專利名稱：一種大別山冬青離體快繁的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及大別山冬青1# (Ilex dabieshanensis K Yao.et M.P.Deng.)組織培養(yǎng)繁殖
方法，屬于木本植物種苗繁殖的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
大別山冬青(Ilexdabieshanensis K Yao.et M.P.Deng.)屬冬青科(Aquifoliaceae)冬 青屬(Ilex)植物。常綠小喬木，高約5米，全株無毛，樹皮灰白色，平滑；小枝暗紅色， 具棱角，葉革質(zhì)，卵狀長圓形、卵形或橢圓形，先端急尖呈刺尖狀，基部近圓形，邊緣 稍反卷，具4-8對刺齒，上面深綠色，具光澤，花期3-4月，果期10-11月，核果近圓球 形至橢圓形，成熟時(shí)鮮紅色。耐修剪；喜光耐半陰，抗寒耐旱；土壤要求不高，在酸性 及含腐殖質(zhì)多的土壤中生長茂盛，要求肥沃，濕潤而排水好；喜溫暖濕潤氣候，年平均 溫度16°C為宜，能耐最高溫度為39°C，較耐寒，_8°C也不受凍害，花期遇低溫會(huì)影響開 花授粉和花的發(fā)育。大別山冬青1#為江蘇省中國科學(xué)院自主選育出的優(yōu)良品種，該樹種適宜于庭園 綠化，觀賞，四季常青，葉色青翠，果實(shí)紅艷，耐熱、耐旱，適宜于庭院、草坪孤植， 綠籬建植，高速公路兩旁綠化，是國內(nèi)外都深受人們喜歡的優(yōu)良常綠闊葉樹種之一，也 是制作盆景的好材料，是近年開發(fā)的新、優(yōu)園林綠化樹種之一，有廣闊的應(yīng)用前景。目前該品種種苗數(shù)量在國內(nèi)非常少，相關(guān)研究表明大別山冬青1#的種子繁殖和 扦插繁殖還未突破，因此大別山冬青1#資源非常缺乏，且應(yīng)用也是“有市無貨”。木本植物組織培養(yǎng)研究起步于20世紀(jì)50年代初，直到70年代后期才得到較大 的發(fā)展。目前，不完全統(tǒng)計(jì)有90多屬300多種木本植物經(jīng)組織培養(yǎng)獲得再生植株。而 關(guān)于冬青屬植物組織培養(yǎng)的研究，國內(nèi)外報(bào)道很少。近5年，僅見有報(bào)道對冬青(Ilex chinensis Sims)(見溫州農(nóng)業(yè)科技，2007年第4期，冬青的組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù))、和 美洲冬青[Ilex verticillata(Linn.) A.Gray](見植物生理學(xué)通訊，2007年第2期，美洲冬青的 組織培養(yǎng)與快速繁殖)進(jìn)行組織培養(yǎng)，而關(guān)于大別山冬青1#的離體快繁研究尚未見有報(bào) 道。綜上所述，采取組織培養(yǎng)繁殖大別山冬青1#是解決大別山冬青1#資源短缺的重 要途徑之一，對大別山冬青1#的開發(fā)和推廣利用都具有著非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題是公開大別山冬青1#的組織培養(yǎng)繁殖方法。為解決該技術(shù)采用如下的技術(shù)方案A)外植體消毒；B)芽的分化誘導(dǎo)取消毒后的外植體切割為1.0-1.5cm長的莖段，其中每 個(gè)莖段帶一個(gè)腋芽，將莖段接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行芽的分化誘導(dǎo)，控制培養(yǎng)溫度在 20-26首先在黑暗中培養(yǎng)20-26h，然后進(jìn)行正常培養(yǎng)25-35天，所述正常培養(yǎng)為光照時(shí)間10-16h/天，光照強(qiáng)度為1600-2000Ix ；C)繼代培養(yǎng)與增殖將步驟B)中所 得大別山冬青1#嫩梢切割后接入繼代培 養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)25-35天，培養(yǎng)溫度20-26°C，光照時(shí)間10_16h/天，光照強(qiáng)度為 1600-2000Ix ；D)根的誘導(dǎo)將步驟C)所得大別山冬青1#試管苗接入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根 培養(yǎng)10-15天，培養(yǎng)溫度20-26°C，光照時(shí)間10-16h/天，光照強(qiáng)度為1600-2000Ix。外植體可選擇大別山冬青1#的一年生扦插苗當(dāng)年生枝條上帶腋芽的莖段；步驟 A)中的外植體消毒過程為用清水沖洗干凈，然后用洗衣粉漂洗一次，用84消毒液搖床 上振蕩消毒15_20min，流水沖洗20_30min后，于無菌操作臺上用75%乙醇消毒50_60s， 立即倒入0.1%的升汞消毒lOmin，最后用無菌水洗滌4次，每次振蕩3_5min。步驟B)和步驟C)中可采用MS基本培養(yǎng)基添加激素細(xì)胞分裂素、植物生 長素和赤霉素等三類激素，其中步驟B)中采用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5mg/ L+KT0.05mg/L+NAA0.05mg/L+GA30.1mg/L,步驟 C)中采用的繼代培養(yǎng)基為 MS+6-BA0.3mg/L+IBA 0.02mg/L+GA30.3mg/L ；步驟 D)中可采用的生根培養(yǎng)基為 l/2MS+6-BA0.2mg/L+IBA0.4mg/L ；同時(shí)步驟B)、C)、D)中采用的培養(yǎng)基中還可添加 瓊脂6.5g/l，蔗糖30g/l，同時(shí)控制培養(yǎng)基pH為5.8-6.0。本發(fā)明相對現(xiàn)有技術(shù)的有益效果為采用組織培養(yǎng)的方法對大別山冬青1#進(jìn)行 繁殖，能夠有效的得到大量的大別山冬青1#無菌苗，解決大別山冬青1#資源短缺的問 題；通過對外植體、誘導(dǎo)培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基及生根培養(yǎng)基的選取，能夠使得萌發(fā)率達(dá) IlJ 70-90%,增殖率達(dá)到5-8倍，生根率達(dá)到95-100%，能夠高效的得到大別山冬青1# 無菌苗。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一1、選取50株茁壯的大別山冬青1#一年生扦插苗。剪取當(dāng)年生嫩梢部分，去除 葉片，以莖段為外植體，每莖段帶一腋芽，長約2cm。將外植體用清水沖洗干凈，然后 用洗衣粉漂洗一次，用84消毒液搖床上振蕩消毒15min。流水沖洗20min后，于無菌操作 臺上用75%乙醇消毒50s，立即倒入0.1%的升汞消毒lOmin，最后用無菌水洗滌4次，每 次振蕩3min。將消毒滅菌過的外植體兩端分別切除0.5cm，以去除受傷部分。接入誘導(dǎo) 培養(yǎng)基 MS+6-BA0.5mg/L+KT0.05mg/L+NAA0.05mg/L+GA30.1mg/L 中。每瓶接 3 株， 共接入50瓶。在溫度24°C，光照時(shí)間IOh/天，光強(qiáng)20001x的條件下，進(jìn)行培養(yǎng)。2、外植體接入培養(yǎng)基7d后，腋芽開始萌動(dòng)。至30d時(shí)，污染10株，萌發(fā)率達(dá) 75%,共獲得105株不帶根的初代無菌苗。無菌苗株高約4cm，每株莖上帶有已萌動(dòng)的 腋芽3至6個(gè)。將葉片去除，主干切為帶芽莖段，每段帶一個(gè)腋芽，共得420段。接入 繼代增殖培養(yǎng)基MS+6-BA0.3mg/L+IBA 0.02mg/L+GA30.3mg/L中，培養(yǎng)條件同上。培 養(yǎng)15d后，腋芽開始陸續(xù)出梢，30d后，增殖率達(dá)到8.6倍，即每株繼代苗上平均含有8.6 個(gè)腋芽，共得到腋芽3612個(gè)。3、將第1次繼代增殖得到的繼代無菌苗切為帶2個(gè)或3個(gè)腋芽的莖段，得到莖 段1204段。進(jìn)行第2次繼代，IOd后腋芽開始出梢，30d后得到平均帶有8個(gè)腋芽的無菌苗1150株(其余20株污染，34株未萌動(dòng))。重復(fù)進(jìn)行第3次繼代，得到莖段3070段， 30d后獲得平均帶有6個(gè)腋芽的繼代無菌苗約3000株(其余20株污染，50株未萌動(dòng))。4、將經(jīng)過3次繼代的無菌苗切成帶2個(gè)或3個(gè)腋芽的小段，接入生根壯苗培養(yǎng) 基l/2MS+6-BA0.2mg/L+IBA0.4mg/L，共接入6000株，培養(yǎng)條件同上。培養(yǎng)IOd后， 開始生根，15d后生根率達(dá)100%，至此獲得帶根無菌苗6000株。以上培養(yǎng)基中還添加瓊脂6.5g/l，蔗糖30g/l，同時(shí)控制培養(yǎng)基pH為5.8-6.0。實(shí)施例二 1、選取30株茁壯的大別山冬青1#一年生扦插苗。剪取地上部分，去除葉片， 以莖段為外植體，每莖段帶一腋芽，長約2cm。將外植體用清水沖洗干凈，然后用洗衣 粉漂洗一次，用84消毒液搖床上振蕩消毒18min。流水沖洗25min后，于無菌操作臺上 用75%乙醇消毒55s，立即倒入0.1%的升汞消毒lOmin，最后用無菌水洗滌4次，每次振 蕩4min。將消毒滅菌過的外植體兩端分別切除0.5cm，以去除受傷部分。接入誘導(dǎo)培養(yǎng) 基 MS+6-BA0.5mg/L+KT0.05mg/L+NAA0.05mg/L+GA30.1mg/L 中。每瓶接 3 株，共接 入50瓶。在溫度25°C，光照時(shí)間16h/天，光強(qiáng)16001x的條件下，進(jìn)行培養(yǎng)。2、外植體接入培養(yǎng)基9d后，腋芽開始萌動(dòng)。至35d時(shí)，污染20株，萌發(fā)率達(dá) 80%,共獲得104株不帶根的初代無菌苗。無菌苗平均株高4.5cm，每株莖上帶有已萌動(dòng) 的腋芽3至6個(gè)。將葉片去除，主干切為帶芽莖段，每段帶一個(gè)腋芽，共得到莖段420 段。接入繼代增殖培養(yǎng)基MS+6-BA0.3mg/L+IBA 0.02mg/L+GA30.3mg/L中，培養(yǎng)條件 同上。培養(yǎng)IOd后，腋芽開始陸續(xù)出梢，30d后，增殖率達(dá)到7.2倍，即每株繼代苗上平 均含有7.2個(gè)腋芽，共得腋芽3024個(gè)。3、將第1次繼代增殖得到的繼代無菌苗切為帶2個(gè)或3個(gè)腋芽的莖段，得到莖 段1008段。進(jìn)行第2次繼代，IOd后腋芽開始出梢，30d后得到平均帶有8個(gè)腋芽的無 菌苗968株(其余10株污染，30株未萌動(dòng))。重復(fù)進(jìn)行第3次繼代，得到莖段2581段， 30d后獲得平均帶有6個(gè)腋芽的繼代無菌苗約2500株(其余11株污染，71株未萌動(dòng))。4、將經(jīng)過3次繼代的無菌苗切成帶2個(gè)或3個(gè)腋芽的小段，接入生根壯苗培養(yǎng) 基l/2MS+6-BA0.2mg/L+IBA0.4mg/L，共接入5000株，培養(yǎng)條件同上。培養(yǎng)IOd后開 始生根，15d后生根率達(dá)97%。至此獲得含根無菌苗4850株。以上培養(yǎng)基中還添加瓊脂6.5g/l，蔗糖30g/l，同時(shí)控制培養(yǎng)基pH為5.8-6.0。實(shí)施例三1、選取40株茁壯的大別山冬青1#一年生扦插苗。剪取地上部分，去除葉片， 以莖段為外植體，每莖段帶一腋芽，長約2cm。將外植體用清水沖洗干凈，然后用洗衣 粉漂洗一次，用84消毒液搖床上振蕩消毒20min。流水沖洗30min后，于無菌操作臺上 用75%乙醇消毒60s，立即倒入0.1%的升汞消毒lOmin，最后用無菌水洗滌4次，每次振 蕩5min。將消毒滅菌過的外植體兩端分別切除0.5cm，以去除受傷部分。接入誘導(dǎo)培養(yǎng) 基 MS+6-BA0.5mg/L+KT0.05mg/L+NAA0.05mg/L+GA30.1mg/L 中。每瓶接 3 株，共接 入50瓶。在溫度26°C，光照時(shí)間16h/天，光強(qiáng)16001x的條件下，進(jìn)行培養(yǎng)。2、外植體接入培養(yǎng)基IOd后，腋芽開始萌動(dòng)。至35d時(shí)，污染10株，萌發(fā)率 達(dá)87.10%，共獲得122株不帶根的初代無菌苗。無菌苗平均株高4.5cm，每株莖上帶有 已萌動(dòng)的腋芽3至6個(gè)。將葉片去除，主干切為帶芽莖段，每段帶一個(gè)腋芽，共得莖段488 段。接入繼代增殖培養(yǎng)基 MS+6-BA0.3mg/L+IBA 0.02mg/L+GA30.3mg/L 中，培養(yǎng)
條件同上。培養(yǎng)13d后，腋芽開始陸續(xù)出梢，30d后增殖率達(dá)到5.3倍，即每株繼代苗平均含有5.3個(gè)腋芽，共得腋芽2585個(gè)。3、將第1次繼代增殖得到的繼代無菌苗切為帶2個(gè)或3個(gè)腋芽的莖段，得到莖 段861段。進(jìn)行第2次繼代，5d后腋芽開始出梢，30d后得到平均帶有8個(gè)腋芽的無菌 苗800株(其余61株未萌動(dòng))。重復(fù)進(jìn)行第3次繼代，得到莖段2133段，30d后獲得平 均帶有6個(gè)腋芽的繼代無菌苗約2100株(其余33株未萌動(dòng))。4、將經(jīng)過3次繼代的無菌苗切成帶3個(gè)腋芽的小段，接入生根壯苗培養(yǎng)基 l/2MS+6-BA0.2mg/L+IBA0.4mg/L,共接入4200株，培養(yǎng)條件同上。培養(yǎng)IOd后開始 生根，15d后生根率達(dá)95%。至此獲得含根無菌苗3990株。以上培養(yǎng)基中還添加瓊脂6.5g/l，蔗糖30g/l，同時(shí)控制培養(yǎng)基pH為5.8-6.0。
權(quán)利要求
1.大別山冬青1#組織培養(yǎng)繁殖方法，其特征在于，包括以下步驟A)外植體消毒；B)芽的分化誘導(dǎo)取消毒后的外植體切割為1.0-1.5cm長的莖段，其中每個(gè)莖段帶 一個(gè)腋芽，將莖段接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行芽的分化誘導(dǎo)，控制培養(yǎng)溫度在20-26°C， 首先在黑暗中培養(yǎng)20-26h，然后進(jìn)行正常培養(yǎng)25-35天，所述正常培養(yǎng)為光照時(shí)間 10-16h/ 天，光照強(qiáng)度為 1600-2000Ix ；C)繼代培養(yǎng)與增殖將步驟B)中所得大別山冬青1#嫩梢切割后接入繼代培養(yǎng) 基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)25-35天，培養(yǎng)溫度20-26°C，光照時(shí)間10_16h/天，光照強(qiáng)度為 1600-2000Ix ；D)根的誘導(dǎo)將步驟C)所得大別山冬青1#試管苗接入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng) 10-15天，培養(yǎng)溫度20-26°C，光照時(shí)間10-16h/天，光照強(qiáng)度為1600-2000Ix。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大別山冬青1#組織培養(yǎng)繁殖方法，其特征在于，步驟A)中 的外植體選取大別山冬青1#的一年生扦插苗。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的大別山冬青1#組織培養(yǎng)繁殖方法，其特征在于，步驟 A)中的外植體消毒過程為用清水沖洗干凈，然后用洗衣粉漂洗一次，用84消毒液搖床 上振蕩消毒15_20min，流水沖洗20_30min后，于無菌操作臺上用75%乙醇消毒50_60s， 立即倒入0.1%的升汞消毒lOmin，最后用無菌水洗滌4次，每次振蕩3_5min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大別山冬青1#組織培養(yǎng)繁殖方法，其特征在于，步驟B)中 采用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5mg/L+KT0.05mg/L+NAA0.05mg/L+GA30.1mg/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大別山冬青1#組織培養(yǎng)繁殖方法，其特征在于，步驟C)中 采用的繼代培養(yǎng)基為MS+6-BA0.3mg/L+IBA0.02mg/L+GA30.3mg/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大別山冬青1#組織培養(yǎng)繁殖方法，其特征在于，步驟D)中 采用的生根培養(yǎng)基為l/2MS+6-BA0.2mg/L+IBA0.4mg/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求4至6中任何一項(xiàng)所述的大別山冬青1#組織培養(yǎng)繁殖方法，其特征 在于，所述的培養(yǎng)基中還含有瓊脂6.5g/l，蔗糖30g/l，培養(yǎng)基pH為5.8-6.0。
全文摘要
本發(fā)明提供了大別山冬青(Ilex dabieshanensis K Yao.et M.P.Deng.)組織培養(yǎng)繁殖方法，包括以下步驟首先進(jìn)行外植體消毒，消毒后接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行芽的分化誘導(dǎo)，控制培養(yǎng)溫度在20-26℃，先在黑暗中培養(yǎng)20-26h，然后在光照時(shí)間10-16h/天、光照強(qiáng)度為1600-2000Ix下進(jìn)行正常培養(yǎng)25-35天，接著將所得大別山冬青嫩梢切割后接入繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)25-35天，最后將大別山冬青無菌苗接入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)10-15天，培養(yǎng)溫度20-26℃，光照時(shí)間10-16h/天，光照強(qiáng)度為1600-2000Ix。通過該方法能夠有效的解決大別山冬青快速推廣的問題。
文檔編號A01H4/00GK102017896SQ201010543619
公開日2011年4月20日 申請日期2010年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月15日
發(fā)明者李乃偉, 李云龍, 郭忠仁, 陸小清 申請人:江蘇省·中國科學(xué)院植物研究所