專利名稱：一種大豆遺傳轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種大豆遺傳轉(zhuǎn)化方法。
背景技術(shù)：
大豆[Glycine max(L. )Merr.]屬一年生豆科草本植物，中國是大豆的原產(chǎn)地，已 有4700多年種植大豆的歷史。大豆是重要的油料作物和糧食作物，是世界上食用油和植物 蛋白的重要來源。然而，大豆再生和遺傳轉(zhuǎn)化的困難阻礙了大豆農(nóng)藝性狀的進(jìn)一步提高和 功能基因組研究的進(jìn)展。迄今為止，從大豆表達(dá)文庫中獲得的超過300，000的表達(dá)序列標(biāo) 簽(expressed sequence tages，ESTs)等待進(jìn)一步的基因克隆和功能驗(yàn)證，這些EST序列 代表著與大豆器官建成、發(fā)育狀態(tài)、基因型和環(huán)境條件等的一大類基因。大豆遺傳資源亟待 人們?nèi)ラ_發(fā)，并用來改良栽培大豆。相對(duì)于玉米、水稻等作物來說，大豆的轉(zhuǎn)化進(jìn)展比較緩慢。Hinchee (1988)最早報(bào) 道大豆轉(zhuǎn)基因植株的獲得，至今已經(jīng)報(bào)道的大豆轉(zhuǎn)化頻率仍然較低。在大豆轉(zhuǎn)基因中常用 的轉(zhuǎn)基因方法是基因槍法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，其它轉(zhuǎn)化方法應(yīng)用的較少。McCabe等(1988) 首次報(bào)道了利用微彈轟擊法成功轉(zhuǎn)化大豆頂芽分生組織獲得轉(zhuǎn)基因植株，但都為嵌合體。 此后的報(bào)道采用此系統(tǒng)通過挑選含有被轉(zhuǎn)化細(xì)胞的植株進(jìn)行后期篩選，獲得了非嵌合的轉(zhuǎn) 基因植株。由于微彈轟擊法不像農(nóng)桿菌法那樣受靶組織的限制，其應(yīng)用于其他靶細(xì)胞組織 的報(bào)道也隨后出現(xiàn)。Finer和McMullen(1991)首次報(bào)道用基因槍法轉(zhuǎn)化體細(xì)胞胚性細(xì)胞 團(tuán)并獲得了轉(zhuǎn)基因植株，以后這一系統(tǒng)得以快速發(fā)展，成為大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室采用的手段?；?因槍法操作受受體材料的影響較小，且轉(zhuǎn)化效率相對(duì)較高，且操作簡便，可控度高。但是這 種方法導(dǎo)入DNA分子量一般不高于10kb，且容易在植物基因組多個(gè)位點(diǎn)整合造成拷貝數(shù) 較高，易引起基因沉默。自Hinchee等(1988)利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化大豆子葉節(jié)成功以來，大 豆轉(zhuǎn)化普遍采用的都是這種基于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的子葉節(jié)分生組織再生系統(tǒng)。由于T-DNA整 合入分生組織的頻率、對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇效率，不定芽再生頻率和植株再生頻率等不高， 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化頻率一直很低。試驗(yàn)中人們對(duì)大豆轉(zhuǎn)化過程進(jìn)行了許多 優(yōu)化。在大豆遺傳轉(zhuǎn)化的過程中，盡可能選擇那些致毒性強(qiáng)的農(nóng)桿菌菌株。超聲波處理 (SAATsoni cat ion-assisted Agrobacterium-mediated transformation)禾口輔助微彈轟擊 也可以增加浸染位點(diǎn)的數(shù)目，采用胚性懸浮系、未成熟子葉或子葉節(jié)等為靶組織，使農(nóng)桿菌 穿越表層細(xì)胞進(jìn)入深層更加容易，可顯著提高轉(zhuǎn)化效率。雖然農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn) 化頻率還很低，試驗(yàn)操作重現(xiàn)性也不高，但該方法還是被大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室和公司所采用用來 進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究。相對(duì)于體細(xì)胞胚途徑，農(nóng) 桿菌介導(dǎo)子葉節(jié)途徑取材方便，培養(yǎng)周期短(一 般8周得到再生植株)；而且所需試驗(yàn)條件簡單，無需基因槍等設(shè)備，獲得轉(zhuǎn)基因植株成本 相對(duì)低廉。但整個(gè)操作過程對(duì)操作人員的技術(shù)要求比較高，試驗(yàn)的成功往往取決于操作人 員的熟練程度和經(jīng)驗(yàn)。近年來，Liu et al. (2004)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)胚尖分生組織系統(tǒng)，獲得了較高的轉(zhuǎn) 化頻率。Paz et al. (2006)報(bào)道用農(nóng)桿菌介導(dǎo)一個(gè)半種子途徑，提高了子葉節(jié)途徑的轉(zhuǎn)化頻率。但到目前為止，大豆還是公認(rèn)的難轉(zhuǎn)化的植物之一。這是因?yàn)榇蠖菇M織培養(yǎng)再生困 難，可重復(fù)性差，轉(zhuǎn)化頻率在基因型之間差異較大，使得利用基因工程手段對(duì)大豆進(jìn)行遺傳 改良受到了限制。因此，只有建立良好的轉(zhuǎn)基因受體系統(tǒng)，并結(jié)合適宜的轉(zhuǎn)基因方法，才有 可能使轉(zhuǎn)基因技術(shù)在大豆的性狀改良、新品種的培育中發(fā)揮作用，并建立一條有別于常規(guī) 育種技術(shù)的新途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種大豆遺傳轉(zhuǎn)化方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟1)用含有外源基因的重組農(nóng)桿菌溶液侵染大 豆的下胚軸，得到侵染后下胚軸；2)將步驟1)得到的侵染后下胚軸進(jìn)行共培養(yǎng)得到共培養(yǎng)后下胚軸；3)將步驟2)得到的共培養(yǎng)后下胚軸進(jìn)行芽誘導(dǎo)培養(yǎng)得到芽誘導(dǎo)后的下胚軸；4)將步驟3)得到的帶芽的下胚軸進(jìn)行篩選培養(yǎng)得到篩選后存活的下胚軸；5)從步驟4)得到的篩選后存活的下胚軸中取下不定芽，將不定芽進(jìn)行生根培養(yǎng)， 得到轉(zhuǎn)基因大豆幼苗。所述大豆的下胚軸為具有頂端分生組織的0.5cm-lcm長的下胚軸，所述大豆的下 胚軸具體為具有頂端分生組織的0. 5cm、0. 8cm或Icm長的下胚軸；所述受體大豆的下胚軸按照如下方法制備大豆種子萌發(fā)5天-6天，去除種皮、子 葉、頂芽，得到具有頂端分生組織的0. 5cm-lcm長的下胚軸；所述受體大豆的下胚軸具體按照如下方法制備大豆種子萌發(fā)5天或6天，去除種 皮、子葉、頂芽，得到具有頂端分生組織的0. 5cm、0. 8cm或Icm長的下胚軸。所述受體大豆種子萌發(fā)5天-6天后具有如下結(jié)構(gòu)帶有種皮、子葉、頂芽、下胚軸 和根，外層種皮破裂，子葉膨大，子葉內(nèi)有頂芽，頂芽的初生葉還未露出子葉、子葉下有下胚 軸，下胚軸下有根。步驟1)中，所述含有外源基因的重組農(nóng)桿菌溶液為按照如下方法制備所述含有 外源基因的重組農(nóng)桿菌重懸于液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，調(diào)至OD值為0. 3-0. 8，25°C靜置lh，得 到重組農(nóng)桿菌溶液；所述OD值具體為0. 3,0. 4,0. 5,0. 6或0. 8 ；所述液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基按照如下方法制備向1/2MS培養(yǎng)基中添加2-嗎啡酸-乙 磺酸、硫代硫酸鈉、L-半胱氨酸、二硫蘇糖醇、乙酰丁香酮、6-芐基腺嘌呤、硝酸銀和蔗糖， 得到所述液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基，所述2-嗎啡酸-乙磺酸在所述液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為 3. 9g/L，所述硫代硫酸鈉在所述液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為0. 2g/L，所述L-半胱氨酸在 所述液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為400mg/L，所述二硫蘇糖醇在所述液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基中 的濃度為0. 154g/L，所述乙酰丁香酮在所述液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為200ymol/L，所 述6-芐基腺嘌呤在所述液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為4mg/L，所述硝酸銀在所述液體共培 養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為5mg/L，所述蔗糖在所述液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為30，000mg/L， 所述液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基的PH為5. 6 ；步驟2)中，所述共培養(yǎng)所用培養(yǎng)基按照如下方法制備向所述液體共培養(yǎng)培 養(yǎng)基中添加瓊脂得到共培養(yǎng)所用培養(yǎng)基，所述瓊脂在所述共培養(yǎng)所用培養(yǎng)基中的濃度為 6，000mg/L，所述共培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的pH為5. 6 ；
步驟3)中，所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)所用培養(yǎng)基按照如下方法制備向1/2MS培養(yǎng)基中添加6-芐基腺嘌呤、吲哚丁酸、蔗糖、羧芐青霉素、噻孢霉素、硝酸銀和瓊脂，得到所述芽誘導(dǎo) 培養(yǎng)所用培養(yǎng)基，所述6-芐基腺嘌呤在所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)所用培養(yǎng)基中的濃度為4mg/L，所 述吲哚丁酸在所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)所用培養(yǎng)基中的濃度為0. 2mg/L，所述蔗糖在所述芽誘導(dǎo)培 養(yǎng)所用培養(yǎng)基中的濃度為30，000mg/L，所述羧芐青霉素在所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)所用培養(yǎng)基中的 濃度為300mg/L，所述噻孢霉素在所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)所用培養(yǎng)基中的濃度為300mg/L，所述硝 酸銀在所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)所用培養(yǎng)基中的濃度為5mg/L，所述瓊脂在所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)所用培 養(yǎng)基中的濃度為8，000mg/L，所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的pH為5. 8 ；步驟4)中，所述篩選培養(yǎng)所用培養(yǎng)基按照如下方法制備向所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)所用 培養(yǎng)基中添加卡那霉素，得到所述篩選培養(yǎng)所用培養(yǎng)基，所述卡那霉素在所述篩選培養(yǎng)所 用培養(yǎng)基中的濃度為100mg/L，所述篩選培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的pH為5. 8 ；步驟5)中，所述生根培養(yǎng)所用培養(yǎng)基按照如下方法制備向1/2MS培養(yǎng)基中添加 蔗糖、噻孢霉素、卡那霉素和瓊脂，得到所述生根培養(yǎng)所用培養(yǎng)基，所述蔗糖在所述生根培 養(yǎng)所用培養(yǎng)基中的濃度為20，000mg/L，所述噻孢霉素在所述生根培養(yǎng)所用培養(yǎng)基中的濃度 為150mg/L，所述卡那霉素在所述生根培養(yǎng)所用培養(yǎng)基中的濃度為10mg/L，所述瓊脂在所 述生根培養(yǎng)所用培養(yǎng)基中的濃度為8，000mg/L，所述生根培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的pH值為5. 6。步驟1)中，所述侵染的時(shí)間為0. 5h-8h ；所述侵染的方式為將所述受體大豆的 下胚軸浸入含有外源基因的重組農(nóng)桿菌溶液振蕩培養(yǎng)；所述侵染的時(shí)間具體為0. 5h，lh， 1.5h,2h,3h,4h,5h,6h,7h 或 8h ;步驟2)中，所述共培養(yǎng)的溫度為22°C_25°C，所述共培養(yǎng)的溫度具體為22°C、23°C 或25°C，所述共培養(yǎng)為暗培養(yǎng)，所述共培養(yǎng)的時(shí)間為2天-5天；所述共培養(yǎng)的時(shí)間具體為2 天、3天、4天或5天；步驟3)中，所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的溫度25°C _28°C，所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的溫度具體為 25°C、27°C或28°C，光照強(qiáng)度為70 μ En^S—1，光周期控制18/6h (光/暗)，培養(yǎng)時(shí)間為6天；步驟4)中，所述篩選培養(yǎng)的溫度25°C _28°C，所述篩選培養(yǎng)的溫度具體為25°C、 27°C或28°C，光照強(qiáng)度為70 μ Em、—1，光周期控制18/6h光/暗，且每周繼代一次；所述篩 選培養(yǎng)的時(shí)間為4周；步驟5)中，所述生根培養(yǎng)的溫度25°C _28°C，所述生根培養(yǎng)的溫度具體為25°C、 271或281，光照強(qiáng)度為70 μ EnT2S-1,光周期控制18/6h光/暗，培養(yǎng)時(shí)間15天。步驟5)中，所述不定芽的長度為2. 5cm-4cm，所述不定芽的長度具體為2. 5cm, 3cm 或 4cm。在步驟2)后，步驟3)前，還包括依次用蒸餾水和含有羧芐青霉素和噻孢霉素液體 共培養(yǎng)培養(yǎng)基沖洗所述共培養(yǎng)后下胚軸的步驟；所述步驟5)中，所述取下不定芽為自不定芽的基部將不定芽切下；在所述取下不 定芽的步驟后，所述將不定芽進(jìn)行生根培養(yǎng)步驟前，還包括將切下不定芽的剪切端浸入濃 度為2mg/L的吲哚丁酸水溶液中浸泡的步驟；所述依次用蒸餾水和含有羧芐青霉素和噻孢霉素液體培養(yǎng)基沖洗所述共培養(yǎng)后 下胚軸的步驟，按照如下方法操作先用無菌蒸餾水沖洗3次，然后用含有羧芐青霉素和噻 孢霉素液體培養(yǎng)基沖洗4次，所述含有羧芐青霉素和噻孢霉素的液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基按照如下方法制備向所述液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加羧芐青霉素和噻孢霉素，得到的含有羧芐青 霉素和噻孢霉素的液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基，所述羧芐青霉素在所述含有羧芐青霉素和噻孢霉素 的液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為300mg/L，所述噻孢霉素在所述含有羧芐青霉素和噻孢霉 素的液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為300mg/L ；所述將切下不定芽的剪切端浸入濃度為2mg/L的吲哚丁酸水溶液中浸泡的步驟 中，所述浸泡時(shí)間為2min-5min ；所述浸泡時(shí)間具體為2min、3min、4min或5min ；所述切下 所述不定芽的位置為緊貼不定芽的基部；所述方法中，在所述步驟5)后，還包括將生根培養(yǎng)得到的具有大于2cm的不定根 的幼苗移栽到混合土中，培養(yǎng)1周，得到轉(zhuǎn)基因大豆植株的步驟，所述混合土由草炭土和蛭 石組成，所述草炭土和蛭石的質(zhì)量比為1 1，所述不定根的長度優(yōu)選為2cm-4cm，具體為 2cm、3cm 或 4cm。所述大豆的下胚軸制備方法中，所述萌發(fā)所用的培養(yǎng)基按照如下方法制備向 1/2MS培養(yǎng)基中添加蔗糖和瓊脂，得到所述萌發(fā)培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基，所述蔗糖在所述萌發(fā)培 養(yǎng)所用的培養(yǎng)基中的濃度為15，000mg/L，所述瓊脂在所述萌發(fā)培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基中的濃度 為7500mg/L，所述萌發(fā)所用的培養(yǎng)基的pH為5. 8 ； 所述萌發(fā)培養(yǎng)的溫度為22°C _25°C，所述萌發(fā)培養(yǎng)的溫度具體為22°C、23°C或 250C，光照強(qiáng)度為120 μ EnT2S-1,光照周期為18h/6h光照/暗。所述含有外源基因的重組農(nóng)桿菌為如下1)或2)1)、將載體pCAMBIA2301導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404得到的重組農(nóng)桿菌2)、將載體pCAMBIA2301導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105得到的重組農(nóng)桿菌。1/2MS培養(yǎng)基按照如下方法制備向去離子水中添加硝酸銨、硝酸鉀、氯化鈣、硫 酸鎂、磷酸二氫鉀、硼酸、硫酸錳、硫酸鋅、碘化鉀、鉬酸鈉、硫酸銅、氯化鈷、甘氨酸、維生素 Bi、維生素B6、煙酸、肌醇、硫酸亞鐵和乙二銨四乙酸二鈉。所述硝酸銨在所述1/2MS培養(yǎng) 基中的濃度為825mg/L，硝酸鉀在所述1/2MS培養(yǎng)基中的濃度為950mg/L，所述氯化鈣在所 述1/2MS培養(yǎng)基中的濃度為220mg/L，所述硫酸鎂在所述1/2MS培養(yǎng)基中的濃度為185mg/ L，所述磷酸二氫鉀在所述1/2MS培養(yǎng)基中的濃度為95mg/L，所述硼酸在所述1/2MS培養(yǎng)基 中的濃度為3. lmg/L，所述硫酸錳在所述1/2MS培養(yǎng)基中的濃度為11. 15mg/L，所述硫酸鋅 在所述1/2MS培養(yǎng)基中的濃度為4. 3mg/L，所述碘化鉀0.415mg/L在所述1/2MS培養(yǎng)基中的 濃度為，所述鉬酸鈉0. 125mg/L在所述1/2MS培養(yǎng)基中的濃度為，所述硫酸銅在所述1/2MS 培養(yǎng)基中的濃度為0. 0125mg/L，所述氯化鈷在所述1/2MS培養(yǎng)基中的濃度為0. 0125mg/L, 所述甘氨酸在所述1/2MS培養(yǎng)基中的濃度為lmg/L，所述維生素Bl在所述1/2MS培養(yǎng)基中 的濃度為0. 05mg/L,所述維生素B6在所述1/2MS培養(yǎng)基中的濃度為0. 25mg/L,所述煙酸在 所述1/2MS培養(yǎng)基中的濃度為0. 25mg/L，所述肌醇在所述1/2MS培養(yǎng)基中的濃度為50mg/ L，所述硫酸亞鐵在所述1/2MS培養(yǎng)基中的濃度為13. 975mg/L，所述乙二銨四乙酸二鈉在所 述1/2MS培養(yǎng)基中的濃度為18. 625mg/L。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，在培養(yǎng)基中添加高濃度6-芐基腺嘌呤(BAP)可以誘導(dǎo)外植體 分生組織增殖產(chǎn)生不定芽的發(fā)生率；在培養(yǎng)基中添加銀離子可以明顯地促進(jìn)大豆單個(gè)外植 體多芽的產(chǎn)生，使得誘導(dǎo)不定芽總數(shù)目顯著增加；達(dá)到出芽多，再生苗能力強(qiáng)，與普通農(nóng)桿 菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法相比，轉(zhuǎn)化效率大幅度提高。本發(fā)明提供了的利用下胚軸為受體建立大豆遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法，可在較短時(shí)間內(nèi)快速高效產(chǎn)生不定芽，用于大豆基因工程的基本 操作系統(tǒng)，對(duì)于大豆品質(zhì)改良具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。


圖1為芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中不同6-芐基腺嘌呤(BAP)濃度對(duì)大豆下胚軸再生頻率的 影響的示2為在不定芽誘導(dǎo)階段大豆下胚軸和子葉節(jié)再生頻率的比較的示3為芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加5mg/L硝酸銀(AgNO3)對(duì)大豆下胚軸外植體不定芽再 生的影響的示4為不同農(nóng)桿菌菌株和培養(yǎng)基中硝酸銀對(duì)大豆轉(zhuǎn)化的影響的示5為菌液濃度對(duì)大豆下胚軸瞬時(shí)表達(dá)頻率的影響的示6為浸染時(shí)間對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆下胚軸T-DNA轉(zhuǎn)化效率的影響的示7為不同共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)大豆下胚軸GUS基因瞬時(shí)表達(dá)頻率影響的示8為抗氧化劑對(duì)組織培養(yǎng)過程中下胚軸褐化和⑶S基因表達(dá)的影響的示9為共培養(yǎng)培養(yǎng)基中乙酰丁香酮(AS)濃度對(duì)GUS基因瞬時(shí)表達(dá)頻率的影響的 示10為質(zhì)粒pCAMBIA2301的部分物理圖譜圖11為⑶S基因在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆下胚軸表達(dá)的照片圖12為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的下胚軸轉(zhuǎn)化獲得GUS陽性植株的染色照片
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中實(shí)驗(yàn)所涉及的藥品均購自北京欣經(jīng)科公司，Sigma公司及上海生工 公司。實(shí)施例1、大豆下胚軸再生植株獲得的影響因素一、BAP濃度對(duì)下胚軸再生不定芽頻率的影響1、受體大豆下胚軸的獲得試驗(yàn)材料大豆(Glycine max)黑農(nóng)44，記載在滿為群、杜維廣、陳怡、欒曉燕、劉 鑫磊、王鳳麗，大豆新品種黑農(nóng)44的選育及不同種植方式對(duì)其產(chǎn)量和品質(zhì)的影響，黑龍江 農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，5 1 -3，中，公眾可從中國科學(xué)院植物研究所獲得。大豆種子表面滅菌挑選無病、飽滿的大豆種子平鋪在敞口培養(yǎng)皿中，放入內(nèi)置一 盛有IOOmL次氯酸鈉原液燒杯的干燥器中，然后沿?zé)徛尤?mL濃鹽酸，密閉干燥器， 置于通風(fēng)櫥中滅菌18h。將滅菌后的種子放置在萌發(fā)培養(yǎng)基(1/21^基本培養(yǎng)基+15，000!!^/ L蔗糖+7，500mg/L瓊脂，pH 5.8)中，置于25°C、120 μ En^S—1光強(qiáng)(光照周期18/6h)的條 件下培養(yǎng)5d。大豆下胚軸培養(yǎng)5d時(shí)，此時(shí)萌發(fā)大豆種皮破裂，初生葉(primary leaves)還未 露出子葉。在超凈工作臺(tái)中取出大豆，小心去掉種皮，將子葉剝離。然后用手術(shù)刀將頂芽切 除，切取具有頂端分生組織的0. 5cm的下胚軸作為受體大豆下胚軸。
2、芽誘導(dǎo)培養(yǎng)將切好的大豆下胚軸分別轉(zhuǎn)移到含有l(wèi)mg/L、2mg/L、3mg/L、4mg/L或5mg/L 6-芐 基腺嘌呤的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(1/2MS基本培養(yǎng)基，0. 2mg/L吲哚丁酸，30，000mg/L蔗糖，300mg/ L 羧芐青霉素，300mg/L 噻孢霉素，8，000mg/L 瓊脂，lmg/L、2mg/L、3mg/L、4mg/L 或 5mg/ L 6-芐基腺嘌呤)上進(jìn)行芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)基的pH為5. 8，培養(yǎng)溫度為27°C，光照強(qiáng)度為 70 μ Em-2S-1,光周期控制18/6h，培養(yǎng)6d，分別獲得不定芽，統(tǒng)計(jì)不定芽的再生頻率，再生頻 率為再生出不定芽的外植體數(shù)目/外植體數(shù)目X100%。外植體的數(shù)目為50，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三 次，結(jié)果取平均值。結(jié)果為含有l(wèi)mg/L 6_芐基腺嘌呤的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，不定芽的再生頻率為28. 2% ；其中 少于3個(gè)不定芽的再生頻率為13.0%，多于4個(gè)不定芽的再生頻率為15.2% ；含有2mg/L 6_芐基腺嘌呤的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，不定芽的再生頻率為41 % ；其中少 于3個(gè)不定芽的再生頻率為23.5%，多于4個(gè)不定芽的再生頻率為17.5% ；含有3mg/L 6_芐基腺嘌呤的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，不定芽的再生頻率為86. 7% ；其中 少于3個(gè)不定芽的再生頻率為41. 2%，多于4個(gè)不定芽的再生頻率為45. 3% ；含有4mg/L 6_芐基腺嘌呤的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，不定芽的再生頻率為85. 3% ；其中 少于3個(gè)不定芽的再生頻率為41. 6%，多于4個(gè)不定芽的再生頻率為43. 7% ；含有5mg/L 6_芐基腺嘌呤的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，不定芽的再生頻率為82. 0% ；其中 少于3個(gè)不定芽的再生頻率為39. 6%，多于4個(gè)不定芽的再生頻率為42. 4% ；作圖如圖1所示，從圖中看出，4mg/L 6_芐基腺嘌呤顯著提高不定芽的再生頻率。 培養(yǎng)基添加6-芐基腺嘌呤的濃度對(duì)外植體不定芽的數(shù)目和頻率有明顯作用。含有4mg/ L6-芐基腺嘌呤條件下，大豆下胚軸能高效誘導(dǎo)多芽的產(chǎn)生，其再生頻率顯著提高。在更高濃度的6-芐基腺嘌呤培養(yǎng)基上培養(yǎng)，結(jié)果為雖然單個(gè)外植體產(chǎn)生多芽的 比率有所提高，但總的再生頻率反而有所下降。二、下胚軸再生體系同子葉節(jié)再生體系的比較
1、受體大豆下胚軸的獲得試驗(yàn)材料與上述一相同；大豆種子表面滅菌與上述一相同；大豆子葉節(jié)外植體取出在萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天的大豆種子，剝?nèi)シN皮，切取根 和大部分的下胚軸，只留下距子葉節(jié)3mm的下胚軸部分。沿種臍將子葉分開，將初生葉和輔 芽全部切除，然后用手術(shù)刀在子葉節(jié)處做傷處理(垂直于子葉劃10次)，使得分生能力強(qiáng)的 分生組織暴露，得到的子葉節(jié)作為大豆子葉節(jié)外植體。2、芽誘導(dǎo)培養(yǎng)與上述一的方法基本相同，不同的是其中芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方如下 1/2MS基本培養(yǎng)基，0. 2mg/L吲哚丁酸，30, 000mg/L蔗糖，300mg/L羧芐青霉素，300mg/L噻孢 霉素，8，000mg/L瓊脂，4mg/L 6-芐基腺嘌呤，得到再生大豆植株(子葉節(jié))組。分別統(tǒng)計(jì)5、10、15、20、25天(此處的天數(shù)為芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的時(shí)間)由實(shí)施例1含有 4mg/L 6-芐基腺嘌呤的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基得到的再生大豆植株(下胚軸)組和上述得到的再生 大豆植株(子葉節(jié))組在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的不定芽數(shù)目；統(tǒng)計(jì)不定芽的再生頻率，再生頻率 為再生出不定芽的外植體數(shù)目/外植體數(shù)目X100%。外植體的數(shù)目為50，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。結(jié)果為再生大豆植株(子葉節(jié))組和再生大豆植株(下胚軸)組在芽誘導(dǎo)培養(yǎng) 5天時(shí)，不定芽的再生頻率分別為0和6. 0% ；其中少于3個(gè)不定芽的再生頻率分別為0和 5. 8%，多于4個(gè)不定芽的再生頻率分別為0和0. 2% ；再生大豆植株(子葉節(jié))組和再生大豆植株(下胚軸)組在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)10天時(shí)， 不定芽的再生頻率分別為4. 和51. 3% ；其中少于3個(gè)不定芽的再生頻率分別為4. 1% 和31.6%，多于4個(gè)不定芽的再生頻率分別為0和19. 7% ；再生大豆植株(子葉節(jié))組和再生大豆植株(下胚軸)組在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)15天時(shí)， 不定芽的再生頻率分別為8. 5%和63. 5% ；其中少于3個(gè)不定芽的再生頻率分別為7. 5% 和35. 7%，多于4個(gè)不定芽的再生頻率分別為和27.8% ；再生大豆植株(子葉節(jié))組和再生大豆植株(下胚軸)組在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)20天時(shí)， 不定芽的再生頻率分別為21. 0%和82. 5%;其中少于3個(gè)不定芽的再生頻率分別為15. 4% 和42. 2%，多于4個(gè)不定芽的再生頻率分別為4. 6%和40. 3% ；再生大豆植株(子葉節(jié))組和再生大豆植株(下胚軸)組在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)25天時(shí)， 不定芽的再生頻率分別為40. 5%和82. 7%;其中少于3個(gè)不定芽的再生頻率分別為22. 2% 和39. 8%，多于4個(gè)不定芽的再生頻率分別為18. 3%和42. 9% ；作圖如圖2所示，大豆下胚軸能在很短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)高頻不定芽高頻再生，同時(shí)每 個(gè)外植體誘導(dǎo)多芽(大于3個(gè)不定芽)的比率也要高于子葉節(jié)再生體系。大豆下胚軸再生 頻率是子葉節(jié)再生頻率的2. 2倍。從圖看出，相對(duì)于子葉節(jié)再生體系而言，大豆下胚軸再生 體系擁有較高的再生頻率，表明下胚軸能在較短時(shí)間內(nèi)快速高效產(chǎn)生不定芽，從而有利于 進(jìn)一步的轉(zhuǎn)化操作。三、硝酸銀對(duì)大豆下胚軸再生的影響1、受體大豆下胚軸的獲得試驗(yàn)材料與上述一相同；大豆種子表面滅菌與上述一相同；受體大豆下胚軸與上述一相同；2、芽誘導(dǎo)培養(yǎng)與上述一的方法基本相同，不同的是采用芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基1培養(yǎng)得 到對(duì)照組；利用芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基2培養(yǎng)，得到實(shí)驗(yàn)組。芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基1配方如下1/2MS基本培養(yǎng)基，0. 2mg/L吲哚丁酸，30，000mg/L蔗 糖，300mg/L羧芐青霉素，300mg/L噻孢霉素，8，000mg/L瓊脂，4mg/L 6-芐基腺嘌呤。芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基2配方如下1/2MS基本培養(yǎng)基，0. 2mg/L吲哚丁酸，30，000mg/L蔗 糖，300mg/L羧芐青霉素，300mg/L噻孢霉素，8，000mg/L瓊脂，4mg/L 6-芐基腺嘌呤，5mg/L 硝酸銀。分別統(tǒng)計(jì)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的不定芽數(shù)目；統(tǒng)計(jì)不定芽的再生頻 率，再生頻率為再生出不定芽的外植體數(shù)目/外植體數(shù)目X100%。外植體的數(shù)目為50，實(shí) 驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。結(jié)果 如下實(shí)驗(yàn)組的總的不定芽數(shù)目為360個(gè)，再生頻率為83. 0%，其中少于3個(gè)不定芽的再 生頻率為21. 2%，多于4個(gè)不定芽的再生頻率為61. 8% ；
對(duì)照組的總的不定芽數(shù)目為240個(gè)，再生頻率為81. 2%，其中少于3個(gè)不定芽的再 生頻率為42. 3%，多于4個(gè)不定芽的再生頻率為38. 9% ；將上述結(jié)果作圖如圖3所示，圖中條形柱編號(hào)分別為1和2，其中1表示不加硝酸 銀處理(對(duì)照組)，2表示加硝酸銀處理(實(shí)驗(yàn)組)?？梢钥闯?，通過在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加 5mg/L硝酸銀極大的促進(jìn)了單個(gè)外植體多芽的產(chǎn)生，總的不定芽數(shù)目顯著增加。不過，需要 指出的是，添加硝酸銀后下胚軸再生頻率(獲得再生芽的外植體數(shù))沒有顯著變化。四、再生芽的生根的影響因素1、受體大豆下胚軸的獲得試驗(yàn)材料與上述一相同；大豆種子表面滅菌與上述一相同；受體大豆下胚軸與上述一相同；2、芽誘導(dǎo)培養(yǎng)與上述一的方法基本相同，不同的是采用芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基2培養(yǎng)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基2配方如下1/2MS基本培養(yǎng)基，0. 2mg/L吲哚丁酸，3%蔗糖，300mg/ L羧芐青霉素，300mg/L噻孢霉素，8，000mg/L瓊脂，4mg/L 6-芐基腺嘌呤，5mg/L硝酸銀。3、再生植株的生根與移栽待不定芽長度大于2. 5cm時(shí)(下胚軸在篩選培養(yǎng)上培養(yǎng)4周)，緊貼不定芽的基部 將其切下，將切下的不定芽分為兩組進(jìn)行如下處理實(shí)驗(yàn)次生根組將切下的不定芽的切口浸入2mg/L吲哚丁酸水溶液中2min，然后 進(jìn)行生根培養(yǎng)，得到的為實(shí)驗(yàn)次生根。對(duì)照次生根組1 將切下的不定芽直接插入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，得到的 為對(duì)照次生根1。對(duì)照次生根組2 將切下的不定芽直接插入生根培養(yǎng)基2中進(jìn)行生根培養(yǎng)，生根培 養(yǎng)培養(yǎng)基2為將吲哚丁酸添加到生根培養(yǎng)基中，使吲哚丁酸在生根培養(yǎng)基中的濃度為2mg/ L，得到的為對(duì)照次生根2。生根培養(yǎng)基的配方如下1/2MS基本培養(yǎng)基，2%蔗糖，150mg/L噻孢霉素，10mg/L 卡那霉素，8，000mg/L瓊脂組成，pH值為5. 6。外植體的數(shù)目均為20，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。結(jié)果為實(shí)驗(yàn)次生根組生根培養(yǎng)15天后，1個(gè)不定芽長出3-7條次生根，生根率達(dá)97%。對(duì)照次生根組1 生根培養(yǎng)15天后，1個(gè)不定芽長出1-2條次生根，生根率達(dá)95%。對(duì)照次生根組2 生根培養(yǎng)15天后，1個(gè)不定芽長出0條次生根，生根率為0。從上述可以看出，培養(yǎng)在不含激素培養(yǎng)基上的伸長芽，誘導(dǎo)不定根的條數(shù)要少，而 且不定根的出育時(shí)間也要遲緩。若將吲哚丁酸直接加入生根培養(yǎng)基，則往往導(dǎo)致切口愈傷 過度增殖，反而影響了不定根的誘導(dǎo)。五、大豆下胚軸轉(zhuǎn)化的影響因素A 農(nóng)桿菌種類及硝酸銀影響1、受體大豆下胚軸的獲得試驗(yàn)材料與上述一相同；大豆種子表面滅菌與上述一相同；
受體大豆下胚軸與上述一相同；2、農(nóng)桿菌制備和轉(zhuǎn)化1)農(nóng)桿菌制備農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備挑取土壤農(nóng)桿菌EHA105 (Hood EE, Gelvin SB, Melchers LS,Hoekema A(1993)New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer toplants. Transgenic Res 2 :208_218，公眾可從中國科學(xué)院植物研究所獲得。)單菌落接種于5mL含 50mg/L利福平，50mg/L鏈霉素的YEP液體培養(yǎng)基中。所述YEP液體培養(yǎng)基是按如下方法制 備向蒸餾水中加入胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉；所述胰蛋白胨在所述YEP液體培養(yǎng)基 中的濃度為10，000mg/L，所述酵母提取物在所述YEP液體培養(yǎng)基中的濃度為10，000mg/L, 所述氯化鈉在所述YEP液體培養(yǎng)基中的濃度為5，000mg/L,所述YEP液體培養(yǎng)基的pH值為 7. O。28°C、250rpm振蕩培養(yǎng)過夜；按1 100接種于40mL含50mg/L利福平，50mg/L鏈 霉素的YEP液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)4-6h ；4°C，5，OOOrpm離心lOmin，去上清；用600 μ L冰 預(yù)冷0. 05mol/L的CaCL2溶液洗滌菌體；4°C，5，OOOrpm離心lOmin，去上清；用200 μ L冰預(yù) 冷0. 05mol/L的CaCL2重懸菌體，得到農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)，于4°C保存。質(zhì)粒向農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化在農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)中加入約0. 5 μ g的 PCAMBIA2301 (www. cambia. org. au)質(zhì)粒DNA(該質(zhì)粒含有選擇標(biāo)記基因NPTII及GUS報(bào) 告基因)，輕輕混勻，冰上放置5min ；然后置于液氮中3min ；迅速轉(zhuǎn)移至37°C溫育5min ； 加入500 μ L YEP液體培養(yǎng)基，28 °C振蕩培養(yǎng)5_6h ；5, OOOrpm離心3min，去大部分上清， 剩200 μ L，懸浮菌體；均勻涂布于含50mg/L利福平、50mg/L鏈霉素和50mg/L卡那霉素的 YEP選擇平板上，28°C倒置培養(yǎng)兩天，得到單菌落。挑取單菌落接種于5mL含50mg/L利福 平，50mg/L鏈霉素的YEP液體培養(yǎng)基中，28°C、250rpm振蕩培養(yǎng)過夜，取1 μ L進(jìn)行PCR鑒 定，PCR 所用的上游引物為 NPTII-F :5，-GTCACTGAAGCGGGAAGGG-3，，下游引物為 NPTII-R 5，-CGGCGATACCGTAAAGCAC-3’，PCR 反應(yīng)體系為20 μ L 的 PCR 反應(yīng)混合液中含有2. 0 μ L 10XPCR buffer, 1. 6μ L 2. 5mM dNTP mixture，1. 0 μ L 待檢測的農(nóng)桿菌菌液，0. 5 μ L IOmM NPTII-F 引物 0. 5μ L IOmM NPTII-R 引物，13. 9 μ L ddH20。PCR 反應(yīng)條件為-MV 10 分鐘; 940C 30秒，55°C 30秒，72°C 1分鐘，30個(gè)循環(huán)；72°C 7分鐘。陽性菌落得到493bp的特異 性條帶，陽性菌落命名為EHA105/pCAMBIA2301。重組菌LBA4404/pCAMBIA2301 的制備和轉(zhuǎn)化方法與上述 EHA105/pCAMBIA2301 的制備和轉(zhuǎn)化方法相同，不同的是土壤農(nóng)桿菌LBA4404 (Ooms G，Hooykaas PJJ, van Veen RJM, van Beelen P, Regensburg-Tuink AJG, Schi lperoort RA(1982)Octopine Ti-plasmiddeletion mutants of Agrobacterium tumefaciens with emphasis on the right sideof the T-region. Plasmid 7 :15-29，公眾可從中國科學(xué)院植物研究所獲得。) 替換 EHA105，得到重組菌 LBA4404/pCAMBIA2301。2)含有外源基因的重組農(nóng)桿菌溶液的制備 將上述得到的重組菌EHA105/pCAMBIA2301接種在含有50mg/L利福平、50mg/L卡 那霉素和50mg/L鏈霉素的YEP培養(yǎng)基中中28°C振蕩培養(yǎng)24h，至對(duì)數(shù)增長期(0D600約 0. 6-0. 8)，此時(shí)重組菌EHA105/pCAMBIA2301的菌液呈桔黃色可供轉(zhuǎn)化使用。將0D600約0. 6-0. 8的重組菌EHA105/pCAMBIA2301的菌液放入30mL離心管，3725rpm離心lOmin，棄上清，收集管底菌體，分別用液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基1和液體共培養(yǎng)培養(yǎng) 基2重懸菌體，將菌液濃度調(diào)至OD值為0. 5，25°C靜置Ih后備用，分別得到含有外源基因的 重組農(nóng)桿菌溶液1和含有外源基因的重組農(nóng)桿菌溶液2。液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基1的配方如下1/2MS基本培養(yǎng)基，3.9g/L 2_嗎啡酸-乙磺酸， 0. 2g/L硫代硫酸鈉，400mg/L L-半胱氨酸，0. 154g/L 二硫蘇糖醇，200 μ mol/L乙酰丁香酮， 4mg/L 6-芐基腺嘌呤，30, 000mg/L 蔗糖，pH5. 6。液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基2的配方和液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基1的配方基本相同，不同的是液 體共培養(yǎng)培養(yǎng)基2包含5mg/L硝酸銀。3)侵染 將50個(gè)由1得到的受體大豆下胚軸分別浸入30mL上述分別獲得的兩種含有外源 基因的重組農(nóng)桿菌溶液中進(jìn)行侵染，期間不斷振蕩，侵染時(shí)間為Ih ；4)共培養(yǎng)分別將經(jīng)過侵染后的大豆下胚軸取出，在無菌的濾紙上吸干菌液，放在鋪有濾紙 的共培養(yǎng)培養(yǎng)基(加6，000mg/L瓊脂的液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基)上，在25°C遮光條件下4d，分 別得到共培養(yǎng)后大豆下胚軸。共培養(yǎng)后將大豆下胚軸依次用蒸餾水沖洗3次，用含有羧芐青霉素和噻孢霉素液 體共培養(yǎng)培養(yǎng)基沖洗4次。5)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)分別將上述得到的共培養(yǎng)后的外植體分別放入芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基2中 進(jìn)行芽誘導(dǎo)培養(yǎng)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基2配方如下1/2MS基本培養(yǎng)基，0. 2mg/L吲哚丁酸，30，000mg/L蔗 糖，300mg/L羧芐青霉素，300mg/L噻孢霉素，8，000mg/L瓊脂，4mg/L 6-芐基腺嘌呤，5mg/L 硝酸銀。6)篩選培養(yǎng)將上述培養(yǎng)得到的芽誘導(dǎo)后的下胚軸轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基(芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基2中加 100mg/L卡那霉素，pH5.8)上，每周繼代一次，培養(yǎng)4周后得到不定芽(此時(shí)不定芽長度為 3cm)。所述篩選培養(yǎng)的溫度25-28°C，光照強(qiáng)度為70 μ EnT2S^光周期控制18/6h (光/暗)；7)再生植株的生根與移栽待不定芽長度為3cm時(shí)(下胚軸在篩選培養(yǎng)上培養(yǎng)4周)，緊貼不定芽的基部將 其切下，將切下的不定芽的切口浸入2mg/L吲哚丁酸水溶液的步驟，進(jìn)行生根培養(yǎng)。得到 具有2cm的不定根的幼苗，將幼苗取出，用水沖去根部附著的培養(yǎng)基，然后移栽到混合土中 (草炭土和蛭石1 1，質(zhì)量比)，保濕培養(yǎng)1周后轉(zhuǎn)入溫室進(jìn)行正常的栽培管理，分別得到 EHA105介導(dǎo)的轉(zhuǎn)pCAMBIA2301再生大豆植株(帶有pCAMBIA2301質(zhì)粒的EHA105菌株培養(yǎng) 基中不加硝酸銀處理得到大豆植株)和EHA105介導(dǎo)的對(duì)照轉(zhuǎn)pCAMBIA2301再生大豆植株 (帶有PCAMBIA2301質(zhì)粒的EHA105菌株培養(yǎng)基中加硝酸銀處理得到大豆植株)；采用同樣的方法將重組菌LBA4404/pCAMBIA2301進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)，分別得到 LBA4404介導(dǎo)的轉(zhuǎn)pCAMBIA2301再生大豆植株(帶有pCAMBIA2301質(zhì)粒的LBA4404菌株培 養(yǎng)基中不加硝酸銀處理得到大豆植株)和LBA4404介導(dǎo)的對(duì)照轉(zhuǎn)pCAMBIA2301再生大豆植 株(帶有pCAMBIA2301質(zhì)粒的LBA4404菌株培養(yǎng)基中加硝酸銀處理得到大豆植株)；生根培養(yǎng)基的配方如下1/2MS基本培養(yǎng)基，20，000mg/L蔗糖，150mg/L噻孢霉素，10mg/L卡那霉素，8，000mg/L瓊脂組成，pH值為5. 6。調(diào)查⑶S基因分別在上述4種轉(zhuǎn)pCAMBIA2301的再生大豆植株(下胚軸)表達(dá)情 況，以期確定不同農(nóng)桿菌對(duì)大豆下胚軸浸染能力和下胚軸對(duì)農(nóng)桿菌的應(yīng)答。統(tǒng)計(jì)⑶S基因的表達(dá)頻率，⑶S基因的表達(dá)頻率通過以下方法計(jì)算(通過⑶S組 織化學(xué)染色檢測為陽性的芽數(shù)/得到的在篩選培養(yǎng)基上存活的所有抗性芽數(shù))xioo%。所 述GUS組織化學(xué)染色是通過如下方法操作的將菌液侵染得到的不同的共培養(yǎng)外植體放入 含ImM 5-溴-4氯-3-吲哚葡萄糖苷(X-gluc)的⑶S染色液(Jefferson R A, KavanghT A and Bevan M W. (1987)GUS-fusions β -glucuronidase as a sensitive andversatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J 6 :3901_3907，公眾可從中國科學(xué)院植物 研究所獲得)中。打開管蓋，放于抽真空容器中，抽真空約15min。置于37°C保溫12h。染 色時(shí)間根據(jù)材料中GUS活性強(qiáng)弱而定。然后用95%酒精脫色。體視顯微鏡下拍照，體視顯 微鏡下呈現(xiàn)藍(lán)色的芽鑒定為陽性芽，否則為陰性芽。外植體的數(shù)目均為50，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次， 結(jié)果取平均值。結(jié)果如圖4所示，圖中條形柱編號(hào)從左到右依次為1，2，3，4，其中分別代表4種 不同的處理(黑色柱代表抗性芽的產(chǎn)生頻率，白色柱代表GUS基因的表達(dá)頻率)。1為 EHA105介導(dǎo)的轉(zhuǎn)pCAMBIA2301再生大豆植株，2為EHA105介導(dǎo)的對(duì)照轉(zhuǎn)pCAMBIA2301再生 大豆植株，3為LBA4404介導(dǎo)的轉(zhuǎn)pCAMBIA2301再生大豆植株，4為LBA4404介導(dǎo)的對(duì)照轉(zhuǎn) PCAMBIA2301再生大豆植株。從圖4中可以看出，不同菌株對(duì)大豆下胚軸浸染，最終獲得的轉(zhuǎn)化效率存在著差 異，LBA440介導(dǎo)的轉(zhuǎn)pCAMBIA2301再生大豆植株和LBA4404介導(dǎo)的對(duì)照轉(zhuǎn)pCAMBIA2301再 生大豆植株⑶S基因的表達(dá)頻率分別為9. 6%和6. 2%，而EHA105介導(dǎo)轉(zhuǎn)pCAMBIA2301再 生大豆植株和EHA105介導(dǎo)對(duì)照轉(zhuǎn)pCAMBIA2301再生大豆植株GUS基因的表達(dá)頻率分別為 20%和10%。同時(shí)也可以看出，在侵染時(shí)的含有外源基因的農(nóng)桿菌溶液中添加硝酸銀對(duì) 這兩種菌株介導(dǎo)的下胚軸轉(zhuǎn)化都有促進(jìn)作用，且EHA105介導(dǎo)的⑶S基因的表達(dá)頻率高于 LBA4404 介導(dǎo)。B、農(nóng)桿菌濃度對(duì)大豆下胚軸轉(zhuǎn)化的影響1、受體大豆下胚軸的獲得試驗(yàn)材料與上述一相同；大豆種子表面滅菌與上述一相同；受體大豆下胚軸與上述一相同；2、農(nóng)桿菌制備和轉(zhuǎn)化1)農(nóng)桿菌制備與上述A方法相同。2)含有外源基因的重組農(nóng)桿菌溶液的制備與A的方法基本相同，不同的是將重 組菌EHA105/pCAMBIA2301用液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基2 (含有5mg/L硝酸銀)分別稀釋為0D600 為 0. 8,0. 5,0. 3 和 0. 1。3)侵染采用上述A的方法，分別浸染大豆下胚軸外植體Ih后；4)共培養(yǎng)采用上述A的方法；共培養(yǎng)3天后，分別得到共培養(yǎng)外植體，然后檢測 共培養(yǎng)外植體的頂端分生區(qū)GUS組織化學(xué)染色情況，統(tǒng)計(jì)基因的轉(zhuǎn)化率?；虻霓D(zhuǎn)化率通過以下方法計(jì)算(產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因陽性芽的外植體數(shù)/用于侵染的外植體數(shù)))X 100。所述轉(zhuǎn)基因陽性芽是指通過⑶S組織化學(xué)染色檢測為陽性的芽；所述 GUS組織化學(xué)染色與上述A相同。體視顯微鏡下拍照，體視顯微鏡下呈現(xiàn)藍(lán)色的芽鑒定為陽 性芽，否則為陰性芽。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如下0D600為0. 8侵染得到的共培養(yǎng)外植體的轉(zhuǎn)化率為16. 1 % ；0D600為0. 5侵染得到的共培養(yǎng)外植體的轉(zhuǎn)化率為25. 3% ；0D600為0. 3侵染得到的共培養(yǎng)外植體的轉(zhuǎn)化率為13. 9% ；0D600為0. 1侵染得到的共培養(yǎng)外植體的轉(zhuǎn)化率為4. 9% ；作圖如圖5所示，圖中條形柱從左到右分別編號(hào)為1，2，3，4，分別代表重組農(nóng)桿菌 稀釋為0D600為0.8，0.5，0.3和0. 1的處理。從圖中看出，隨著菌液濃度的稀釋，轉(zhuǎn)化效率 大幅度降低，0D600為0.5時(shí)，轉(zhuǎn)化率最高。當(dāng)浸染下胚軸的農(nóng)桿菌濃度為(0D600)0.8時(shí)， 下胚軸頂端分生組織在共培養(yǎng)基上很短時(shí)間就褐化壞死，嚴(yán)重影響了后期不定芽的再生。C、浸染時(shí)間對(duì)大豆下胚軸轉(zhuǎn)化的影響1、受體大豆下胚軸的獲得試驗(yàn)材料與上述一相同；大豆種子表面滅菌與上述一相同；受體大豆下胚軸與上述一相同；2、農(nóng)桿菌制備和轉(zhuǎn)化1)農(nóng)桿菌制備與上述A方法相同，2)含有外源基因的重組農(nóng)桿菌溶液的制備含有外源基因的重組農(nóng)桿菌溶液的 制備與A的方法基本相同，不同的是將重組菌EHA105/pCAMBIA2301用液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基 2 (含有5mg/L硝酸銀)稀釋為0D600為0. 5。3)侵染采用上述A的方法，不同的是侵染時(shí)間為0. 5h，lh，1.5h，2h，3h，4h，5h， 6h、7h、8h ；4)共培養(yǎng)采用上述A的方法；得到不同的共培養(yǎng)外植體。用上述A方法檢測⑶S因瞬時(shí)表達(dá)頻率。外植體的數(shù)目均為30，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。結(jié)果如下侵染時(shí)間為0. 5h，⑶S基因瞬時(shí)表達(dá)頻率為12%，侵染時(shí)間為lh，⑶S因瞬時(shí)表達(dá)頻率為12. 5%，侵染時(shí)間為1. 5h，⑶S基因瞬時(shí)表達(dá)頻率為16. 6%，侵染時(shí)間為2h，⑶S基因瞬時(shí)表達(dá)頻率為42. 3%，侵染時(shí)間為3h，⑶S基因瞬時(shí)表達(dá)頻率為53. 6%，侵染時(shí)間為4h，⑶S基因瞬時(shí)表達(dá)頻率為73%，侵染時(shí)間為5h，⑶S基因瞬時(shí)表達(dá)頻率為53. 8%，侵染時(shí)間為6h，⑶S基因瞬時(shí)表達(dá)頻率為37. 5%。作圖如圖6所示，圖中條形柱編號(hào)從左到右依次為1，2，3，4，5，6，7，8。1為浸染 0. 5h，2 為浸染 lh，3 為浸染 1. 5h，4，5，6，7，8 分別為浸染 2，3，4，5，6h。
從圖中看出，當(dāng)外植體浸入0D600為0. 5的菌液中達(dá)4h時(shí)，⑶S基因瞬時(shí)表達(dá)頻 率最高，頻率達(dá)到73.0%。隨著浸染時(shí)間的進(jìn)一步延長，外植體在共培養(yǎng)培養(yǎng)基上易出現(xiàn)酶 促褐化，從而降低了轉(zhuǎn)化效率。D、共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)大豆下胚軸⑶S基因瞬時(shí)表達(dá)頻率的影響1、受體大豆下胚軸的獲得試驗(yàn)材料與上述一相同；大豆種子表面滅菌與上述一相同；受體大豆下胚軸與上述一相同；2、農(nóng)桿菌制備和轉(zhuǎn)化
1)農(nóng)桿菌制備與上述A方法相同；2)含有外源基因的重組農(nóng)桿菌溶液的制備與A的方法相同。3)侵染采用上述A的方法，不同的是將A中0D600為0.5的菌液EHA105/ PCAMBIA2301侵染，侵染時(shí)間為4h ；4)共培養(yǎng)采用上述A的方法；不同的是共培養(yǎng)2d，3d，4d，5d后得到不同的共培 養(yǎng)外植體。瞬時(shí)表達(dá)頻率的檢測GUS基因轉(zhuǎn)化率通過以下方法計(jì)算(產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因陽性芽的 外植體數(shù)/用于侵染的外植體數(shù)))X100。所述轉(zhuǎn)基因陽性芽是指通過⑶S組織化學(xué)染色 檢測為陽性的芽；所述⑶S組織化學(xué)染色與上述A方法相同。體視顯微鏡下拍照，體視顯微 鏡下呈現(xiàn)藍(lán)色的芽鑒定為陽性芽，否則為陰性芽。外植體的數(shù)目均為30，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。結(jié)果如下共培養(yǎng)2d得到的共培養(yǎng)外植體⑶S基因瞬時(shí)表達(dá)頻率為50. 4% ；共培養(yǎng)3d得到的共培養(yǎng)外植體⑶S基因瞬時(shí)表達(dá)頻率為81.4%;共培養(yǎng)4d得到的共培養(yǎng)外植體⑶S基因瞬時(shí)表達(dá)頻率為79. 1 % ；共培養(yǎng)5d得到的共培養(yǎng)外植體⑶S基因瞬時(shí)表達(dá)頻率為76. 3%。作圖如圖7所示，從圖中看出，在3d時(shí)，GUS基因瞬時(shí)表達(dá)率大幅度上升，共培養(yǎng)4 和5d后，⑶S基因瞬時(shí)表達(dá)頻率和3d相似。另外，共培養(yǎng)5d后，外植體開始大幅度褐化甚 至腐軟，不利于誘導(dǎo)不定芽乃至最終成苗。因此，最適共培養(yǎng)時(shí)間為3d。E、抗氧化劑對(duì)⑶S基因在大豆下胚軸中瞬時(shí)表達(dá)的影響1、受體大豆下胚軸的獲得試驗(yàn)材料與上述一相同； 大豆種子表面滅菌與上述一相同；受體大豆下胚軸與上述一相同；2、農(nóng)桿菌制備和轉(zhuǎn)化1)農(nóng)桿菌制備與上述A方法相同。2)含有外源基因的重組農(nóng)桿菌溶液的制備與A的方法相同，不同的是分別在液 體共培養(yǎng)培養(yǎng)基2和不添加抗氧化劑(L-半胱氨酸，二硫蘇糖醇和硫代硫酸鈉)的液體共 培養(yǎng)培養(yǎng)基(在液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基2中不添加抗氧化劑L-半胱氨酸、二硫蘇糖醇和硫代硫 酸鈉)中培養(yǎng)；
3)侵染采用上述A的方法，不同的是將A中0D600為0.5的菌液EHA105/ PCAMBIA2301侵染，侵染時(shí)間為4h ；4)共培養(yǎng)采用上述A的方法；共培養(yǎng)3d，不同的是分別在共培養(yǎng)所用培養(yǎng)基和 不添加抗氧化劑(L-半胱氨酸，二硫蘇糖醇和硫代硫酸鈉)的共培養(yǎng)所用培養(yǎng)基中培養(yǎng)；分 別得到實(shí)驗(yàn)共培養(yǎng)外植體和對(duì)照共培養(yǎng)外植體。外植體的數(shù)目均為50，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。a:觀察結(jié)果如下對(duì)照共培養(yǎng)外植體的表面(圖8A)和切口面(圖8E的左圖)出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，頂端 分生組織壞死(圖8C，箭頭所示，及圖8E左圖)，不利于誘導(dǎo)不定芽至最終成苗。實(shí)驗(yàn)共培養(yǎng)外植體褐化現(xiàn)象顯著降低(圖8B)；頂端分生組織正常(圖8D)，降低 大豆下胚軸切口的褐化程度(圖8E的右圖，及8F的右圖)。b 將實(shí)驗(yàn)共培養(yǎng)外植體和對(duì)照共培養(yǎng)外植體通過GUS組織化學(xué)染色，統(tǒng)計(jì)GUS基 因表達(dá)頻率。結(jié)果如下對(duì)照共培養(yǎng)外植體GUS基因的表達(dá)頻率為2.3%，實(shí)驗(yàn)共培養(yǎng)外植體 ⑶S基因的表達(dá)頻率為62%。從上述結(jié)果可以看出，抗氧化劑處理可以減少褐化并增強(qiáng)⑶S基因在下胚軸分生 組織和頂端的表達(dá)。當(dāng)把大豆下胚軸培養(yǎng)在不加抗氧化劑的培養(yǎng)基中時(shí)，GUS基因的瞬時(shí) 表達(dá)率為僅2. 3%，而將大豆下胚軸培養(yǎng)在含抗氧化劑培養(yǎng)基中，GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)頻率 增加到62%，比前者增加了 27倍。抗氧化劑可以顯著降低大豆下胚軸切口的褐化程度，說 明GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)率的提高與抗氧化劑降低大豆下胚軸切口的褐化程度有著密切的 關(guān)系。因此，在大豆的轉(zhuǎn)基因過程中，在培養(yǎng)基中加入抗氧化劑能提高基因轉(zhuǎn)化效率。對(duì)⑶S基因在下胚軸組織中的瞬時(shí)表達(dá)部位進(jìn)行了研究，如圖8E和8F (圖8E為抗 氧化劑對(duì)下胚軸GUS基因瞬時(shí)表達(dá)的影響，且其中左圖為無抗氧化劑處理的大豆下胚軸， 外植體褐化且未檢測到GUS基因的表達(dá)。右圖為GUS基因在抗氧化劑處理的下胚軸外植體 頂端分生組織表達(dá)。圖8F為抗氧化劑增強(qiáng)大豆下胚軸⑶S基因的表達(dá)，其中左圖為下胚 軸培養(yǎng)在無抗氧化劑的培養(yǎng)基上，外植體褐化。右圖為下胚軸培養(yǎng)在含有抗氧化劑培養(yǎng)基， GUS基因在下胚軸強(qiáng)烈表達(dá)。)所示，染色部位大部分位于下胚軸維管束形成層組織。這些 結(jié)果說明，抗氧化劑主要增強(qiáng)了農(nóng)桿菌對(duì)下胚軸的維管束形成層組織細(xì)胞的浸染。下胚軸 的維管束形成層細(xì)胞具有很強(qiáng)的分生能力，能迅速分化，這對(duì)提高大豆基因轉(zhuǎn)化頻率具有 重要作用。F、AS濃度對(duì)⑶S基因瞬時(shí)表達(dá)頻率的影響1、受體大豆下胚軸的獲得試驗(yàn)材料與上述一相同；大豆種子表面滅菌與上述一相同；受體大豆下胚軸與上述一相同；2、農(nóng)桿菌制備和轉(zhuǎn)化1)農(nóng)桿菌制備與上述A方法相同；2)含有外源基因的重組農(nóng)桿菌溶液的制備與A的方法基本相同，不同的是在液 體共培養(yǎng)培養(yǎng)基2中添加不同量的乙酰丁香酮(AS)，使乙酰丁香酮(AS)在液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基 2 中的濃度分別為 O μ M，50 μ M，100 μ M，150 μ M，200 μ M，300 μ M 禾口 400 μ Μ，中培養(yǎng)；3)侵染采用上A的方法，不同的是將B中0D600為0. 5的菌液EHA105/ PCAMBIA2301侵染，侵染時(shí)間為4h ；4)共培養(yǎng)采用上述A的方法；共培養(yǎng)4周，在共培養(yǎng)所用培養(yǎng)基培養(yǎng)；得到共培 養(yǎng)外植體0、1、2、3、4、5、6。每處理外植體數(shù)為20個(gè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。GUS基因的轉(zhuǎn)化率通過以下方法計(jì)算(產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因陽性芽的外植體數(shù)/用于侵染 的外植體數(shù)))X100。所述轉(zhuǎn)基因陽性芽是指通過⑶S組織化學(xué)染色檢測為陽性的芽；所 述⑶S組織化學(xué)染色與上述A方法相同。體視顯微鏡下拍照，體視顯微鏡下呈現(xiàn)藍(lán)色的芽 鑒定為陽性芽，否則為陰性芽。結(jié)果顯示，共培養(yǎng)外植體0(0 μ M)⑶S基因瞬時(shí)表達(dá)頻率為21% ；共培養(yǎng)外植體1 (50 μ Μ)⑶S基因瞬時(shí)表達(dá)頻率為52. 3% ；共培養(yǎng)外植體2 (100 μ Μ)⑶S基因瞬時(shí)表達(dá)頻率為71. 2% ；共培養(yǎng)外植體3 (150 μ Μ)⑶S基因瞬時(shí)表達(dá)頻率為77. 8% ；共培養(yǎng)外植體4(200 μ Μ)⑶S基因瞬時(shí)表達(dá)頻率為83% ；共培養(yǎng)外植體5 (300 μ Μ)⑶S基因瞬時(shí)表達(dá)頻率為81. 3% ；共培養(yǎng)外植體6 (400 μ Μ)⑶S基因瞬時(shí)表達(dá)頻率為78. 6% ；作圖如圖9所示，圖中條形柱從左往右編號(hào)依次為1，2，3，4，5，6，7，分別代表乙酰 丁香酮(AS)在液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的為0μΜ，50μΜ，100μΜ，150μΜ，200μΜ，300μΜ和 400 μ M進(jìn)行的7種處理。從圖中看出，共培養(yǎng)階段添加200 μ M乙酰丁香酮有助于轉(zhuǎn)化頻率 的提高和增加GUS基因瞬時(shí)表達(dá)頻率。實(shí)施例2 轉(zhuǎn)pCAMBIA2301質(zhì)粒大豆植株及GUS基因在下胚軸的表達(dá)一、轉(zhuǎn)pCAMBIA2301大豆植株的獲得方法一1、受體大豆下胚軸的獲得1)試驗(yàn)材料大豆(Glycine max)品種黑農(nóng)442)大豆種子表面滅菌挑選無病、飽滿的大豆種子平鋪在敞口培養(yǎng)皿中，放入內(nèi) 置-盛有IOOmL次氯酸鈉原液燒杯的干燥器中，然后沿?zé)徛尤?mL濃鹽酸，密閉 干燥器，置于通風(fēng)櫥中滅菌18h。將滅菌后的種子放置在萌發(fā)培養(yǎng)基(1/2MS基本培養(yǎng)基 +15，000mg/L 蔗糖 +7，500mg/L 瓊脂，pH 5. 8)中，置于 25°C ,120 μ En^S-1 光強(qiáng)(光照周期 18/6h)的條件下培養(yǎng)5d。3)外植體的準(zhǔn)備大豆下胚軸培養(yǎng)5d時(shí)，此時(shí)萌發(fā)大豆種皮破裂，初生葉(primary leaves)還未 露出子葉。在超凈工作臺(tái)中取出大豆，小心去掉種皮，將子葉剝離。然后用手術(shù)刀將頂芽切 除，切取具有頂端分生組織的Icm長的下胚軸作為受體大豆下胚軸。2、農(nóng)桿菌制備和轉(zhuǎn)化1)農(nóng)桿菌制備農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備挑取土壤 農(nóng)桿菌EHA105單菌落接種于5mL含50mg/L利福 平，50mg/L鏈霉素的YEP液體培養(yǎng)基(含10，000mg/L胰蛋白胨，10，000mg/L酵母提取物，5，000mg/L氯化鈉，pH7. 0)中，28°C、250rpm振蕩培養(yǎng)過夜；按1 100接種于40mL含50mg/ L利福平，50mg/L鏈霉素的YEP液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)4_6h ；4°C，5，OOOrpm離心lOmin，去 上清；用600 μ L冰預(yù)冷0. 05mol/L的CaCL2溶液洗滌菌體；4°C，5，OOOrpm離心IOmin,去上 清；用200 μ L冰預(yù)冷0. 05mol/L的CaCL2重懸菌體，于4°C保存。質(zhì)粒向農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化在感受態(tài)農(nóng)桿菌中加入約0. 5μ g的pCAMBIA2301 (www. cambia. org. au)質(zhì)粒DNA (該質(zhì)粒含有選擇標(biāo)記基因NPTII及⑶S報(bào)告基因)，輕輕混勻，冰 上放置5min ；然后置于液氮中3min ；迅速轉(zhuǎn)移至37°C溫育5min ；加入500 μ L YEP液體培養(yǎng) 基，28°C振蕩培養(yǎng)5-6h ；5，OOOrpm離心3min，去大部分上清，剩200 μ L，懸浮菌體；均勻涂 布于含50mg/L利福平、50mg/L鏈霉素和50mg/L卡那霉素的YEP選擇平板上，28°C倒置培養(yǎng) 兩天，得到單菌落。挑取單菌落接種于5mL含50mg/L利福平，50mg/L鏈霉素的YEP液體培養(yǎng) 基中，28°C、250rpm振蕩培養(yǎng)過夜，取1 μ L進(jìn)行PCR鑒定，PCR所用的上游引物為NPTII-F 5，-GTCACTGAAGCGGGAAGGG-3，，下游引物為 NPTII-R :5，-CGGCGATACCGTAAAGCAC-3，，PCR 反 應(yīng)體系為20 μ 1 的 PCR 反應(yīng)混合液中含有2. 0 μ L 10XPCR buffer, 1. 6 μ L 2. 5mM dNTP mixture，1. 0μ L待檢測的農(nóng)桿菌菌液，0. 5μ L IOmM NPTII-F 引物 0. 5 μ L IOmM NPTII-R 引物，13. 9μ L ddH20。PCR 反應(yīng)條件為94°C 10 分鐘；94°C 30 秒，55 °C 30 秒，72 °C 1 分 鐘，30個(gè)循環(huán)；72°C 7分鐘。陽性菌落得到493bp的特異性條帶，陽性菌落命名為EHA105/ PCAMBIA2301。2)含有外源基因的重組農(nóng)桿菌溶液的制備將上述得到的重組菌EHA105/pCAMBIA2301接種在含有50mg/L利福平、50mg/L 卡那霉素和50mg/L鏈霉素的YEP培養(yǎng)基中28°C振蕩培養(yǎng)24h，至對(duì)數(shù)增長期(0D600約 0. 6-0. 8)，此時(shí)重組菌EHA105/pCAMBIA2301的菌液呈桔黃色可供轉(zhuǎn)化使用。將0D6000. 8 的重組菌 EHA105/pCAMBIA2301 的菌液放入 30mL 離心管，3725rpm 離 心lOmin，棄上清，收集管底菌體，用液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基(1/2MS基本培養(yǎng)基，3. 9g/L2_嗎啡 酸-乙磺酸，0. 2g/L硫代硫酸鈉，400mg/L L-半胱氨酸，0. 154g/L 二硫蘇糖醇，200 μ mol/L 乙酰丁香酮，4mg/L 6-芐基腺嘌呤，5mg/L硝酸銀，30，000mg/L蔗糖，pH 5.6)重懸菌體，將 菌液濃度調(diào)至OD值為0. 5，25°C靜置Ih后備用，得到含有外源基因的重組農(nóng)桿菌溶液。3)侵染將50個(gè)由1得到的受體大豆下胚軸浸入30mL上述獲得的含有外源基因的重組農(nóng) 桿菌溶液中進(jìn)行侵染，期間不斷振蕩，侵染時(shí)間為4h ；4)共培養(yǎng)將經(jīng)過侵染后的大豆下胚軸取出，在無菌的濾紙上吸干菌液，放在鋪有濾紙的共 培養(yǎng)培養(yǎng)基(加6，000mg/L瓊脂的液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基)上，在25°C遮光條件下3d，得到共 培養(yǎng)后大豆下胚軸。共培養(yǎng)后將大豆下胚軸依次用蒸餾水沖洗3次，用含有羧芐青霉素和噻孢霉素液 體共培養(yǎng)培養(yǎng)基沖洗4次。5)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)然后將沖洗后的大豆下胚軸轉(zhuǎn)移到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(1/2MS基本培養(yǎng)基，4mg/L 6 芐基腺嘌呤，0. 2mg/L吲哚丁酸，30，000mg/L蔗糖，300mg/L羧芐青霉素，300mg/L噻孢霉 素，8，000mg/L瓊脂，5mg/L硝酸銀，pH 5.8)上恢復(fù)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為27°C，光照強(qiáng)度為70 μ EnT2S-1,光周期控制18/6h，培養(yǎng)6d，得到誘導(dǎo)后下胚軸。6)篩選培養(yǎng)將上述恢復(fù)培養(yǎng)后的誘導(dǎo)后下胚軸轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基(芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基加100mg/L 卡那霉素，pH5. 8)上，每周繼代一次，培養(yǎng)4周后得到不定芽(此時(shí)不定芽長度為2. 5cm)。 所述篩選培養(yǎng)的溫度27°C，光照強(qiáng)度為70 μ EnT2S4,光周期控制18/6h光/暗。7)再生植株的生根與移栽待不定芽伸長為2. 5cm時(shí)，緊貼不定芽的基部將其切下，將切下的不定芽的基部 (即切口)浸入2mg/L吲哚丁酸水溶液中浸泡5min，然后用無菌濾紙吸干后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng) 基(1/2MS基本培養(yǎng)基，20, 000mg/L蔗糖，150mg/L噻孢霉素，10mg/L卡那霉素，0. 8%瓊脂， PH值為5. 6，27°C，培養(yǎng)15天，得到具有2cm的不定根的幼苗，將幼苗取出，用水沖去根部附 著的培養(yǎng)基，然后移栽到混合土中(草炭土和蛭石質(zhì)量比1 1)，保濕培養(yǎng)1周后轉(zhuǎn)入溫室 進(jìn)行正常的栽培管理，得到20株轉(zhuǎn)pCAMBIA2301的再生大豆植株(下胚軸)。方法二、1、受體大豆下胚軸的獲得1)試驗(yàn)材料與方法一相同；2)大豆種子表面滅菌與方法一基本相同，不同的是在22°C下培養(yǎng)6d;3)外植體的準(zhǔn)備與方法一基本相同，不同的是切取具有頂端分生組織的0. 5cm 長的下胚軸作為受體大豆下胚軸；2、農(nóng)桿菌制備和轉(zhuǎn)化1)農(nóng)桿菌制備與方法一相同；2)含有外源基因的重組農(nóng)桿菌溶液的制備與方法一相同；3)侵染與方法一相同；
4)共培養(yǎng)與方法一基本相同，不同的是在22°C下培養(yǎng)；5)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)與方法一基本相同，不同的是在25°C下培養(yǎng)；6)篩選培養(yǎng)與方法一基本相同，不同的是在25°C下培養(yǎng)；7)再生植株的生根與移栽與方法一基本相同，不同的是待不定芽伸長為3cm時(shí)， 緊貼不定芽的基部將其切下，將切下的不定芽的基部(即切口)浸入2mg/L吲哚丁酸水溶 液中浸泡2min ；且在25°C下培養(yǎng)得到具有3cm的不定根的幼苗。方法三、1、受體大豆下胚軸的獲得1)試驗(yàn)材料與方法一相同；2)大豆種子表面滅菌與方法一基本相同，不同的是在23°C下培養(yǎng)6d;3)外植體的準(zhǔn)備與方法一基本相同，不同的是切取具有頂端分生組織的0. 8cm 長的下胚軸作為受體大豆下胚軸；2、農(nóng)桿菌制備和轉(zhuǎn)化1)農(nóng)桿菌制備與方法一相同；2)含有外源基因的重組農(nóng)桿菌溶液的制備與方法一相同；3)侵染與方法一相同；4)共培養(yǎng)與方法一基本相同，不同的是在23°C下培養(yǎng)；
5)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)與方法一基本相同，不同的是在28°C下培養(yǎng)；6)篩選培養(yǎng)與方法一基本相同，不同的是在28°C下培養(yǎng)；7)再生植株的生根與移栽與方法一基本相同，不同的是待不定芽伸長為4cm時(shí)， 緊貼不定芽的基部將其切下，將切下的不定芽的基部(即切口)浸入2mg/L吲哚丁酸水溶 液中浸泡3min ；且在28°C下培養(yǎng)得到具有4cm的不定根的幼苗。二、⑶S基因在下胚軸的表達(dá)檢測方法一得到的下胚軸中的⑶S基因的表達(dá)。外植體的數(shù)目均為50，以下實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。用⑶S組織化學(xué)染色觀察各個(gè)階段的⑶S基因的表達(dá)，圖10為質(zhì)粒pCAMBIA2301 的部分物理圖譜(含有GUS基因)。具體如下共培養(yǎng)結(jié)束兩天后對(duì)外植體GUS組織化學(xué)染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GUS基因在外植體頂端 強(qiáng)烈表達(dá)，表達(dá)位置主要集中于初生芽(制備外植體時(shí)被切除)基部周圍的分生組織(圖 11A)。篩選培養(yǎng)一周后，對(duì)外植體⑶S組織化學(xué)染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，表達(dá)⑶S基因的分生組 織開始增殖(圖11B)并隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長逐步被誘導(dǎo)形成芽原基(圖11C)。這些芽原基 分化形成不定芽，從圖IlD可以看出，大豆下胚軸頂端分生組織分化形成芽原基并表達(dá)⑶S 基因，呈環(huán)狀分布于初生芽基部周圍。與之對(duì)比，初生芽殘基組織和表皮組織沒有被⑶S染 色，說明初生芽基部的分生組織具有強(qiáng)烈的分生和接受外源DNA的能力，是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化下 胚軸過程中的“靶細(xì)胞組織”。在篩選培養(yǎng)兩周的下胚軸高頻再生不定芽，箭頭所示為GUS陽性的再生不定芽， 其周圍的非轉(zhuǎn)化細(xì)胞逐步褐化死亡(圖11E)。轉(zhuǎn)化的下胚軸外植體在篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 周，不定芽即可伸長至3cm，可以轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基。通過進(jìn)一步⑶S組織化學(xué)染色轉(zhuǎn)pCAMBIA2301質(zhì)粒大豆植株的不定芽、葉片、種子 (圖12B右圖為成熟小葉的染色，圖12C為不同轉(zhuǎn)基因株系的成熟小葉的染色、圖12D為未 成熟種子的染色)，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行篩選(圖12)，結(jié)果為轉(zhuǎn)pCAMBIA2301質(zhì)粒大豆植株不定芽的⑶S染色陽性為20株(圖12A)；轉(zhuǎn)pCAMBIA2301質(zhì)粒大豆植株的葉片的GUS染色陽性為20株(圖12B、12C)；轉(zhuǎn)pCAMBIA2301質(zhì)粒大豆植株的種子的⑶S染色陽性為20株(圖12D)；因此，共得到20株轉(zhuǎn)pCAMBIA2301質(zhì)粒大豆陽性大豆植株，且可育。采用同樣的方法檢測方法二和方法三得到的下胚軸中的GUS基因的表達(dá)，結(jié)果與 方法一無顯著差異。
權(quán)利要求
1. 一種大豆遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括如下步驟1)用含有外源基因的重組農(nóng)桿菌溶液侵染大豆的下胚軸，得到侵染后下胚軸；2)將步驟1)得到的侵染后下胚軸進(jìn)行共培養(yǎng)得到共培養(yǎng)后下胚軸；3)將步驟2)得到的共培養(yǎng)后下胚軸進(jìn)行芽誘導(dǎo)培養(yǎng)得到芽誘導(dǎo)后的下胚軸；4)將步驟3)得到的芽誘導(dǎo)后的下胚軸進(jìn)行篩選培養(yǎng)得到篩選后存活的下胚軸；5)從步驟4)得到的篩選后存活的下胚軸中取下不定芽，將不定芽進(jìn)行生根培養(yǎng)，得到 轉(zhuǎn)基因大豆幼苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述大豆的下胚軸為具有頂端分生組織的0. 5cm-lcm長的下胚軸，所述大豆的下胚軸 具體為具有頂端分生組織的0. 5cm、0. 8cm或Icm長的下胚軸；所述受體大豆的下胚軸按照如下方法制備大豆種子萌發(fā)5天-6天，去除種皮、子葉、 頂芽，得到具有頂端分生組織的0. 5cm-lcm長的下胚軸；所述受體大豆的下胚軸具體按照如下方法制備大豆種子萌發(fā)5天或6天，去除種皮、 子葉、頂芽，得到具有頂端分生組織的0. 5cm、0. 8cm或Icm長的下胚軸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于步驟1)中，所述含有外源基因的重組農(nóng)桿菌溶液為按照如下方法制備所述含有外源 基因的重組農(nóng)桿菌重懸于液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，調(diào)至OD值為0. 3-0. 8，25°C靜置lh，得到重 組農(nóng)桿菌溶液；所述OD值具體為0. 3,0. 4,0. 5,0. 6或0. 8 ；所述液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基按照如下方法制備向1/2MS培養(yǎng)基中添加2-嗎啡酸-乙磺 酸、硫代硫酸鈉、L-半胱氨酸、二硫蘇糖醇、乙酰丁香酮、6-芐基腺嘌呤、硝酸銀和蔗糖，得 到所述液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基，所述2-嗎啡酸-乙磺酸在所述液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為 3. 9g/L，所述硫代硫酸鈉在所述液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為0. 2g/L，所述L-半胱氨酸在 所述液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為400mg/L，所述二硫蘇糖醇在所述液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基中 的濃度為0. 154g/L，所述乙酰丁香酮在所述液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為200ymol/L，所 述6-芐基腺嘌呤在所述液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為4mg/L，所述硝酸銀在所述液體共培 養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為5mg/L，所述蔗糖在所述液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為30，000mg/L， 所述液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基的PH為5. 6 ；步驟2)中，所述共培養(yǎng)所用培養(yǎng)基按照如下方法制備向所述液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添 加瓊脂得到共培養(yǎng)所用培養(yǎng)基，所述瓊脂在所述共培養(yǎng)所用培養(yǎng)基中的濃度為6，000mg/L， 所述共培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的PH為5. 6 ；步驟3)中，所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)所用培養(yǎng)基按照如下方法制備向1/2MS培養(yǎng)基中添加 6-芐基腺嘌呤、吲哚丁酸、蔗糖、羧芐青霉素、噻孢霉素、硝酸銀和瓊脂，得到所述芽誘導(dǎo)培 養(yǎng)所用培養(yǎng)基，所述6-芐基腺嘌呤在所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)所用培養(yǎng)基中的濃度為4mg/L，所述 吲哚丁酸在所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)所用培養(yǎng)基中的濃度為0. 2mg/L，所述蔗糖在所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng) 所用培養(yǎng)基中的濃度為30，000mg/L，所述羧芐青霉素在所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)所用培養(yǎng)基中的濃 度為300mg/L，所述噻孢霉素在所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)所用培養(yǎng)基中的濃度為300mg/L，所述硝酸 銀在所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)所用培養(yǎng)基中的濃度為5mg/L，所述瓊脂在所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)所用培養(yǎng) 基中的濃度為8，000mg/L，所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的pH為5. 8 ；步驟4)中，所述篩選培養(yǎng)所用培養(yǎng)基按照如下方法制備向所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)所用培養(yǎng)基中添加卡那霉素，得到所述篩選培養(yǎng)所用培養(yǎng)基，所述卡那霉素在所述篩選培養(yǎng)所用培 養(yǎng)基中的濃度為100mg/L，所述篩選培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的pH為5. 8 ；步驟5)中，所述生根培養(yǎng)所用培養(yǎng)基按照如下方法制備向1/2MS培養(yǎng)基中添加蔗 糖、噻孢霉素、卡那霉素和瓊脂，得到所述生根培養(yǎng)所用培養(yǎng)基，所述蔗糖在所述生根培養(yǎng) 所用培養(yǎng)基中的濃度為20，000mg/L，所述噻孢霉素在所述生根培養(yǎng)所用培養(yǎng)基中的濃度為 150mg/L，所述卡那霉素在所述生根培養(yǎng)所用培養(yǎng)基中的濃度為10mg/L，所述瓊脂在所述生 根培養(yǎng)所用培養(yǎng)基中的濃度為8，000mg/L，所述生根培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的pH值為5. 6。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于步驟1)中，所述侵染的時(shí)間為0. 5h-8h ；所述侵染的方式為將所述受體大豆的下胚 軸浸入含有外源基因的重組農(nóng)桿菌溶液中；所述侵染的時(shí)間具體為0. 5h，lh, 1. 5h，2h，3h， 4h，5h，6h、7h 或 8h ；步驟2)中，所述共培養(yǎng)的溫度為22°C _25°C，所述共培養(yǎng)的溫度具體為22°C、23°C或 25°C，所述共培養(yǎng)為暗培養(yǎng)，所述共培養(yǎng)的時(shí)間為2天-5天；所述共培養(yǎng)的時(shí)間具體為2 天、3天、4天或5天；步驟3)中，所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的溫度25°C _28°C，所述芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的溫度具體為25V、 27°C或28°C，光照強(qiáng)度為70 μ EnT2Sl光周期控制18/6h (光/暗)，培養(yǎng)時(shí)間為6天；步驟4)中，所述篩選培養(yǎng)的溫度25 °C -28 °C，所述篩選培養(yǎng)的溫度具體為25°C、27°C或 28°C，光照強(qiáng)度為70 μ EnT2S^光周期控制18/6h光/暗，且每周繼代一次；所述篩選培養(yǎng)的 時(shí)間為4周；步驟5)中，所述生根培養(yǎng)的溫度25 °C -28 °C，所述生根培養(yǎng)的溫度具體為25°C、27°C或 28°C，光照強(qiáng)度為70 μ EnT2S-1,光周期控制18/6h光/暗，培養(yǎng)時(shí)間15天。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于步驟5)中，所述不定芽的長度為2. 5cm-4cm0
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于步驟5)中，所述不定芽的長度為2. 5cm、3cm或4cm。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于在步驟2)后，步驟3)前，還包括依次用蒸餾水和含有羧芐青霉素和噻孢霉素液體共培 養(yǎng)培養(yǎng)基沖洗所述共培養(yǎng)后下胚軸的步驟。所述步驟5)中，所述取下不定芽為自不定芽的基部將不定芽切下；在所述取下不定芽 的步驟后，所述將不定芽進(jìn)行生根培養(yǎng)步驟前，還包括將切下不定芽的剪切端浸入濃度為 2mg/L的吲哚丁酸水溶液中浸泡的步驟。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述依次用蒸餾水和含有羧芐青霉素和噻孢霉素液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基沖洗所述共培養(yǎng) 后下胚軸的步驟中，所述含有羧芐青霉素和噻孢霉素的液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基按照如下方法制 備向所述液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加羧芐青霉素和噻孢霉素，得到的含有羧芐青霉素和噻 孢霉素的液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基，所述羧芐青霉素在所述含有羧芐青霉素和噻孢霉素的液體共 培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為300mg/L，所述噻孢霉素在所述含有羧芐青霉素和噻孢霉素的液體 共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為300mg/L ；所述將切下不定芽的剪切端浸入濃度為2mg/L的吲哚丁酸水溶液中浸泡的步驟中，所述浸泡時(shí)間為2min-5min ；所述浸泡時(shí)間具體為2min、3min或5min ；所述切下所述不定芽 的位置為緊貼不定芽的基部；所述方法中，在所述步驟5)后，還包括將生根培養(yǎng)得到的具有大于2cm的不定根的幼 苗移栽到混合土中，培養(yǎng)1周，得到轉(zhuǎn)基因大豆植株的步驟，所述混合土由草炭土和蛭石組 成，所述草炭土和蛭石的質(zhì)量比為1 1，所述不定根的長度優(yōu)選為2cm-4cm，具體為2cm、 3cm 或 4cm。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于所述大豆的下胚軸制備方法中，所述萌發(fā)所用的培養(yǎng)基按照如下方法制備向1/2MS 培養(yǎng)基中添加蔗糖和瓊脂，得到所述萌發(fā)培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基，所述蔗糖在所述萌發(fā)培養(yǎng)所 用的培養(yǎng)基中的濃度為15，000mg/L,所述瓊脂在所述萌發(fā)培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基中的濃度為 7，500mg/L，所述萌發(fā)所用的培養(yǎng)基的pH為5. 8 ；所述萌發(fā)培養(yǎng)的溫度為22°C _25°C，所述萌發(fā)培養(yǎng)的溫度具體為22°C、23°C、25°C，光 照強(qiáng)度為120 μ EnT2S^光照周期為18h/6h光照/暗。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一所述的方法，其特征在于所述含有外源基因的重組農(nóng)桿菌為如下1)或2)1)、將載體pCAMBIA2301導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404得到的重組農(nóng)桿菌；2)、將載體pCAMBIA2301導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105得到的重組農(nóng)桿菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大豆遺傳轉(zhuǎn)化方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟將外源基因?qū)氪蠖沟南屡咻S中，得到轉(zhuǎn)基因大豆。所述大豆的下胚軸為含有0.5cm-1cm頂端分生組織的下胚軸；所述大豆的下胚軸按照如下方法制備大豆種子萌發(fā)5天-6天，去除種皮、子葉、頂芽，得到含有0.5cm-1cm頂端分生組織的下胚軸為大豆的下胚軸。本發(fā)明提供了的利用下胚軸為受體建立大豆遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法，可在較短時(shí)間內(nèi)快速高效產(chǎn)生不定芽，用于大豆基因工程的基本操作系統(tǒng)，對(duì)于大豆品質(zhì)改良具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102002512SQ201010534520
公開日2011年4月6日 申請(qǐng)日期2010年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月8日
發(fā)明者劉超, 吳韓英, 武旺, 王戈亮, 許亦農(nóng), 趙明明 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院植物研究所