專利名稱：利用pRC/CMV-EGFP質(zhì)粒創(chuàng)制轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白基因叉尾斗魚方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用pRC/CMV-EGFP質(zhì)粒創(chuàng)制轉(zhuǎn)基因叉尾斗魚方法。
背景技術(shù)：
pRC/CMV是一種具有CMV強(qiáng)啟動(dòng)子的真核表達(dá)載體，也是一種功能強(qiáng)大的轉(zhuǎn)基因 載體，具有CMV啟動(dòng)子，源于BGH的轉(zhuǎn)錄終止信號，SV40復(fù)制原點(diǎn)。以pRC/CMV為載體的 轉(zhuǎn)基因研究在人類醫(yī)學(xué)和畜禽上的研究報(bào)道較多，在水產(chǎn)動(dòng)物中也有過研究報(bào)道(如斑馬 魚)，但在叉尾斗魚上未見相關(guān)報(bào)道。叉尾斗魚Macropodus opercularis (Linnaeus)屬于 鱸形目Perciformes攀鱸科Anabantidae，是一種廣泛分布于我國南方及東南亞各國的內(nèi) 陸小型淡水觀賞魚，具有來源廣、易于傳代和飼養(yǎng)容易等優(yōu)勢。本發(fā)明將pRC/CMV真核表達(dá) 載體及EGFP引入到叉尾斗魚轉(zhuǎn)基因技術(shù)中，利用pRC/CMV為載體，將綠色熒光蛋白基因整 合到叉尾斗魚基因組內(nèi)，這一技術(shù)不僅能夠提升叉尾斗魚的觀賞價(jià)值，達(dá)到育成具有特異 性功能叉尾斗魚新品種，而且還是首次將pRC/CMV-EGFP質(zhì)粒導(dǎo)入叉尾斗魚中，開辟和豐富 了轉(zhuǎn)基因水產(chǎn)動(dòng)物的種類和方法，具有重要理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用pRC/CMV為載體，將綠色熒光蛋白基因整合到叉尾 斗魚基因組內(nèi)，創(chuàng)制轉(zhuǎn)基因叉尾斗魚方法，是先構(gòu)建含Amp抗性基因、PCMV啟動(dòng)子、綠色熒 光蛋白標(biāo)志基因和SV40的多聚腺苷酸識別序列的pRC/CMV-EGFP質(zhì)粒，利用顯微注射的轉(zhuǎn) 基因技術(shù)將這種質(zhì)粒導(dǎo)入叉尾斗魚基因組內(nèi)，借助綠色熒光蛋白基因的作用篩選、創(chuàng)制成 一種轉(zhuǎn)基因叉尾斗魚，這一轉(zhuǎn)基因技術(shù)的建立不僅能夠提升叉尾斗魚的觀賞價(jià)值，達(dá)到育 成具有特異性功能的叉尾斗魚新品種，而且還是首次以叉尾斗魚作為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行轉(zhuǎn)基因 研究，拓寬了轉(zhuǎn)基因水產(chǎn)動(dòng)物的研究空間。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案的步驟如下(1)采用分子克隆技術(shù)和基因重組的方法，將具有CMV強(qiáng)啟動(dòng)子的PRC/CMV真核表 達(dá)載體與EGFP連接構(gòu)建獲得帶有綠色熒光標(biāo)記基因的pRC/CMV-EGFP真核表達(dá)質(zhì)粒，pRC/ CMV-EGFP質(zhì)粒包含Amp抗性基因、PCMV啟動(dòng)子、綠色熒光蛋白標(biāo)志基因和SV40的多聚腺苷 酸識別序列。(2)采用顯微注射轉(zhuǎn)基因方法，將pRC/CMV-EGFP質(zhì)粒導(dǎo)入叉尾斗魚受精卵代， 飼養(yǎng)至成魚以交配續(xù)代G1代，在G1代的胚胎發(fā)育至仔魚時(shí)期，通過選擇熒光標(biāo)志基因獲得 穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因叉尾斗魚。所述的采用顯微注射轉(zhuǎn)基因方法的注射時(shí)間是產(chǎn)卵后1小時(shí)以內(nèi)、處于單細(xì)胞時(shí) 期的叉尾斗魚受精卵，顯微注射的pRC/CMV-EGFP質(zhì)?？倽舛仍?0ng/ μ 1 250ng/ μ 1之 間，質(zhì)粒溶解在0. ImM 2mM含有ImM 8mM氯化鈉的磷酸緩沖液中；每粒受精卵注射質(zhì)粒 的總體積在0. 5nl 5nl之間。
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轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白基因叉尾斗魚的挑選和驗(yàn)證方法為通過熒光體視顯微鏡篩選表 達(dá)綠色熒光蛋白標(biāo)志的轉(zhuǎn)基因叉尾斗魚，熒光體視顯微鏡的激發(fā)波長為460nm 490nm，發(fā) 射波長為5IOnm 550nm。本發(fā)明具有的有益效果是可以借助熒光標(biāo)記基因篩選轉(zhuǎn)基因叉尾斗魚個(gè)體，這種轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白基因叉尾 斗魚能夠提升叉尾斗魚的觀賞價(jià)值，達(dá)到育成具有特異性功能的叉尾斗魚新品種。另外，開 拓了叉尾斗魚轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究，為拓寬轉(zhuǎn)基因水產(chǎn)動(dòng)物的研究空間打下基礎(chǔ)。


圖1是pRC/CMV-EGFP質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。圖2是&代魚綠色熒光蛋白基因PCR檢測結(jié)果一。圖3是&代魚綠色熒光蛋白基因PCR檢測結(jié)果二。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1 采用顯微注射方法，將攜帶綠色熒光蛋白(EGFP)標(biāo)記基因的pRC/CMV-EGFP質(zhì) 粒(圖1)的濃度調(diào)節(jié)為40ng/y 1，質(zhì)粒溶解在0. ImM含有SmM氯化鈉的磷酸緩沖液中，然 后在叉尾斗魚產(chǎn)卵1小時(shí)內(nèi)采用顯微注射方法導(dǎo)入受精卵中，導(dǎo)入部位為受精卵動(dòng)物極， 導(dǎo)入總體積為5nl。從轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)WG1代叉尾斗魚的胚胎發(fā)育時(shí)期開始，通過熒光顯微 鏡(Olympus，SZX12，日本)篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)EGFP標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)基因斗魚，激發(fā)波長為 460nm 490nm，發(fā)射波長為 5 IOnm 550nm。一共注射了 1338粒受精卵，代獲得了 215尾叉尾斗魚，G1代中有14尾叉尾斗魚 為轉(zhuǎn)基因魚。在檢出的G1代轉(zhuǎn)基因叉尾斗魚個(gè)體中，EGFP分別在尾部(3尾)、眼部(9尾) 和腹部0尾)表達(dá)。將上述轉(zhuǎn)基因魚中的4尾魚(尾部1尾、眼部2尾和腹部1尾)，采用 PCR技術(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)了 EGFP標(biāo)記基因已成功導(dǎo)入了叉尾斗魚中(圖2)。PCR上下 游引物分別為5 ‘ -ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3 '和 5 ‘ -ATTAGGAAAGGACAGTGGGAGTGG-3 ‘。 在圖2中，泳道4至7為為G1代轉(zhuǎn)基因叉尾斗魚陽性魚，其中泳道4為尾部表達(dá)EGFP的轉(zhuǎn)基 因魚、泳道5和6為眼部表達(dá)EGFP的轉(zhuǎn)基因魚、泳道7為腹部表達(dá)EGFP的轉(zhuǎn)基因魚；泳道2 和3為非轉(zhuǎn)基因叉尾斗魚的陰性對照；泳道1為pRC/CMV-EGFP質(zhì)粒陽性對照；Marker為分 子標(biāo)記，單位為bp,從上而下條帶分子量為:2000bp, IOOObp, 750bp, 500bp, 200bp, IOObp0 另外，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳分離，切下目的條帶，用膠回收試劑盒(上 海生工)純化，與PMD18-T載體(TaKaRa)連接，16°C過夜，轉(zhuǎn)化到HBlOl感受態(tài)細(xì)胞中，采 用藍(lán)白斑挑選陽性克隆，使用EcoR I.Hind III(TaKaRa)雙酶切驗(yàn)證，陽性克隆送上海生物 工程有限公司測序，測得序列長度為968bp，所得序列經(jīng)Blast同源搜索確定為EGFP序列。實(shí)施例2:采用顯微注射方法，將攜帶EGFP標(biāo)志基因的pRC/CMV-EGFP質(zhì)粒的濃度為250ng/ μ 1，質(zhì)粒溶解在2mM含有ImM氯化鈉的磷酸緩沖液中，然后在叉尾斗魚產(chǎn)卵1小時(shí)內(nèi)導(dǎo)入 受精卵中，導(dǎo)入總體積為0.5nl。從轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)G1代叉尾斗魚的胚胎發(fā)育時(shí)期開始，通過
4熒光顯微鏡(Olympus，SZX12，日本)篩選表達(dá)EGFP標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)基因斗魚，激發(fā)波長為 460nm 490nm，發(fā)射波長為 5 IOnm 550nm。轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)一共注射了 1188粒受精卵，獲得了 220尾叉尾斗魚，G1代中有13 尾叉尾斗魚為轉(zhuǎn)基因魚。在檢出的&代轉(zhuǎn)基因叉尾斗魚個(gè)體中，分別在尾部0尾)、眼 部(8尾)和腸道(3尾)具有綠色熒光表達(dá)。將上述轉(zhuǎn)基因魚中的4尾魚(尾部1尾、 眼部2尾和腹部1尾)，采用PCR技術(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)了 EGFP標(biāo)記基因已成功導(dǎo) 入了叉尾斗魚中(圖3)。PCR上下游引物分別為5 ‘ -ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3 ‘和 5 ‘ -ATTAGGAAAGGACAGTGGGAGTGG-3 ‘。在圖3中，泳道1為非轉(zhuǎn)基因的陰性對照。泳道2 和3表示pRC/CMV-EGFP質(zhì)粒陽性對照；泳道4至7為G1代4尾轉(zhuǎn)基因叉尾斗魚，其中泳道 4為尾部表達(dá)EGFP的轉(zhuǎn)基因魚、泳道5和6為眼部表達(dá)EGFP的轉(zhuǎn)基因魚、泳道7為腸道表 達(dá)EGFP的轉(zhuǎn)基因魚；Marker為分子標(biāo)記，單位為bp，從上而下條帶分子量為2000bp, IOOObp, 750bp, 500bp, 200bp, IOObp。另外，對 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 0. 8 % 的 瓊脂糖凝膠電泳分離，切下目的條帶，用膠回收試劑盒(上海生工)純化，與PMD18-T載 體(TaKaRa)連接，16°C過夜，轉(zhuǎn)化到HBlOl感受態(tài)細(xì)胞中，采用藍(lán)白斑挑選陽性克隆，使用 EcoR I.Hind III(TaKaRa)雙酶切驗(yàn)證，陽性克隆送上海生物工程有限公司測序，測得序列 長度為968bp，所得序列經(jīng)Blast同源搜索確定為EGFP序列。實(shí)施例3 攜帶EGFP標(biāo)記基因的pRC/CMV-EGFP質(zhì)粒(圖1)的濃度為150ng/ μ 1，質(zhì)粒溶解 在0. 6mM含有4mM氯化鈉的磷酸緩沖液中，在叉尾斗魚產(chǎn)卵1小時(shí)內(nèi)顯微注射導(dǎo)入受精卵 中，導(dǎo)入部位為受精卵動(dòng)物極，導(dǎo)入總體積為2nl。從轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)的G1叉尾斗魚的胚胎發(fā)育 時(shí)期開始，通過熒光顯微鏡(Olympus，SZX12，日本)篩選表達(dá)EGFP標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)基因斗魚， 激發(fā)波長為460nm 490nm，發(fā)射波長為5IOnm 550nm。一共注射了 971粒受精卵，獲得了 219尾叉尾斗魚，G1代中有14尾叉尾斗魚為轉(zhuǎn) 基因魚。在檢出的G1代轉(zhuǎn)基因叉尾斗魚個(gè)體中，EGFP有在尾部0尾)、眼部(11尾)和腸 道(1尾)表達(dá)的個(gè)體。采用PCR技術(shù)也證實(shí)了 EGFP標(biāo)記基因的成功轉(zhuǎn)入。轉(zhuǎn)基因叉尾斗 魚飼養(yǎng)再至成魚交配產(chǎn)卵續(xù)代。綜上所述，利用pRC/CMV-EGFP質(zhì)粒已獲得能夠穩(wěn)定遺傳和表達(dá)EGFP熒光標(biāo)記基 因的轉(zhuǎn)基因叉尾斗魚，證明具有CMV強(qiáng)啟動(dòng)子的PRC/CMV真核表達(dá)載體可以作為叉尾斗魚 的一個(gè)轉(zhuǎn)基因載體。
權(quán)利要求
1.一種利用PRC/CMV-EGFP質(zhì)粒創(chuàng)制轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白基因叉尾斗魚方法，該方法的步 驟如下(1)采用分子克隆技術(shù)和基因重組的方法，將具有CMV強(qiáng)啟動(dòng)子的PRC/CMV真核表達(dá) 載體與EGFP連接構(gòu)建獲得帶有綠色熒光標(biāo)記基因的pRC/CMV-EGFP真核表達(dá)質(zhì)粒，pRC/ CMV-EGFP質(zhì)粒包含Amp抗性基因、PCMV啟動(dòng)子、綠色熒光蛋白標(biāo)志基因和SV40的多聚腺苷 酸識別序列；(2)采用顯微注射轉(zhuǎn)基因方法，將pRC/CMV-EGFP質(zhì)粒導(dǎo)入叉尾斗魚受精卵代，飼養(yǎng) 至成魚以交配續(xù)代G1代，在G1代的胚胎發(fā)育至仔魚時(shí)期，通過選擇熒光標(biāo)志基因獲得穩(wěn)定 遺傳的轉(zhuǎn)基因叉尾斗魚。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用pRC/CMV-EGFP質(zhì)粒創(chuàng)制轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白基因叉尾 斗魚方法，其特征在于所述的采用顯微注射轉(zhuǎn)基因方法的注射時(shí)間是產(chǎn)卵后1小時(shí)以內(nèi)、 處于單細(xì)胞時(shí)期的叉尾斗魚受精卵，顯微注射的pRC/CMV-EGFP質(zhì)?？倽舛仍?0ng/μ 1 250ng/ μ 1之間，質(zhì)粒溶解在0. ImM 2mM含有ImM 8mM氯化鈉的磷酸緩沖液中；每粒受 精卵注射質(zhì)粒的總體積在0. 5nl 5nl之間。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用pRC/CMV-EGFP質(zhì)粒創(chuàng)制轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白基因叉 尾斗魚方法，其特征在于轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白基因叉尾斗魚的挑選和驗(yàn)證方法為通過熒光 體視顯微鏡篩選表達(dá)綠色熒光蛋白標(biāo)志的轉(zhuǎn)基因叉尾斗魚，熒光體視顯微鏡的激發(fā)波長為 460nm 490nm，發(fā)射波長為 5 IOnm 550nm。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用pRC/CMV-EGFP創(chuàng)制轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白基因叉尾斗魚方法。是先構(gòu)建帶有綠色熒光蛋白基因的pRC/CMV-EGFP質(zhì)粒，利用顯微注射技術(shù)將這種質(zhì)粒導(dǎo)入到叉尾斗魚受精卵內(nèi)，使綠色熒光蛋白基因?qū)氲讲嫖捕肤~基因組內(nèi)，并得到穩(wěn)定遺傳和表達(dá)，從而創(chuàng)制成一種轉(zhuǎn)基因叉尾斗魚，這種轉(zhuǎn)基因叉尾斗魚既能夠用于基因功能研究又提升了其觀賞價(jià)值。
文檔編號A01K67/027GK102121032SQ20101057743
公開日2011年7月13日 申請日期2010年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月3日
發(fā)明者危浩, 葉少群, 莊蘭芳, 楊國梁, 王軍毅, 鐘伯雄, 高強(qiáng), 龍勇 申請人:浙江大學(xué), 浙江省淡水水產(chǎn)研究所