專利名稱：一種高頻誘導大豆叢生芽的高效轉基因方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，確切地說是一種高頻誘導大豆叢生芽的高效轉基因方 法。
背景技術：
大豆，屬于蝶形花科，大豆屬。是全世界最重要的高蛋白油料經(jīng)濟作物之一，是人 類食物和動物養(yǎng)殖的主要植物性蛋白來源。目前全世界超過5千萬公頃的土地被用于種植 大豆，因此如何提高大豆的品質和產(chǎn)量具有戰(zhàn)略性意義?，F(xiàn)代生物技術的研究和發(fā)展為通 過基因工程改良農(nóng)副產(chǎn)品提供了必要的前提，所以人們發(fā)明了很多轉基因的方法。主要有 基因槍轉化法、農(nóng)桿菌介導轉化法、花粉管通道法、病毒介導轉化(瞬時轉染)、脂質體介導 原生質體轉化等。這些方法應用于大豆、玉米、小麥等糧食作物和油菜等經(jīng)濟作物，極大地 促進了植物品質或者作物品種的遺傳改良，為經(jīng)濟和社會的發(fā)展做出了重大貢獻。傳統(tǒng)的農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化方法，是利用根癌農(nóng)桿菌對植物的侵染特性從而把 外源基因導入植物基因組的方法。因其拷貝數(shù)低，整合完整，遺傳比較穩(wěn)定，受目的基因分 子量的影響較小以及操作簡便，廣泛地應用于植物的遺傳轉化。但是無論是大豆、玉米還是 小麥等重要的農(nóng)作物，其轉基因的轉化效率和再生效率都不高，僅僅2% -5%。這樣就給人 力資源、財務成本造成了極大的浪費，也延長了成果產(chǎn)出及釋放的時間和空間。因此本發(fā)明目的在于建立大豆高頻的叢生芽再生體系及高效的農(nóng)桿菌遺傳轉化 體系，同時提高大豆的再生效率及轉化效率。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的是，提供一種高頻誘導大豆叢生芽的高效轉基因方法。該方法，包括以下步驟1)將無菌培養(yǎng)的大豆幼苗沿著下胚軸與子葉的生長點，去掉下胚軸和部分初生 葉，保留初生葉基部，制備外植體；2)將外植體放入離心管中，加入含待轉化目的基因的農(nóng)桿菌液至50ml，20_200目 的分析純石英砂2. 0-2. 3g，在漩渦震蕩儀中，2000-3000rpm漩渦震蕩混合5_10分鐘后，吸
干多余菌液，接種于固體共培養(yǎng)培養(yǎng)基中；3)外植體轉移到SIM培養(yǎng)基中誘導抗性叢生芽和/或MBT組織再生；4)按常規(guī)方法繼續(xù)培養(yǎng)。所述的步驟1)是將無菌苗沿著下胚軸與子葉的生長點分生組織去掉兩片子葉、 初生葉以及多余的下胚由，制備外植體；所述的農(nóng)桿菌為根癌農(nóng)桿菌EHA105或根癌農(nóng)桿菌AGLl ；優(yōu)選為加石英砂2. 3克，3000rpm漩渦震蕩混合10分鐘，25°C黑暗培養(yǎng)M小時。采用本發(fā)明的方法實現(xiàn)的大豆高頻叢生芽組織的誘導與轉化，較傳統(tǒng)的農(nóng)桿菌介 導的遺傳轉化方法有以下優(yōu)勢
(1)本發(fā)明首次率先采用石英砂微小顆粒(分析純級)與工程農(nóng)桿菌液充分混 勻在vortex-shaker (QL866)上劇烈渦旋震蕩外植體的方法，均勻制造傷口，降低共培養(yǎng)時 間，既減輕對植物外植體的毒害作用，同時又加大了農(nóng)桿菌的侵染面積，從而大大提高了大 豆的遺傳轉化效率。(2)使用的外植體從初生葉節(jié)基部(生長點處)去掉子葉以及初生葉(見附圖1)， 對外植體基本上沒有傷害，與傳統(tǒng)的農(nóng)桿菌介導的子葉節(jié)轉化相比在芽誘導培養(yǎng)基形成更 多的叢生芽(MBT)組織/芽葉枕的組織塊，它們在農(nóng)桿菌感染約3周后可檢測到轉基因的 芽原基，且再生頻率很高，可達到80% -90%以上，從這一點可以大大提高大豆叢生芽的再 生效率。(3)采用本發(fā)明方法獲得的外植體易于大量擴繁抗性叢生芽組織(MBT)，較傳統(tǒng) 的方法更低成本、更省時、更省力地獲得大量的轉基因植株。(4)浸染周期縮短，本發(fā)明使共培養(yǎng)時間降低為2天，而傳統(tǒng)的方法共培養(yǎng)時間為 3天，既減輕對植物外植體的毒害作用，又不至于影響其轉化效率。(5)另外本發(fā)明還有一個顯著特征節(jié)省更多培養(yǎng)基與培養(yǎng)空間，對于傳統(tǒng)的了 葉節(jié)轉化方法，在一個培養(yǎng)皿僅可以培養(yǎng)5個外植體，然而本發(fā)明在單個培養(yǎng)皿可放置高 達15個外植體。(6)因生長點分生組織細胞在所有大豆栽培種中具有相似的再生能力，所以此方 法不受基因型限制，可適用于絕大多數(shù)大豆栽培品種，而且操作十分簡便，成本十分低廉， 轉化效率提高，可以大量快速的獲得人類所需要的轉基因植株，大大的加快了大豆的新品 種培育的研發(fā)進程。


圖1為高頻誘導大豆叢生芽的高效轉基因方法外植體的制備示意圖。圖2為傳統(tǒng)子葉節(jié)轉基因方法外植體的制備示意圖。圖3為pBI121質粒圖譜。圖4為高頻誘導大豆叢生芽的高效轉基因方法流程圖。圖5為傳統(tǒng)子葉節(jié)轉基因方法流程圖。圖6為目的基因在轉基因植株中的表達。
具體實施例方式下面通過具體實施方法進一步說明本發(fā)明的內容和效果，本實施方法僅為更進一 步的闡述本發(fā)明的有關細節(jié)以及優(yōu)選的實施方案，實施例并不以任何形式限制本發(fā)明的應 用范圍。實施例11.外植體制備通過氯氣消毒法對大豆種子進行表面消毒。將200粒大豆種子平均放入兩個開口 培養(yǎng)皿，置于一封閉容器中，在盛有100ml70%次氯酸鈉的燒杯中加入3mll2mol/L濃鹽酸， 要沿著燒杯壁一滴一滴的加，過夜熏蒸消毒，注意密封。消毒后的種子接種于種子萌發(fā)培養(yǎng) 基 GM(見附圖 4A) (B5/B5+2%蔗糖 +3mM MES+TDZ 0. lmg/L+0. 8%瓊脂，pH5. 8) 25°C預培養(yǎng)7天后(見附圖4B)，分別用本發(fā)明和傳統(tǒng)的方法制備外植體，本發(fā)明方法將100個萌發(fā) 的無菌苗沿著下胚軸與子葉的生長點分生組織去掉兩片子葉、初生葉以及多余的下胚軸， 獲得用于轉化的100個外植體(見附圖1)；傳統(tǒng)方法將100個萌發(fā)的無菌苗沿著子葉的 生長點分生組織去掉多余的下胚軸、初生葉，保留兩片子葉，獲得用于轉化的100個外植體 (見附圖2)。2.外植體侵染(1)工程農(nóng)桿菌菌液制備將含有pBI121質粒載體(質粒圖譜見附圖3)的根癌 農(nóng)桿菌菌種(EHA105/AGL1分別由本實驗室保存)加入到50毫升含有卡那霉素的YEP液體 培養(yǎng)基中(酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L，ρΗ7· 0)，28°C，180_200rpm過夜培養(yǎng) 至 OD6tl2 在 0. 5-0. 7 之間。在 Sigma HermleZ36HK centrifuge 5000rpm 離心 10 分鐘收集 菌體，用共培養(yǎng)液(1/10Β5/Β5+3%蔗糖 +200 μ M 乙酰丁香酮 +20mM MES+0. 03% Silwet77, pH5. 4)重懸至 OD6tltl = 0. 5-0. 7。(2)將上述重懸的農(nóng)桿菌侵染液與經(jīng)本發(fā)明方法制備的100個外植體一起加入盛 有2. 3g石英砂微小顆粒(北京化工廠生產(chǎn)，分析純級20-200目)的無菌50ml離心管中充 分混勻在vortex-shaker (QL866)上2000-3000rpm劇烈渦旋震蕩外植體，進行農(nóng)桿菌侵染。 侵染時間為5-lOmin ；而將上述重懸的農(nóng)桿菌侵染液與經(jīng)傳統(tǒng)方法制備的100個外植體一 起加入100毫升燒瓶中在HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱中，25°C，3000rpm進行農(nóng)桿菌侵染。侵 染時間為15-30min。3.外植體共培養(yǎng)分別將上述經(jīng)兩種方法侵染后的外植體用無菌濾紙吸干多余菌液，接種于鋪有無 菌濾紙的固體共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，其中，本發(fā)明方法25°C，黑暗培養(yǎng)對小時(見附圖4C)；而 傳統(tǒng)方法25°C，黑暗培養(yǎng)72小時(見附圖5C)。4.叢生芽/MBT組織誘導分別將上述兩種方法共培養(yǎng)的外植體轉移到SIM培養(yǎng)基(B5/B5+3 %蔗糖 +BAO. 5mg/L+250mg/L Cef+100mg/L Kan+3mM MES+0. 8%瓊脂，pH5. 8)中誘導抗性叢生芽 / MBT組織再生，經(jīng)本發(fā)明方法處理的外植體會先產(chǎn)生MBT組織，再進一步分化出大量的叢生 芽(見附圖4D，4E)；而傳統(tǒng)方法則直接產(chǎn)生叢生芽(見附圖5D，5E，5F)。均25°C，18/6小 時培養(yǎng)30天，每隔兩周轉移一次外植體到新鮮的SIM培養(yǎng)基中。每次轉移都要在外植體的 基底處做一個新切口。5. MBT組織增殖將上述經(jīng)本發(fā)明方法得到的抗性MBT組織轉移至繼代培養(yǎng)基中，大量增殖MBT組 織(見附圖 4F)。(B5/B5+3%蔗糖+TDZ 0. lmg/L+250mg/L Cef+100mg/L Kan+3mM MES+0. 8% 瓊脂，ρΗ5· 8)6.抗性叢生芽伸長分別將上述經(jīng)兩種方法分化的抗性叢生芽轉移至伸長培養(yǎng)基SEM中(1/2MS/ Β5+2%蔗糖+lmg/L玉米素核糖核苷+0. lmg/L吲哚乙酸+0. 5mg/L赤霉素+100mg/L焦谷氨 酸+50mg/L天冬酰胺+250mg/L Cef+3mM MES+0. 8%瓊脂，pH5. 8)。直至抗性叢生芽伸長至 3-4厘米的幼苗(見附圖4G，5G)。7.抗性植株生根
分別將上述經(jīng)兩種方法伸長的幼苗轉移至生根培養(yǎng)基RM中(l/2MS/MS+2%蔗糖 +0. 5mg/LNAA+100mg/L 焦谷氨酸 +50mg/L 天冬酰胺 +250mg/L Cef+3mM MES+0. 8 % 瓊脂， pH5. 8)。直至抗性植株長出2-3條根系(見附圖4H，5H)。8.轉基因植株鑒定待上述經(jīng)兩種方法再生植株的葉片長至合適大小時，分別剪取轉基因及非轉 基因大豆葉片進行檢測。本實施例中采用熒光光度計法測定其GUS基因活性(參照 Jefferson (1987)的熒光定量方法)，三次重復試驗，取平均值，進行⑶S基因表達活性分 析。結果見表1與附圖6所示表1目的基因在轉基因植株與非轉基因植株中的表達活性分析
權利要求
1.一種高頻誘導大豆叢生芽的高效轉基因方法，包括以下步驟1)將無菌培養(yǎng)的大豆幼苗沿著下胚軸與子葉的生長點，去掉下胚軸和部分初生葉，保 留初生葉基部，制備外植體；2)將外植體放入離心管中，加入含待轉化目的基因的農(nóng)桿菌液至50ml，20-200目的分 析純石英砂2. 0-2. 3g，在漩渦震蕩儀中，2000-3000rpm漩渦震蕩混合5_10分鐘后，吸干多 余菌液，接種于固體共培養(yǎng)培養(yǎng)基中；3)外植體轉移到SIM培養(yǎng)基中誘導抗性叢生芽和/或MBT組織再生；4)按常規(guī)方法繼續(xù)培養(yǎng)。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種高頻誘導大豆叢生芽的高效轉基因方法，其特征在于 所述的外植體，是將無菌苗沿著下胚軸與子葉的生長點分生組織去掉兩片子葉、初生葉以 及多余的下胚軸，制備外植體。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的一種高頻誘導大豆叢生芽的高效轉基因方法，其特征在 于所述的農(nóng)桿菌為根癌農(nóng)桿菌EHA105或根癌農(nóng)桿菌AGLl。
4.根據(jù)權利要求3所述的一種高頻誘導大豆叢生芽的高效轉基因方法，其特征在于 優(yōu)選為加石英砂2. 3克，3000rpm漩渦震蕩混合10分鐘，25°C黑暗培養(yǎng)M小時。
全文摘要
本發(fā)明一種高頻誘導大豆叢生芽的高效轉基因方法，將無菌苗沿著下胚軸與子葉的生長點分生組織去掉兩片子葉、初生葉以及多余的下胚軸，制備外植體，采用石英砂分析純微小顆粒，與工程農(nóng)桿菌液充分混勻，在漩渦震蕩儀中上劇烈渦旋震蕩外植體，均勻制造傷口，浸染周期縮短，降低了共培養(yǎng)時間，既減輕對植物外植體的毒害作用，同時又加大了農(nóng)桿菌的侵染面積，農(nóng)桿菌介導的子葉節(jié)轉化相比在芽誘導培養(yǎng)基形成更多的叢生芽(MBT)組織/芽葉枕的組織塊，它們在農(nóng)桿菌感染約3周后可檢測到轉基因的芽原基，且再生頻率高，從而大大提高了大豆的遺傳轉化效率。
文檔編號A01H4/00GK102124947SQ20101058461
公開日2011年7月20日 申請日期2010年12月13日 優(yōu)先權日2010年12月13日
發(fā)明者張曉美, 李海燕, 王佳琦, 王南, 陳歡 申請人:吉林農(nóng)業(yè)大學