專利名稱：一種花生體胚誘導(dǎo)及植株再生的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及花生培育方法，具體地說，是涉及一種花生體胚誘導(dǎo)及植株再生的方 法。
背景技術(shù)：
花生是我國重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物，在農(nóng)業(yè)乃至整個(gè)國民經(jīng)濟(jì)中均具有重要 地位。然而，由于花生栽培種遺傳基礎(chǔ)狹窄、抗逆性差，尤其易感多種病蟲害，嚴(yán)重影響其產(chǎn) 量和質(zhì)量，盡管育種家們試圖培育抗逆品種，但由于花生栽培種中缺乏高抗性品種資源，抗 病品種的選育一直是一個(gè)難以解決的問題。目前，抗性基因的遺傳轉(zhuǎn)化及離體誘變育種受 到國內(nèi)外廣泛重視。而能否將基因轉(zhuǎn)化和離體誘變成功應(yīng)用于花生育種，關(guān)鍵依賴于花生 組織培養(yǎng)高效植株再生體系的建立。近年來，國內(nèi)外研究者開展了利用花生的不同外植體(把由活植物體上切取下來 以進(jìn)行培養(yǎng)的那部分組織或器官叫做外植體)離體培養(yǎng)再生植株的研究，但多數(shù)試驗(yàn)是通 過器官發(fā)生途徑再生植株，即進(jìn)行初始培養(yǎng)的外植體經(jīng)脫分化后，細(xì)胞分裂形成愈傷組織， 然后細(xì)胞再度分化，進(jìn)一步組織分化(即形成擬分生組織和維管組織結(jié)節(jié))，再進(jìn)行器官分 化，形成不定芽，由不定芽可形成完整再生植株。通過器官發(fā)生途徑再生植株，目前再生率 較高的是2009年本申請人在《中國油料作物學(xué)報(bào)》上發(fā)表的論文《花生組織培養(yǎng)及高頻率 植株再生》中公開的再生率最高可達(dá)到85%左右，然而由于通過器官發(fā)生途徑再生植株一 般不定芽起源于多個(gè)細(xì)胞，應(yīng)用于遺傳轉(zhuǎn)化和離體誘變時(shí)，再生植株會(huì)形成嵌合性植株。利用花生不同外植體離體培養(yǎng)再生植株的研究中，有少數(shù)試驗(yàn)是通過體細(xì)胞胚胎 發(fā)生途徑再生植株的，體細(xì)胞胚胎發(fā)生是指在離體培養(yǎng)條件下，體細(xì)胞通過與合子胚發(fā)生 相似的途徑形成類似合子胚結(jié)構(gòu)的過程。通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑再生植株，體胚一般起 源于一個(gè)胚性細(xì)胞，胚性細(xì)胞的第一次不均等分裂形成兩個(gè)子細(xì)胞，處于上部的頂細(xì)胞繼 續(xù)發(fā)育為多細(xì)胞原胚，而處于下部的基細(xì)胞則形成胚柄類似物。這種再生方法應(yīng)用于遺傳 轉(zhuǎn)化和離體誘變時(shí)，可避免再生植株的嵌合性，但在現(xiàn)有利用花生體胚發(fā)生途徑再生植株 的研究中，一般是采用花生種子在培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 7d后發(fā)芽形成的幼葉進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)， 體胚誘導(dǎo)率和再生率不高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種花生體胚誘導(dǎo)及植株再生的方法，可以解決現(xiàn)有技術(shù)存在的花生 體胚誘導(dǎo)及植株再生的方法植株再生頻率低的問題。為達(dá)到解決上述技術(shù)問題的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)一種花生體胚誘導(dǎo)及植株再生的方法，包括如下步驟，(1)制備體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基選取MSB5為基本培養(yǎng)基，在所述基本培養(yǎng)基中添加2， 4-D制成體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基，2，4-D的添加量為每升所述基本培養(yǎng)基中添加5 IOmg ；(2)選擇外植體材料將花生種子去子葉后的種胚進(jìn)行表面消毒，取胚小葉為外植體材料；(3)按以下步驟進(jìn)行體胚誘導(dǎo)及植株再生a將花生種子去子葉后的種胚外植體進(jìn)行表面消毒，然后用無菌水漂洗后，置于裝 有無菌水的廣口瓶中浸泡12 16h ；b取出經(jīng)表面消毒浸泡好的種胚，置于無菌培養(yǎng)皿中分離種胚的胚小葉，接種到所 述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，25 30d后形成體胚；c將形成有體胚的外植體轉(zhuǎn)移至體胚萌發(fā)培養(yǎng)基上進(jìn)行萌發(fā)培養(yǎng)，每隔25 30d 繼代一次，繼代兩次后得到再生苗；所述體胚萌發(fā)培養(yǎng)基是由選取MSB5為基本培養(yǎng)基，在所 述基本培養(yǎng)基中添加BAP制成，BAP的添加量為每升所述基本培養(yǎng)基中添加4mg ；d當(dāng)再生苗生長至2 3cm時(shí)，從基部切下，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，獲得完 整植株；所述生根培養(yǎng)基是由選取1/2MSB5為基本培養(yǎng)基，在所述1/2MSB5基本培養(yǎng)基中添 加NAA制成，NAA的添加量為每升所述基本培養(yǎng)基中添加0. 2 0. 5mg。本發(fā)明花生體胚誘導(dǎo)及植株再生的方法，其中所述培養(yǎng)基均在培養(yǎng)室溫度為 24 26°C、光照強(qiáng)度為2500 3500Lx、光照時(shí)間為10 15h/d的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。本發(fā)明花生體胚誘導(dǎo)及植株再生的方法，其中所述花生種胚的表面消毒采用75% 的酒精浸泡15 25s，再用0. 的升汞浸泡。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是1、本發(fā)明以花生成熟種子胚的胚小葉為外植體，在每升基本培養(yǎng)基中添加5 10mg2，4-D(氯化苯氧乙酸類除草劑)所形成的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上及在每升基本培養(yǎng)基中添加 4mg BAP (芐基氨基嘌呤)所形成的體胚萌發(fā)培養(yǎng)基上，進(jìn)行體胚誘導(dǎo)和萌發(fā)，經(jīng)試驗(yàn)表明， 體胚誘導(dǎo)率多數(shù)品種達(dá)到90%以上，每個(gè)外植體形成體胚數(shù)在4 5個(gè)以上，有的在10個(gè) 甚至20個(gè)以上，從而每個(gè)外植體再生植株數(shù)也多，再生率高。2、本發(fā)明以花生成熟種子作為試驗(yàn)材料可不受季節(jié)限制，常年可以進(jìn)行試驗(yàn)；通 過胚胎發(fā)生途徑再生植株，體細(xì)胞胚起源于一個(gè)細(xì)胞，再生的方法應(yīng)用于遺傳轉(zhuǎn)化和離體 誘變時(shí)，可避免再生植株的嵌合性。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1一種花生體胚誘導(dǎo)及植株再生的方法，包括如下步驟1制備體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基選取MSB5 (MS無機(jī)鹽+B5有機(jī)成分)為基本培養(yǎng)基，添加濃度為3%的蔗糖、濃度 為0. 8%的瓊脂，將MSB5培養(yǎng)基的pH值調(diào)至5. 8，在培養(yǎng)室溫度為24 26°C、光照強(qiáng)度為 2500 3000Lx、每日光照為13h的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，在此MSB5培養(yǎng)基中添加2，4_D形成體 胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基，2，4-D的添加量為每升MSB5培養(yǎng)基中添加5mg，2，4-D是一種氯化苯氧乙酸 類除草劑，也可用作植物生長調(diào)節(jié)，是用于誘導(dǎo)愈傷組織形成的常用生長素。2選擇外植體材料供試材料為由山東省花生研究所(原中國農(nóng)科院花生研究所)選育推廣的“花育” 系列新花生品種中的花育20號(hào)、花育22號(hào)、花育23號(hào)和花育25號(hào)，以及由青島農(nóng)業(yè)大學(xué) (原萊陽農(nóng)學(xué)院)選育推廣的新花生品種魯花11號(hào)，選取各品種中粒大飽滿的成熟花生種子去子葉后的種胚作為試驗(yàn)材料。3體胚誘導(dǎo)及植株再生(1)將種胚用75%的酒精浸泡15 25s，再用0. 的升汞(氯化高汞，俗稱升 汞)浸泡進(jìn)行表面消毒，浸泡時(shí)間為IOmin左右，用無菌水漂洗5次后，置于裝有無菌水的 廣口瓶中浸泡12 16h，備用。(2)在超凈工作臺(tái)中取出經(jīng)表面消毒浸泡好的種胚，置于無菌培養(yǎng)皿中分離種胚 的胚小葉，接種到在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，胚小葉外植體為乳白色，當(dāng)在誘導(dǎo)培養(yǎng)基 上培養(yǎng)4d后顏色逐漸變黃，7d后胚小葉長大展開向上卷曲呈黃綠色，12 17d后外植體開 始形成體胚，培養(yǎng)25 30d后，各花生品種均形成體胚。統(tǒng)計(jì)體胚形成結(jié)果見表1。表1濃度為5mg/L的2，4_D對不同花生品種胚小葉胚胎發(fā)生的影響
2，4-D 濃 度(mg/L)體胚形成率(％)5花育2 0號(hào)花育22號(hào)花育2 3號(hào)花育2 5號(hào)魯花11號(hào)78. 972. 176. 154. 574. 1(3)將誘導(dǎo)培養(yǎng)基上形成體胚的外植體轉(zhuǎn)接到體胚萌發(fā)培養(yǎng)基上，體胚萌發(fā)培養(yǎng) 基也是選取MSB5為基本培養(yǎng)基，在MSB5培養(yǎng)基中添加BAP形成，BAP的添加量為每升MSB5 培養(yǎng)基中添加4mg，誘導(dǎo)體胚萌發(fā)成苗，每隔25 30d繼代一次，繼代兩次得到再生苗。50 天后統(tǒng)計(jì)體胚萌發(fā)結(jié)果見表2。表2濃度為4mg/L的BAP對不同花生品種胚小葉體胚萌發(fā)的影響
BAP濃度 (mg/L)成苗率(%)4花育20號(hào)花育22號(hào)花育2 3號(hào)花育2 5號(hào)魯花11號(hào)85. 787. 572. 593. 386. 1(4)當(dāng)再生苗伸長至2 3cm時(shí)，從再生苗基部切下，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生 根，獲得完整植株。生根培養(yǎng)基是選取1/2MSB5為基本培養(yǎng)基，在1/2MSB5培養(yǎng)基中添加NAA 形成，NAA的添加量為每升Iz^MSB5培養(yǎng)基中添加0. 2 0. 5mg。實(shí)施例2一種花生體胚誘導(dǎo)及植株再生的方法，包括如下步驟1制備體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基選取MSB5為基本培養(yǎng)基，添加濃度為3%的蔗糖，濃度為0. 8%的瓊脂，將MSB5培 養(yǎng)基的PH值調(diào)至5. 8，在培養(yǎng)室溫度為24 26°C、光照強(qiáng)度為2500 3000Lx、每日光照為 10 15h的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，在此MSB5培養(yǎng)基中添加2，4-D形成體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基，2，4-D的 添加量為每升MSB5培養(yǎng)基中添加10mg。2選擇外植體材料
供試材料為由山東省花生研究所(原中國農(nóng)科院花生研究所)選育推廣的“花育” 系列新花生品種中的花育20號(hào)、花育22號(hào)、花育23號(hào)和花育25號(hào)，以及由青島農(nóng)業(yè)大學(xué) (原萊陽農(nóng)學(xué)院)選育推廣的新花生品種魯花11號(hào)，選取各品種中粒大飽滿的成熟花生種 子去子葉后的種胚作為試驗(yàn)材料。
3體胚誘導(dǎo)及植株再生(1)將種胚用75%的酒精浸泡15 25s，再用0. 的升汞(氯化高汞，俗稱升 汞)浸泡進(jìn)行表面消毒，浸泡時(shí)間為IOmin左右，用無菌水漂洗5次后，置于裝有無菌水的 廣口瓶中浸泡1216h，備用。(2)在超凈工作臺(tái)中取出經(jīng)表面消毒浸泡好的種胚，置于無菌培養(yǎng)皿中分離種胚 的胚小葉，接種到在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)25 30d后，各花生品種均形成體 胚。統(tǒng)計(jì)體胚形成結(jié)果見表3。表3濃度為10mg/L的2，4-D對不同花生品種胚小葉胚胎發(fā)生的影響
權(quán)利要求
一種花生體胚誘導(dǎo)及植株再生的方法，其特征在于包括如下步驟，(1)制備體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基選取MSB5為基本培養(yǎng)基，在所述基本培養(yǎng)基中添加2，4 D制成體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基，2，4 D的添加量為每升所述基本培養(yǎng)基中添加5～10mg；(2)選擇外植體材料將花生種子去子葉后的種胚表面消毒，取胚小葉為外植體材料；(3)按以下步驟進(jìn)行體胚誘導(dǎo)及植株再生a將花生種子去子葉后的種胚進(jìn)行表面消毒，然后用無菌水漂洗后，置于裝有無菌水的廣口瓶中浸泡12～16h；b取出經(jīng)表面消毒浸泡好的種胚，置于無菌培養(yǎng)皿中分離種胚的胚小葉，接種到所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，25～30d后形成體胚；c將形成有體胚的外植體轉(zhuǎn)移至體胚萌發(fā)培養(yǎng)基上進(jìn)行萌發(fā)培養(yǎng)，每隔25～30d繼代一次，繼代兩次后得到再生苗；所述體胚萌發(fā)培養(yǎng)基是由選取MSB5為基本培養(yǎng)基，在所述基本培養(yǎng)基中添加BAP形成，BAP的添加量為每升所述基本培養(yǎng)基中添加4mg；d當(dāng)再生苗生長至2～3cm時(shí)，從基部切下，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，獲得完整植株；所述生根培養(yǎng)基是由選取1/2MSB5為基本培養(yǎng)基，在所述1/2MSB5基本培養(yǎng)基中添加NAA形成，NAA的添加量為每升所述基本培養(yǎng)基中添加0.2～0.5mg。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的花生體胚誘導(dǎo)及植株再生的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基 均在培養(yǎng)室溫度為24 26°C、光照強(qiáng)度為2500 3500Lx、光照時(shí)間為13h/d的培養(yǎng)條件 下培養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的花生體胚誘導(dǎo)及植株再生的方法，其特征在于，所述花生種 胚的表面消毒采用75%的酒精浸泡15 25s，再用0. 的升汞浸泡。
全文摘要
本發(fā)明提供一種花生體胚誘導(dǎo)及植株再生的方法，可以解決現(xiàn)有技術(shù)存在的植株再生頻率低的問題。主要步驟是將表面消毒并浸泡好的花生種胚分離胚小葉，接種到添加5～10mg/L2，4-D的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)形成體胚，然后轉(zhuǎn)移到添加了4mg/LBAP的體胚萌發(fā)培養(yǎng)基上，繼代兩次后得再生苗；當(dāng)體胚萌發(fā)伸長后從基部切下，轉(zhuǎn)移至添加0.2～0.5mg/LNAA的1/2MS無機(jī)鹽+B5有機(jī)的生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根得完整植株。通過以花生成熟種子胚小葉為外植體，在5～10mg/L2，4-D的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上及4mg/L BAP的體胚萌發(fā)培養(yǎng)基上，體胚誘導(dǎo)率及植株再生率高，同時(shí)體細(xì)胞胚起源于一個(gè)細(xì)胞，避免了再生植株的嵌合性。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101965798SQ20101053447
公開日2011年2月9日 申請日期2010年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月26日
發(fā)明者喬利仙, 王曉杰, 王晶珊, 趙明霞, 郭寶太, 隋炯明 申請人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)