專(zhuān)利名稱(chēng)：人工合成Bt抗蟲(chóng)基因Cry1Ab-t及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程和生物防治領(lǐng)域，具體涉及一種人工合成Bt抗蟲(chóng)基因 及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
玉米既是重要的糧食作物，又是重要的飼料和工業(yè)原料，當(dāng)前玉米蟲(chóng)害(以玉 米螟為主)嚴(yán)重，造成玉米大量減產(chǎn)，因此采取有效措施控制其危害對(duì)提高玉米產(chǎn)量、 增加農(nóng)民收入具有重要的意義。由于缺乏合適的抗蟲(chóng)品種，目前解決蟲(chóng)害的主要方法是 在生長(zhǎng)過(guò)程中噴施化學(xué)殺蟲(chóng)劑；但是化學(xué)殺蟲(chóng)劑同時(shí)殺死害蟲(chóng)及其天敵，造成生態(tài)不平 衡和環(huán)境污染。通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以將Bt抗蟲(chóng)基因?qū)胗衩灼贩N中，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)基因玉 米的抗蟲(chóng)性，降低農(nóng)藥的使用量，節(jié)省人力、物力及社會(huì)資源。Bt基因編碼殺蟲(chóng)晶體蛋白，來(lái)自蘇云金芽孢桿菌(bacillus thuringHmsis、，為
革蘭氏陽(yáng)性土壤桿菌。它在芽孢形成過(guò)程中產(chǎn)生稱(chēng)為S-內(nèi)毒素的殺蟲(chóng)伴胞晶體蛋白 (控制合成這種蛋白質(zhì)的基因在質(zhì)粒上)，這些蛋白具有很高的殺蟲(chóng)活性。其作用原理為 這種抗蟲(chóng)蛋白能被堿性腸液溶解，水解為更小的活性毒素片段——核心片段QHofte and Whiteley^m?；钚云文芸沟鞍酌傅倪M(jìn)一步水解，被激活的蛋白質(zhì)結(jié)合在昆蟲(chóng)腸道 上的刷狀小泡上，引起穿孔從而影響滲透平衡，細(xì)胞膨脹并溶解，靶標(biāo)生物停止取食并 最后死亡。研究表明許多Bt蛋白，靶標(biāo)害蟲(chóng)的腸道上皮細(xì)胞都具有高親和性的結(jié)合位點(diǎn) iHofte and Whiteley^m)在過(guò)去的幾十年里，已確定數(shù)十種蘇云金芽孢桿菌菌系及130 多種它們編碼的殺蟲(chóng)晶體蛋白。研究證明，Bt晶體蛋白對(duì)人體、哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類(lèi)、魚(yú)類(lèi) 以及很多有益昆蟲(chóng)均無(wú)毒害作用，不污染環(huán)境，所以Bt制劑已作為一種無(wú)公害的天然微 生物殺蟲(chóng)劑在農(nóng)業(yè)、林業(yè)及環(huán)境衛(wèi)生等方面應(yīng)用了近50年。Bt晶體蛋白質(zhì)必須被昆蟲(chóng) 取食到才能發(fā)揮殺蟲(chóng)功能，但自然環(huán)境下Bt晶體蛋白質(zhì)穩(wěn)定性差，殺蟲(chóng)效果受天氣影響 大，太陽(yáng)照后則易降解，也不能滲透到植物組織內(nèi)部，易被雨水、露水沖刷掉，這些因 素極大的限制了其發(fā)展應(yīng)用。1987年，比利時(shí)Vaeck等人首次獲得轉(zhuǎn)Bt殺蟲(chóng)蛋白抗蟲(chóng)煙草，獲得的轉(zhuǎn)基因煙 草只能檢測(cè)到微弱的抗蟲(chóng)性，其表達(dá)蛋白幾乎檢測(cè)不到，只占可溶性蛋白的0.001%。在 我國(guó)，1992年，郭三堆等人采用植物優(yōu)化密碼子方法首先在國(guó)內(nèi)人工合成全長(zhǎng)1824bp的
殺蟲(chóng)基因，獲得了中國(guó)第一代單價(jià)抗蟲(chóng)棉；丁群星等(1993)和王國(guó)英等 (1995)分別用子房注射法和基因槍法將pB48.415質(zhì)粒轉(zhuǎn)入玉米愈傷組織中獲得轉(zhuǎn)基因 植株，抗蟲(chóng)性測(cè)定表明其具有一定抗蟲(chóng)性；中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)于1994年在國(guó)內(nèi)外首次用子房 注射的方法把抗蟲(chóng)基因轉(zhuǎn)入玉米并獲得轉(zhuǎn)基因植株；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院周逢勇等在1998 年將GFM殺蟲(chóng)基因構(gòu)建到pMG6質(zhì)粒上，導(dǎo)入到玉米中，后代檢測(cè)表明Bt基因以孟德?tīng)?遺傳方式遺傳到下一代(LIUYJ等，2003)。當(dāng)前，全世界已轉(zhuǎn)化成26種以上Bt轉(zhuǎn)基 因植物，包括棉花、玉米、水稻等主要農(nóng)作物。盡管轉(zhuǎn)基因技術(shù)可打破生殖隔離，實(shí)現(xiàn) 不同物種間的基因轉(zhuǎn)移。但在某一物種內(nèi)可高效表達(dá)的基因，被轉(zhuǎn)化到另一物種后，表達(dá)量不一定高，也未必一定具有其本來(lái)的功能，尤其是對(duì)于差異較大的物種。其中，物 種密碼子偏好性是影響外源基因表達(dá)量的諸多因素之一。不同的物種往往具有不同的偏 好密碼子。分析這種偏好性，在轉(zhuǎn)基因之前，對(duì)需要轉(zhuǎn)化的目的基因進(jìn)行密碼子的重新 設(shè)計(jì)或改造，對(duì)于提高外源基因在受體生物中的表達(dá)量具有重要作用。1983年美國(guó) 華盛頓大學(xué)宣布成功將卡那霉素抗性基因?qū)霟煵菁?xì)胞，以及同 年4月美國(guó)威斯康星大學(xué)宣布成功將大豆基因轉(zhuǎn)入向日葵共同標(biāo)志著植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的 誕生。1986年，首批轉(zhuǎn)基因植物(抗蟲(chóng)、抗除草劑)被批準(zhǔn)進(jìn)入田間試驗(yàn)。1989年 哺乳動(dòng)物抗體重鏈和輕鏈基因在煙草中成功表達(dá)并正確組裝成有功能的抗體。1990年 Gordon-Kamm首次報(bào)道用基因槍轉(zhuǎn)化玉米懸浮細(xì)胞系獲得了可育的轉(zhuǎn)化體。隨后，玉 米轉(zhuǎn)基因技術(shù)開(kāi)始迅猛發(fā)展，大量轉(zhuǎn)基因植物陸續(xù)研制開(kāi)發(fā)成功。KozHal (1993) 等培育出了抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因玉米，轉(zhuǎn)基因植株能高水平表達(dá)況抗蟲(chóng)基因。張秀君
(1999)等用基因槍法將兩個(gè)含高賴(lài)氨酸蛋白質(zhì)基因?qū)胗衩椎呐咝杂鷤M織。劉大 文(2000)等將Zh^J-S^T^w基因轉(zhuǎn)化玉米胚性愈傷組織，經(jīng)過(guò)除草劑篩選得到陽(yáng)性 植株。Ishida (1996)等首次利用超雙元載體建立了根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米自交系的幼 胚，F(xiàn)rame (2002)等成功實(shí)現(xiàn)了根癌農(nóng)桿菌利用普通的雙元載體轉(zhuǎn)化幼胚。張艷貞 (2002)等對(duì)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Bt殺蟲(chóng)基因?qū)雰?yōu)良玉米自交系進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研 究，Huang (2005)、Frame (2006)和Lee (2007)等分別利用農(nóng)桿菌成功轉(zhuǎn)化了常 規(guī)玉米自交系。我國(guó)在轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究方面，業(yè)已建立較成熟的玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系。如中國(guó) 農(nóng)業(yè)大學(xué)在國(guó)內(nèi)較早的開(kāi)展了玉米遺傳轉(zhuǎn)化的工作，于1994在國(guó)內(nèi)外首次用子房注射的 方法把抗蟲(chóng)基因轉(zhuǎn)入玉米并獲得轉(zhuǎn)基因植株，以自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)基因?yàn)榇淼目瓜x(chóng) 玉米已展示了良好的開(kāi)發(fā)前景。同時(shí)，在無(wú)選擇標(biāo)記、選擇標(biāo)記基因刪除和目標(biāo)基因產(chǎn) 物定時(shí)降解、植物組織特異性?xún)?yōu)勢(shì)表達(dá)等核心技術(shù)創(chuàng)新方面已具有較強(qiáng)的創(chuàng)新能力。目 前已分離的抗蟲(chóng)基因很多，主要包括①細(xì)菌來(lái)源的抗蟲(chóng)基因，主要是Bt毒蛋白基因
CCiylAb, CrylAc, Cry2、Ciy3等、；②植物來(lái)源的蛋白酶抑制劑基因，特點(diǎn)在于抗 蟲(chóng)譜廣、來(lái)源于植物本身易于被公眾接受；③細(xì)菌來(lái)源的營(yíng)養(yǎng)殺蟲(chóng)蛋白(Vipl、Vip2、 Vip3等)，廣譜抗鱗翅目，特別是對(duì)小地老虎、粘蟲(chóng)和甜菜葉蛾具有較強(qiáng)作用。由于 基因抗蟲(chóng)能力及昆蟲(chóng)耐受性的影響，轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)產(chǎn)品主要通過(guò)獲得更多更有效的抗蟲(chóng)基 因、改造已有基因、雙抗植物體等途徑獲得。CrylAb蛋白是一類(lèi)由蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生的對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)具有毒殺作用的伴胞 晶體，其在生物防治領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。由于CrylAb基因來(lái)源于蘇云金芽孢桿 菌，將其直接應(yīng)用到轉(zhuǎn)基同植物中后存在有表達(dá)量低，表達(dá)產(chǎn)物不穩(wěn)定，抗蟲(chóng)性效果差 等問(wèn)題。研究蘇云金芽孢桿菌和玉米的密碼子使用情況，可以發(fā)現(xiàn)兩者在密碼子偏好上 存在很大差異，利用植物的偏好密碼子，重新設(shè)計(jì)、改造CrylAb，提高殺蟲(chóng)蛋白的表達(dá) 量，進(jìn)而培育新型抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因玉米，為玉米安全生產(chǎn)提供強(qiáng)有力的保障。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種可在作物中穩(wěn)定表達(dá)、且表達(dá)量高、抗蟲(chóng) 效果好的人工合成抗蟲(chóng)基因C/7L4Z；-/及其編碼蛋白，并將其應(yīng)用于載體、宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化構(gòu)建等方面。本發(fā)明的另一目的是提供抗蟲(chóng)基因在提高轉(zhuǎn)基因植物抗蟲(chóng)性中的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
基因是在野生型基礎(chǔ)上進(jìn)行改造的，只留下部分缺失的N端1845bp 的一段堿基序列SEQ ID No.2，并且在保持該段序列的氨基酸組成總體不變的情況下，用 植物偏愛(ài)的密碼子置換序列SEQ ID No.2相對(duì)應(yīng)的密碼子，排除DNA序列中存在的造成 植物轉(zhuǎn)錄不穩(wěn)定的富含AT序列以及常用限制性酶切位點(diǎn)(SacI)，然后通過(guò)置換密碼子 的方法進(jìn)行改正消除；并在3端加上終止密碼子TAG，獲得一個(gè)改造的DNA序列；確定 并化學(xué)合成改造的Bt基因如序列表SEQJD ΝΟ:1所示的編碼序列，其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列 如SEQIDNO:3所示；根據(jù)基因功能分析的需要，進(jìn)一步對(duì)基因進(jìn)行克隆，并 在在序列兩端加上限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)序列以便構(gòu)建到相應(yīng)的表達(dá)載體上。將本發(fā)明基因與原核表達(dá)載體可操作地連接，能夠快速初步檢測(cè)本發(fā)明合成的 Bt抗蟲(chóng)基因表達(dá)產(chǎn)物對(duì)玉米螟的毒性。將本發(fā)明基因與植物表達(dá)載體可操作地 連接，將表達(dá)載體導(dǎo)入相應(yīng)農(nóng)桿菌中(LBA4404)，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行玉米愈傷 組織和幼胚的遺傳轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)人工合成C/7L4Z；-/基因的玉米轉(zhuǎn)化子，培育抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因 玉米。也可以對(duì)其它農(nóng)作物或者果樹(shù)等進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，使其具備抗蟲(chóng)活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明公開(kāi)的基因，以其轉(zhuǎn)化玉米、棉花、水稻、蔬 菜等農(nóng)作物，使其具備相應(yīng)的抗蟲(chóng)活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以將本發(fā)明基因轉(zhuǎn)化細(xì)菌或真菌，通過(guò)大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)Bt 蛋白，并將其制備成殺蟲(chóng)劑，用于農(nóng)作物害蟲(chóng)的防治。本發(fā)明具有積極有益的效果
本發(fā)明抗蟲(chóng)基因CiyJΑ - 序列與原始CiyJAh序列比較，改造后的基因設(shè)計(jì)了缺失 和DNA序列改變，大大增強(qiáng)了其在植物中的表達(dá)。使用植物偏愛(ài)性密碼子，減少了原始 DNA序列中的富含AT序列和存在的反向重復(fù)序列以及不明確的真核DNA序列內(nèi)含子序 列。對(duì)于改造后的基因，在1845個(gè)堿基中，改變了 1221個(gè)堿基，從而使G+C 含量為由37.3%提高到62.7%。CrylAb-t基因與原始DNA序列的同源性為66.2%。本 發(fā)明抗蟲(chóng)基因可在植物細(xì)胞中高效穩(wěn)定的表達(dá)。此人工改造合成的基因通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)、超聲波處理和基因槍轉(zhuǎn)化等 手段導(dǎo)入玉米后，可以得到穩(wěn)定遺傳的抗蟲(chóng)的CrylAb-t轉(zhuǎn)化子。同時(shí)也可以把該Bt抗 蟲(chóng)基因轉(zhuǎn)化到棉花、水稻、蔬菜等農(nóng)作物中，使其具備相應(yīng)的抗蟲(chóng)活性，從而 降低農(nóng) 藥的使用量，以減少環(huán)境污染，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為新改造基因CrylAb-t的合成、鑒定圖譜，其中A、B為CrylAb-t基因 的分段合成圖譜，C為最終合成的C/7L4Z；-/基因圖譜，D為原核載體pET28b-ayL4Z；-/
(NdeI和HindIII)酶切鑒定圖譜)。圖2 為植物表達(dá)載體圖pCAMBIA1300-35S-MCS_55r。圖 3 為 pCAMBIAlSOO-O^y^-/"^^ 構(gòu)建圖譜。
圖4為通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化抗蟲(chóng)基因后愈傷組織的篩選(左)、再 生(中)以及轉(zhuǎn)基因植株移栽到花盆(右)；玉米抗性愈傷組織的篩選和抗性植株的再生 過(guò)程中，培養(yǎng)基內(nèi)含有高水平的選擇試劑一雙丙氨膦，在此條件下只有轉(zhuǎn)化細(xì)胞才能生 長(zhǎng)，非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)受到了完全的抑制，作為對(duì)照組的非轉(zhuǎn)化愈傷組織以及植株在此 條件下全部死亡。圖5為T(mén)tl代 轉(zhuǎn)化體目的基因的PCR檢測(cè)，M:DL2000 plus其中CKl: 陽(yáng)性質(zhì)粒對(duì)照，CK2:非轉(zhuǎn)基因苗陰性對(duì)照，空白雙蒸水對(duì)照，1-6是C/7L4Z7-/7到 CiylAb~t60圖6為T(mén)tl代轉(zhuǎn)化體目的蛋白CrylAb-t的檢測(cè)圖譜(圖中箭頭指示為目的蛋 白)，CKl:未轉(zhuǎn)基因苗陰性對(duì)照；1-6是O7MA-W到07L4Z7-/6。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下述實(shí)施例中的試驗(yàn)方法，如無(wú)特別 說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料及試劑，如無(wú)特別說(shuō)明，均購(gòu)自常 規(guī)生化試劑公司。實(shí)施例1基因的設(shè)計(jì)與人工合成
基因是在Bt基因C/7L46的原始核苷酸序列的基礎(chǔ)之上，留下部分缺失的 N端1845bp的一段堿基序列SEQ ID No.2,并且在保持保留序列氨基酸組成總體不變的情 況下，采用植物基因的偏愛(ài)性密碼子置換原始Bt的對(duì)應(yīng)密碼子，消除Bt基因中ATTTA、 AATGAA等富含AT序列和不明確的內(nèi)含子序列，并剔除基因中存在的大的反向重復(fù)序列 和常用限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)序列，設(shè)計(jì)出目標(biāo)合成的Bt基因的編碼序列如序列表SEQ ID No.l 所示。對(duì)原始Bt抗蟲(chóng)基因CrylAb與合成的新Bt基因CrylAb_t核苷酸編碼序列進(jìn)行 Blast2比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)保留的5’端1845bp核苷酸序列與改造的新Bt基因核苷酸序列同 源性為66.2%。堿基組成的統(tǒng)計(jì)結(jié)果為對(duì)于改造后的CrylAb-t基因，在1845個(gè)堿基 中，改變了 1221個(gè)堿基，從而使G+C含量為由37.3%提高到62.7%。改造合成新的Bt抗蟲(chóng)基因委托上海生物工程有限公司(2010年6月) 合成。所用試劑上海生物工程有限公司。具體方法步驟如下；
(1)用DNAwork軟件根據(jù)需要合成基因序列設(shè)計(jì)引物(寡核苷酸單鏈) 58條，每條35-45bp，每條約33ug，約為10D。(2) PCR連接引物為雙鏈DNA，兩輪PCR。第一輪PCR CrylAb-t分三段進(jìn)行擴(kuò)增 1-10引物 9-23引物 33-58引物
第一輪反應(yīng)體系
引物 1Iul (1 OD/400ul H2O)約 6 nmol
引物 2Iul (1 OD/400ulH20)約 6 nmol
dNTPIul (IOmM)Pfu IOXBuffer 5ul (200mM TrisHCl,pH8.8 ； IOOmM KCl ； 20mM MgSO4 ； 160mM (NH4) 2HS04 ； 1 % Triton and lmg/mlBSA)
模板(引物 1-10 或 95-23 或 33-28) 26X0.2ul ； 28X0.2ul ； 24X0.2ul Pfu 酶0.25 (5U/ul)
加水至50ul
反應(yīng)參數(shù)95°C 3min ； 94°C Imin, 55°C 45S，72°C Imin, 20 個(gè)循環(huán)；72°C 延伸
2min
第二輪反應(yīng)體系
引物 1Iul (1 OD/400ul H2O)約 6 nmol
引物 2Iul (1 OD/400ulH20)約 6 nmol
dNTPIul (IOmM)
Pfti 10 X Buffer5ul (200mM Tris-HCl，pH8.8 ； IOOmM KCl ； 20mM MgS04 ； 160mM (NH4) 2HS04 ； 1 % Triton and lmg/mlBSA)
模板第一輪反應(yīng)液1-26，25-52，51-48各2ul
Pfu 酶0.25 (5U/ul)
加水至50ul
(以上所用試劑均為上海生物工程有限公司生產(chǎn))
反應(yīng)參數(shù)95 °C 3min ； 94 °C Imin, 59 °C 45S，72 °C Imin, 22 個(gè)循環(huán)；2°C 延伸
3min
(3) 1%瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)三段清晰的特異性條帶，大小與預(yù)計(jì)相符合。(4)用凝膠回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物。(5)把三段PCR產(chǎn)物分別做克隆，提出質(zhì)粒，酶切檢測(cè)并測(cè)序。然后把得到 三個(gè)正確質(zhì)粒做模板設(shè)計(jì)全長(zhǎng)PCR方案，進(jìn)行PCR擴(kuò)增就得到新改造的基因， 基因全長(zhǎng)1848bp，基因序列如序列表SEQ ID No.l所示。(6)然后再次對(duì)基因全長(zhǎng)PCR產(chǎn)物做克隆測(cè)序工作，然后得到一個(gè) 平端克隆到pUC57上的質(zhì)粒，此質(zhì)粒含有人工合成的CrylAb-t基因，命名為pUClAb_t 載體。實(shí)施例2 CrylAb-t基因在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)和表達(dá)產(chǎn)物的毒性檢測(cè) 為快速檢測(cè)新改造的Bt抗蟲(chóng)蛋白CrylAb-t對(duì)玉米螟的毒性情況，我們構(gòu)建了
CrylAb-t基因的原核表達(dá)載體，對(duì)抗蟲(chóng)蛋白CrylAb_t毒性進(jìn)行體外檢測(cè)。質(zhì)粒pUClAb-t由上海生物工程公司提供，含有基因。根據(jù)構(gòu)建 C/7L4Z；-/基因原核表達(dá)載體的需要，在引物序列的5’端添加MfeZ內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)序列 CATATG，3端添加Η ////內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)序列AAGCTT。設(shè)計(jì)引物序列為(如SEQ ID ΝΟ:4、5 所示)
上游引物 Fl 5-CATATGGACAACAACCCAAACATC-3 下游引物 Rl 5-AAGCTTCTAGTACTCAGCCTCGAATG-3
原核表達(dá)載體為Novgen公司的pET_28b，其啟動(dòng)子為T(mén)7 lac;所用表達(dá)菌株為 BL2KDE3),該菌株也適用于其它帶T7 Iac啟動(dòng)子的表達(dá)載體。載體構(gòu)建方法流程如 下第一步PCR擴(kuò)增O7MA-/基因，以pUCL4々-7質(zhì)粒為模板，以Fl和Rl為引物， 5’端添加MfeZ內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，3’端添加ife^///內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。用凝膠回收試劑 盒回收純化基因片段；
第二步用限制性?xún)?nèi)切酶Mfe/和萬(wàn)zk////酶切pET28b，凝膠回收試劑盒回收純化 5.3kb片段；
第三步將兩個(gè)純化后的片段進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)建所得原核表達(dá)質(zhì)粒命名為 pET28bL4A-/，用限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定，表明載體構(gòu)建正確(見(jiàn)圖1)；
第四步用構(gòu)建好的pET28bL46-/質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，并以轉(zhuǎn)入無(wú)插 入片斷的表達(dá)載體質(zhì)粒pET28b轉(zhuǎn)化的BL21為對(duì)照菌株。用含有pETMZ;-/的大腸桿菌BL21菌液經(jīng)IPEG誘導(dǎo)后，提取Bt蛋白，以清水 和含空載體pET28b大腸桿菌BL21菌液為對(duì)照，用玉米螟進(jìn)行蟲(chóng)試，具體步驟如下
①?gòu)钠桨迳咸舫鰡慰寺〗臃N在5ml含50mg/mlKan的LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖床 培養(yǎng)過(guò)夜；
②將過(guò)夜菌以1:100的比例接種到5mlLB液體培養(yǎng)基中，37°C搖床培養(yǎng)至OD_達(dá) 0.4-1 ；
③加入IPTG至終濃度為0.5mM，培養(yǎng)4小時(shí)；
④4000rpm離心lOmin，收集菌體；
⑤加入36ml裂解緩沖液(2mMTris-HCl ； 0.2mM CaCl2 ； PH=8.0)，重新懸浮菌
體，加入溶菌酶至終濃度lmg/ml，冰上放置30min;
⑥超聲波破碎菌體(破碎參數(shù)超聲1秒，間隔2秒)，4000rpm離心lOmin，收集
上清；
⑦將收集的上清加入到自己配置的飼料中。以含空載體pET28b大腸桿菌BL21菌液 為對(duì)照，用玉米螟進(jìn)行蟲(chóng)試在每個(gè)試管中放入一條飼料，并接入10頭初孵未進(jìn)食玉米 螟，各接10個(gè)試管。放入溫度26 28°C，相對(duì)濕度70%左右的環(huán)境中培養(yǎng)，進(jìn)行毒性 鑒定。試驗(yàn)結(jié)果表明人工改造合成的蛋白有較好的殺蟲(chóng)效果，玉米螟的死亡 率達(dá)到86.63%，而且對(duì)玉米螟的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，活蟲(chóng)單只蟲(chóng)重僅有0.1610 (見(jiàn) 表1)。表1 CrylAb-t基因原核表達(dá)產(chǎn)物的毒性鑒定 _
權(quán)利要求
1.一種人工合成抗蟲(chóng)基因CiylAb-t,其核苷酸序列如SEQ ID ΝΟ:1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述人工合成抗蟲(chóng)基因CrylAb-t,其氨基酸序列如SEQID NO:3所示。
3.一種含有權(quán)利要求1或2所述人工合成Bt抗蟲(chóng)基因CrylAb-t的原核表達(dá)載體。
4.一種由權(quán)利要求3所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞BL21 (DE3)。
5.一種由權(quán)利要求1所述抗蟲(chóng)基因編碼的殺蟲(chóng)蛋白。
6.一種含有權(quán)利要求5所述Bt殺蟲(chóng)晶體蛋白的殺蟲(chóng)劑。
7.一種含有權(quán)利要求1或2所述人工合成抗蟲(chóng)基因CiylAb-t的植物表達(dá)載體。
8.一種由權(quán)利要求7所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞LBA4404。
9.權(quán)利要求1或2所述基因CrylAb-t或權(quán)利要求3所述表達(dá)載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)方 法進(jìn)行玉米遺傳轉(zhuǎn)化。
10.權(quán)利要求1或2所述基因ClylAb-t或權(quán)利要求3所述表達(dá)載體在培育轉(zhuǎn)基因植物 中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種抗蟲(chóng)基因Cry1Ab-t及其編碼蛋白，該基因是在保持原始蘇云金芽胞桿菌Bt蛋白Cry1Ab部分氨基酸序列不變的前提下，使用植物偏愛(ài)性密碼子，減少了原始DNA序列中的富含AT序列和存在的反向重復(fù)序列以及不明確的真核DNA序列內(nèi)含子序列，通過(guò)人工改造合成新的Cry1Ab-t基因序列，然后對(duì)該基因進(jìn)行原核表達(dá)載體和植物表達(dá)載體的構(gòu)建，并進(jìn)行相應(yīng)宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。體外實(shí)驗(yàn)證明改造合成的Bt毒蛋白對(duì)玉米螟有顯著的殺蟲(chóng)效果，本發(fā)明的抗蟲(chóng)基因Cry1Ab-t及其表達(dá)的目的蛋白能夠在玉米中穩(wěn)定高效表達(dá)，進(jìn)而用于培育轉(zhuǎn)Cry1Ab-t基因抗蟲(chóng)玉米。該人工改造合成Bt抗蟲(chóng)基因Cry1Ab-t也可以在提高其它農(nóng)作物、果樹(shù)或蔬菜等抗蟲(chóng)性中的得到應(yīng)用。
文檔編號(hào)A01N63/02GK102010873SQ201010552618
公開(kāi)日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2010年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月22日
發(fā)明者盧彩霞, 孫靜, 岳潤(rùn)清, 朱衛(wèi)紅, 柏松, 王延召, 鐵雙貴, 齊建雙 申請(qǐng)人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院