_126基因片段的pMD 19-T Simple Vector載體 為模板，利用上游引物SEQ ID NO. 17、下游引物SEQ ID NO. 18擴增hpaG28_126基因片段，在上 游引物的5’端加入SacI酶切位點，在下游引物的5’端加入BamHI酶切位點，并在下游引物 引入6個GTG位點，得到含有6個His標(biāo)記的hpaG28_126基因片段。PCR反應(yīng)體系按照實施例 1。將擴增得到的基因 hpaG28_126 連接到 pMD 19-T Simple Vector 載體(Takara，Japan)，將 該重組載體命名為T: :hrf28_126，重組載體T: :hrf28_126轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α中，測序正確后， 然后將載體 PCAMBIA1300: :ManA: :44P 用 Sac I/BamHI 酶切，將載體 T: :hrf28_126 也用 SacI/ BamHI 酶切得到 hpaG28_126 片段，hpaG28_126 片段與 pCAMBIA1300: :ManA: :44P 載體連接，得到 表達(dá)載體 pCAMBIA1300: :ManA: :44P: :hpaG28_126: :6His，將載體轉(zhuǎn)入 DH5 α，圖 6 為 pCAMBIA 1300: :ManA: :44P: :hpaG28_126: :6His 表達(dá)載體圖譜；圖 7 中為 pCAMBIA1300: :ManA: :44P 的 酶切圖譜，其中 1300: :44p 為 pCAMBIA1300: :ManA: :44P ；圖 8 為 pCAMBIA1300: :ManA: :44P :hpaG28_126: :6His 的酶切圖譜。其中 1300: :hrf99 為 pCAMBIA1300: :ManA: :44P: :hpaG28_12 6: : 6Hi s, M 為 marker。實施例7基因槍微粒子彈的準(zhǔn)備提取實施例6 中的轉(zhuǎn)基因載體單元 pCAMBIA1300: :ManA: :44P: :hpaG28_126: :6His 和空載體 PCAMBIA1300: :ManA: :44P。稱金粉30mg(BIA_RAD公司美國)，溶于500 μ 1無水酒精，離心2次，加 入500μ1(ΜΗ20，金粉濃度為60μβ/μ1，置-20°c冰箱備用。配備2.5M Cacl2，稱取 5. 549gCacl2 — 20mlddH20，抽濾或高壓滅菌，置-20°C冰箱備用。配備0. IM亞精胺，稱取 145. 2mg亞精胺加入20mlddH20，抽濾或高壓滅菌，置-20°C冰箱備用。取15 μ 1金粉在1. 5ml離心管，1400rpm離心30秒，去掉上清液，加Iml無菌水，離 心5分鐘，去掉上清液，分別加實施例6中構(gòu)建的載體pCAMBIA1300: :ManA: :44P: :hpaG28_12 6: :6His 載體和空載體 pCAMBIA1300: :ManA: :44P 25 μ 1 (濃度均為 1 μ g/μ 1)+220 μ 1 ddH20+250 μ 1 2. 5Μ CaCl2 (sigma USA)+50 μ 1 0. IM 亞精胺(sigma USA)渦旋10分鐘(最好在_4°C )，離心5分鐘，去掉上清液，加600 μ 1無水酒精，離心 1分鐘，去掉酒精，加250 μ 1酒精懸浮。實施例8HpaG1(1_42轉(zhuǎn)基因小麥產(chǎn)生過程采集開花后12-14天的未成熟種子(溫室條件下，隨溫度的變化時間有所變化，幼 胚直徑約1mm，處于從透明向半透明過渡時期)，70%乙醇消毒2分鐘，0. 1 %升汞消毒15-20 分鐘，無菌水沖洗4-5次，于超凈工作臺上用解剖刀取出幼胚，盾片朝上接種于MSY愈傷誘 導(dǎo)培養(yǎng)基(SD2，改良MS培養(yǎng)基都可以)，25 °C黑暗培養(yǎng)。培養(yǎng)6-7天，挑選質(zhì)地優(yōu)良的幼胚愈傷組織，集中于含0. 4M滲透壓培養(yǎng)基(0. 2M 甘露醇+0. 2M山梨醇)的培養(yǎng)皿中心，直徑為2. 5cm,大約50個幼胚，滲透壓預(yù)處理4小時。經(jīng)過滲透壓預(yù)處理的幼胚愈傷組織，使用實施例7中制得的兩種微粒子彈，使用 BIA-RAD公司生產(chǎn)的PDS 1000/He基因槍進(jìn)行轟擊，(psill00，Hg 27.5)轟擊后的愈傷組織
7在滲透壓培養(yǎng)基上后處理16小時。將愈傷組織轉(zhuǎn)移到MSY培養(yǎng)基(SD2或改良MS培養(yǎng)基)恢復(fù)培養(yǎng)2周。恢復(fù)培養(yǎng) 后的愈傷組織轉(zhuǎn)移到1/2MS附加NAAlmg/L，KTlmg/L(或ZT 5mg/L)的分化篩選培養(yǎng)基，篩 選劑甘露糖(西亞試劑中國)的濃度為10g/L，24-26°C光照培養(yǎng)。待愈傷組織分化小苗后轉(zhuǎn)移到1/2MS無激素的生長篩選培養(yǎng)基上，篩選劑甘露糖 的濃度為10g/L，24-26°C光照培養(yǎng)。如果轉(zhuǎn)化苗數(shù)量較多，可再篩選一次。經(jīng)過2-3次篩選的轉(zhuǎn)化小苗轉(zhuǎn)移到V2MS附加IAAO. 5mg/L (生興中國)和MET (多 效矬)(生興中國)的壯苗培養(yǎng)基上壯苗，待苗高7-8cm且根系發(fā)達(dá)的轉(zhuǎn)化苗準(zhǔn)備移栽。為了提高移栽成活率，小麥組培苗移栽需要一個低溫保濕階段，先把小苗移栽在 紙營養(yǎng)缽中，放在光照培養(yǎng)箱或可控溫室中，溫度控制在15°C左右，覆蓋塑料布保濕，注意 適當(dāng)通氣以免長霉，還苗后移到溫室。實施例9HpaG1(1_42轉(zhuǎn)基因小麥和轉(zhuǎn)空載體轉(zhuǎn)基因系產(chǎn)量比較各采集成熟的小麥種子1000粒，比較其重量，重復(fù)5次，發(fā)現(xiàn)HpaG1Q_42轉(zhuǎn)基因小麥 千粒重高于空載體轉(zhuǎn)基因系10%。實施例10HpaG1(1_42轉(zhuǎn)基因小麥和空載體轉(zhuǎn)基因系抗赤霉病比較用接種針挑去赤霉菌菌絲少許，置于綠豆湯培養(yǎng)液中25-28°C振蕩培養(yǎng)4-7天 檢測濃度。取少量孢子懸浮液于一無菌瓶中，將赤霉孢子的濃度用無菌水調(diào)節(jié)到10(目 鏡)X20(物鏡)的視野下20-30個孢子左右為宜。在小麥齊穗期至始花期，選擇尚未開花 的麥穗，使用配好的孢子液，針注接種。21天后計算病粒數(shù)。發(fā)現(xiàn)HpaG1(l_42轉(zhuǎn)基因小麥較空 載體轉(zhuǎn)基因系具有明顯少的病粒數(shù)。
權(quán)利要求
核苷酸序列為SEQ ID NO.1的水稻細(xì)條斑病菌HpaGxooc基因片段hpaG28 126在導(dǎo)入植物獲得抗蟲害脅迫的品種中的應(yīng)用。
2.—種權(quán)利要求1所述的基因hpaG28_126編碼的水稻細(xì)條斑病菌HpaGx。。。蛋白片段 HpaG1(1_42在植物抗蟲害脅迫中的應(yīng)用，其氨基酸序列為SEQ ID NO. 2。
3.一種重組表達(dá)載體，其特征在于該重組表達(dá)載體由SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列 與44P啟動子聯(lián)合形成表達(dá)組合和hyg基因被替換為manA基因的pCAMBIA1300載體組成。
4.權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體在提高轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物抗病性和/或產(chǎn)量和/或抗蟲 害脅迫中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述的農(nóng)作物為小麥。
6.權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體在提高轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物抗病性中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體在提高轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物抗病性和產(chǎn)量中的應(yīng)用。全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，公開了水稻細(xì)條斑病菌HpaGxooc基因片段hpaG28-126的應(yīng)用。本發(fā)明提供了水稻細(xì)條斑病菌HpaGxooc基因片段hpaG28-126在導(dǎo)入植物獲得抗蟲害脅迫的品種中的應(yīng)用。以及該基因編碼的水稻細(xì)條斑病菌HpaGxooc蛋白片段HpaG10-42在植物抗蟲害脅迫中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種重組表達(dá)載體，該重組表達(dá)載體由hpaG28-126基因片段與44P啟動子聯(lián)合形成表達(dá)組合和hyg基因被替換為manA基因的pCAMBIA1300載體組成。該重組載體能夠明顯提高小麥的產(chǎn)量，增強小麥的抗病能力。
文檔編號A01H5/00GK101974540SQ201010528319
公開日2011年2月16日 申請日期2010年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月2日
發(fā)明者劉昌來, 李小杰, 王穎, 董漢松, 蔡洪生, 鄒保紅, 錢君, 陳蕾, 龍菊英 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)