專利名稱：利用蛋白質(zhì)分子標(biāo)記選擇高解舒性狀家蠶繭的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及家蠶輔助育種選育技術(shù)，特別涉及利用蛋白質(zhì)分子標(biāo)記選擇高解舒性 狀家蠶繭的方法。
背景技術(shù)：
生絲和絲織品是我國出口商品中唯一占世界主要貿(mào)易份額的產(chǎn)品。隨著世界經(jīng)濟(jì) 持續(xù)發(fā)展帶來社會(huì)生活的深刻變化，人們對(duì)服飾等消費(fèi)品的要求越來越個(gè)性化、舒適化、高 質(zhì)化和環(huán)?；?。蠶絲是天然蛋白質(zhì)纖維，其織物有良好的吸濕性和透氣性，真絲綢具有非常 良好的保健作用，臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)并證明，特別是對(duì)皮膚搔癢癥，小兒丘疹性蕁麻癥等常見而 又難以治愈的疾病具有明顯止癢和治療作用，使真絲綢有“纖維醫(yī)學(xué)”之稱，這與其它紡織 品無可比擬。因此，絲綢制品仍然會(huì)成為充滿魅力和希望的產(chǎn)品，我國的蠶業(yè)生產(chǎn)將繼續(xù)保 持其優(yōu)勢(shì)地位。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，勞動(dòng)力價(jià)格上漲，導(dǎo)致養(yǎng)蠶成本的增加，蠶桑生產(chǎn)比較效 益下降，隨之創(chuàng)立了省力化的蠶繭生產(chǎn)技術(shù)體系，其支撐點(diǎn)是適合省力、高效飼養(yǎng)技術(shù)的蠶 品種創(chuàng)新。據(jù)日本上田悟的研究，繭的解舒對(duì)出絲率有明顯影響，繭的解舒率是制絲工業(yè)的 一項(xiàng)極為重要的經(jīng)濟(jì)指標(biāo)，提高蠶繭解舒率是提高絲綢產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。蠶繭解舒的 好壞，直接關(guān)系到出絲率、臺(tái)時(shí)產(chǎn)量、生絲品質(zhì)、原料消耗的高低。凡解舒好的蠶繭，出絲率 高、質(zhì)量好、消耗低；凡解舒不好，繅絲時(shí)落緒多、出絲率低、質(zhì)量差、消耗大。影響蠶繭解舒 率的因素是多方面的，其中以品種的性狀起主要作用。然而，蠶繭的解舒是一個(gè)遺傳力很低 的數(shù)量性狀，易受環(huán)境條件的影響，傳統(tǒng)的育種技術(shù)很難準(zhǔn)確選擇解舒率高的個(gè)體。因此選 育適合省力化養(yǎng)蠶技術(shù)并能在不良的上蔟環(huán)境條件下保持優(yōu)良解舒的實(shí)用家蠶品種成為 當(dāng)前育種的主要目標(biāo)。據(jù) Kludkiewicz, B. , Takasu, Y. , Fedic, R. , Tamura, T. , Sehnal, F. , Zurovec, M.，2009報(bào)道的家蠶粘性絲蛋白Ser2的結(jié)構(gòu)和表達(dá)(Structure and expression of the silk adhesive protein Ser2 in Bombyx mori. Insect Biochemistry and Molecular Biology 39,938-946.)；以及 Takasu，Y.，Hata，T.，Uchino，K.，Zhang, Q.，2010 報(bào)道的家蠶 非繭層中的主要絲膠成分蛋白的鑒定(Identification of Ser2proteins as major sericin components in the non-cocoon silk of Bombyx mori. Insect Biochemistry and Molecular Biology 40，339-344.)，Sercin2 蛋白(即 Ser2)是一種粘性蛋白，在普通 品種中，SericiM蛋白只在家蠶幼蟲五齡中期前表達(dá)，是家蠶非繭層絲膠的主要成分，在蛻 皮過程中起到固定蠶體的作用。通過大量重復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SericiM蛋白是在家蠶繭層絲膠 中與蠶繭解舒密切相關(guān)的蛋白質(zhì)高分子，具體表現(xiàn)為含有蛋白的繭層易于吸水溶脹， 繅絲時(shí)落緒次數(shù)少，解舒率特別高。證明含有％1^(^112的蠶繭其解舒性狀特別優(yōu)異，因此 可以作為解舒性狀選擇的蛋白質(zhì)分子標(biāo)記。但是，如何便利快捷地實(shí)現(xiàn)kricin2蛋白的檢出，以便于挑選含有kricin2蛋白 質(zhì)分子標(biāo)記的樣品個(gè)體，其方法并未見任何報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種利用蛋白質(zhì)分子 標(biāo)記選擇高解舒性狀家蠶繭的方法。該方法主要涉及用SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳技術(shù)，檢測(cè)與 家蠶繭絲解舒相關(guān)分子標(biāo)記。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的利用蛋白質(zhì)分子標(biāo)記選擇高解舒性狀家蠶繭 的方法，包括下述步驟(1)制備丙烯酰胺濃度為T%= 5%, C% = 2.6%和尺寸為8X8X0. Icm3的 SDSPAGE凝膠，凝膠上設(shè)加樣孔；(2)在待測(cè)種繭樣品上剪取IOmg繭層，加入300 μ L含有48% (m/v)尿素、4% (ν/ ν)巰基乙醇、4% (m/v) SDS的水溶液，80°C水浴處理5 15min ；吸取2 μ L上樣，以20mA/ gel進(jìn)行電泳，持續(xù)20min后結(jié)束；(3)將電泳凝膠與50mL經(jīng)60°C預(yù)熱的染色液一起放入密閉容器內(nèi)，將容器浸入 60°C水浴中；溫育15min后，將染色液倒出，水洗凝膠一遍，加入經(jīng)60°C預(yù)熱的脫色液，振蕩 lOmin，更換脫色液再振蕩IOmin ；所述染色液含有0. 1% (m/v)考馬斯亮藍(lán)R250、10% (ν/ν)乙酸和20% (ν/ν)乙 醇，余量為水；所述脫色液含5% (ν/ν)乙酸和10% (ν/ν)乙醇，余量為水；(4)凡是在電泳結(jié)果中顯示IlOkDa蛋白條帶的，即是有kricin2蛋白質(zhì)分子標(biāo)記 的樣品個(gè)體。本發(fā)明的有益效果在于用絲膠蛋白質(zhì)kriCin2為分子標(biāo)記，可以準(zhǔn)確有效的選擇高解舒?zhèn)€體，從而大幅 度的改進(jìn)家蠶繭解舒性狀，提高育種效率。傳統(tǒng)的方法需要活蛹個(gè)體繅絲，由于易受環(huán)境的 影響，選擇效率不高。而應(yīng)用本技術(shù)只要有標(biāo)記蛋白質(zhì)kricin2存在的個(gè)體，其蠶繭解舒 率就在90%以上，選種個(gè)體飼養(yǎng)規(guī)?？梢詼p少30 50%。


圖1解舒分子標(biāo)記kricin2的SDSPAGE(T = 5%,C = 2.6%)蛋白電泳示意圖。 圖中，泳道1為分子量Marker，2為含有kriCin2的高解舒繭層樣品，3-5為普通繭層樣品。圖2為圖1中各批次蠶繭絲膠蛋白SDSPAGE電泳圖譜，圖中顯示了 kricin2存在 情況。
具體實(shí)施例方式本實(shí)施例提供的家蠶解舒性狀分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)包括下述步驟(1)家蠶按常規(guī)育種技術(shù)飼養(yǎng)至上蔟結(jié)繭；(2)按選種需要選取需要留種的種繭，每個(gè)樣繭編號(hào)，剪一小塊約0. 5X0. 5cm的 繭層，對(duì)應(yīng)編號(hào)作為繭層絲膠蛋白SDSPAGE電泳的樣繭；(3) SDSPAGE絲膠蛋白電泳準(zhǔn)備制備丙烯酰胺濃度為= 5%、C% = 2. 6%和尺 寸為8X8X0. Icm3的SDSPAGE凝膠，每塊凝膠上制作至少10個(gè)加樣孔；(4)樣品處理每個(gè)剪取IOmg繭層，加入300 μ L含有48% (m/v)尿素、4% (ν/ν)巰基乙醇、4% (m/v)SDS的水溶液，80°C水浴處理5-15min。吸取2 μ L(絲膠蛋白含量大于 10 μ g)上樣，以20mA/gel進(jìn)行電泳，20min后結(jié)束。(5)凝膠染色準(zhǔn)備大小合適的密閉容器，將電泳凝膠與50mL含有0. 1% (m/v)考 馬斯亮藍(lán)R250、10% (ν/ν)乙酸，20% (ν/ν)乙醇的染色液(60°C預(yù)熱)一起放入容器內(nèi)，將 容器浸入60°C水浴中，溫育15min后，將染色液倒出(收集，可重復(fù)使用)，水洗凝膠一遍， 加入含5% (ν/ν)乙酸，10% (ν/ν)乙醇的脫色液(60°C預(yù)熱)，振蕩lOmin，更換脫色液再 振蕩IOmin。(6)凡是在電泳結(jié)果中顯示IlOkDa蛋白條帶的，即是有kricin2蛋白質(zhì)分子標(biāo)記 的樣品個(gè)體，其解舒性能優(yōu)秀，可以作為高解舒?zhèn)€體留種。各批次的繭層絲膠SDSPAGE電泳結(jié)果如圖2所示。需要指出的是以上列舉僅是本發(fā)明的若干具體實(shí)施例，本發(fā)明不限于以上實(shí)例， 還可有許多變形，若從本發(fā)明公開的內(nèi)容中導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的 保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1. 一種利用蛋白質(zhì)分子標(biāo)記選擇高解舒性狀家蠶繭的方法，包括以下步驟(1)制備丙烯酰胺濃度為T%=5%, C%= 2. 6%和尺寸為8X8X0. Icm3的SDSPAGE 凝膠，凝膠上設(shè)加樣孔；(2)在待測(cè)種繭樣品上剪取IOmg繭層，加入300μ L含有48% (m/v)尿素、4% (ν/ν) 巰基乙醇、4% (m/v) SDS的水溶液，80°C水浴處理5 15min ；吸取2μ L上樣，以20mA/gel 進(jìn)行電泳，持續(xù)20min后結(jié)束；(3)將電泳凝膠與50mL經(jīng)60°C預(yù)熱的染色液一起放入密閉容器內(nèi)，將容器浸入60°C水 浴中；溫育15min后，將染色液倒出，水洗凝膠一遍，加入經(jīng)60°C預(yù)熱的脫色液，振蕩lOmin， 更換脫色液再振蕩IOmin ；所述染色液含有0. 1% (m/v)考馬斯亮藍(lán)R250、10% (ν/ν)乙酸和20% (ν/ν)乙醇，余 量為水；所述脫色液含5% (ν/ν)乙酸和10% (ν/ν)乙醇，余量為水；(4)凡是在電泳結(jié)果中顯示IlOkDa蛋白條帶的，即是有％1^(^112蛋白質(zhì)分子標(biāo)記的樣 品個(gè)體。
全文摘要
本發(fā)明涉及家蠶輔助育種選育技術(shù)，旨在提供一種利用蛋白質(zhì)分子標(biāo)記選擇高解舒性狀家蠶繭的方法。該方法包括(1)制備SDSPAGE凝膠，凝膠上設(shè)加樣孔；(2)在種繭上剪取繭層，加入含有尿素、巰基乙醇、SDS的水溶液，80℃水浴處理；吸取上樣進(jìn)行電泳；(3)將電泳凝膠與染色液一起放入密閉容器內(nèi)，60℃溫育后水洗凝膠，加入脫色液振蕩，更換脫色液再振蕩；(4)凡是在電泳結(jié)果中顯示110kDa蛋白條帶的，即是有Sericin2蛋白質(zhì)分子標(biāo)記的樣品個(gè)體。用絲膠蛋白質(zhì)Sericin2為分子標(biāo)記，可以準(zhǔn)確有效的選擇高解舒?zhèn)€體，從而大幅度的改進(jìn)家蠶繭解舒性狀，提高育種效率。只要有標(biāo)記蛋白質(zhì)Sericin2存在的個(gè)體，其蠶繭解舒率就在90％以上，選種個(gè)體飼養(yǎng)規(guī)模可以減少30～50％。
文檔編號(hào)A01K67/04GK102121920SQ20101059078
公開日2011年7月13日 申請(qǐng)日期2010年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月22日
發(fā)明者杜鑫, 陳玉銀 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)