專利名稱：器官玻璃化冷凍保存液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
腎臟是人體中機(jī)能復(fù)雜的器官，在4°C灌注條件下只能離體保存最多50小時(shí)。要長(zhǎng)期甚至永久保存腎臟，必須進(jìn)一步降低保存溫度，抑制組織細(xì)胞的代謝率，甚至使細(xì)胞代謝完全停止。腎臟如能在合適的冷凍條件下長(zhǎng)期保存，在需要時(shí)將冷凍保存的供腎采用合適的手段“復(fù)蘇”后再移植，將為臨床移植工作開辟一個(gè)嶄新的前景。冷凍保存方法被認(rèn)為是實(shí)現(xiàn)器官長(zhǎng)期保存的理想途徑，問(wèn)題的關(guān)鍵是器官體積較大，在降溫和復(fù)溫過(guò)程中很難克服細(xì)胞內(nèi)外冰晶形成，同時(shí)不能避免機(jī)械、化學(xué)、 滲透壓以及生物學(xué)方面的損傷，所以至今較大體積器官的凍存問(wèn)題仍未解決。玻璃化 (Vitrification)是指液體轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷B(tài)(玻璃態(tài))的固化過(guò)程。玻璃態(tài)固體分子之間的關(guān)系和液態(tài)無(wú)明顯區(qū)別，在降溫冷凍過(guò)程中不形成冰晶，因而是一種理想的冷凍保存途徑。
背景技術(shù)：
近期以來(lái)，冷凍保存細(xì)胞、精子、胚胎甚至卵巢組織已先后取得成功，但是復(fù)雜器官如腎臟的冷凍保存，卻依然是個(gè)尚未突破的難題。當(dāng)今世界，隨著腎臟移植技術(shù)的迅速發(fā)展和腎病患者數(shù)量的不斷增加，迫切需要大量的腎臟貯備和供應(yīng)。目前臨床移植用供腎均在0°C以上保存，此方法雖然比較成熟、簡(jiǎn)便，但保存時(shí)間十分有限。雖然國(guó)內(nèi)外學(xué)者從改進(jìn)保存液水平及保存工具等方而著手延長(zhǎng)腎臟保存時(shí)間，或在有限的保存時(shí)間內(nèi)完善組織配型工作，以提高供腎的合理使用率和移植后的長(zhǎng)期存活率，但仍不能滿足臨床需求。此外， 在國(guó)內(nèi)供體器官缺少的情況下，由于配型、病人條件不符和地域等原因也會(huì)造成一定的器官資源浪費(fèi)。能否在一個(gè)國(guó)家乃至整個(gè)世界范圍內(nèi)共享人白細(xì)胞抗原(HLA)配型吻合的腎臟，使每一個(gè)受者都能及時(shí)得到最優(yōu)化的供腎？對(duì)于這樣理想化的愿望，只有通過(guò)改進(jìn)腎臟保存技術(shù)，延長(zhǎng)供腎保存時(shí)間至數(shù)月甚至數(shù)年，并建立“器官庫(kù)”(Organ Bank)才能最終實(shí)現(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所述器官玻璃化冷凍保存液，由二甲基亞砜、乙酰胺、甘油、乙二醇、丙二醇、蔗糖、聚乙二醇等成份組成，二甲基亞砜、乙酰胺、甘油、乙二醇、丙二醇、蔗糖濃度均為 0. l-6mol/L，聚乙二醇濃度為l-20mmol/L，PH值范圍為5. 0-8. 0。玻璃化冷凍保存液在降溫冷凍過(guò)程中溶液呈玻璃態(tài)，不形成冰晶，避免或減少細(xì)胞的冰凍損害，可保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)的完整性，同時(shí)完全抑制組織細(xì)胞的能量代謝。經(jīng)合適的手段復(fù)蘇后細(xì)胞代謝活動(dòng)得到恢復(fù)，可重新發(fā)揮生物學(xué)功能。本發(fā)明所述器官玻璃化冷凍保存液，可用于腎臟的冷凍保存(-200--30°C)，也可應(yīng)用于其他器官(肝臟、心臟等)的長(zhǎng)期冷凍保存。
具體實(shí)施例方式將經(jīng)本發(fā)明所述器官玻璃化冷凍保存液灌注腎臟，降溫至_80°C，轉(zhuǎn)入深低溫冰箱或液氮長(zhǎng)期保存。器官?gòu)?fù)蘇時(shí)升溫至4°C，洗脫保存液后進(jìn)行相關(guān)形態(tài)學(xué)和功能學(xué)檢查。
通過(guò)本發(fā)明所述器官玻璃化冷凍保存液在-80°C保存2周的新西蘭大白兔腎臟， 大體形態(tài)未見明顯冰凍損害，皮髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，光學(xué)顯微鏡下腎小球內(nèi)毛細(xì)血管襻完整，腎小管上皮細(xì)胞輕微腫脹，電子顯微鏡下腎小球?yàn)V過(guò)膜、足細(xì)胞和系膜細(xì)胞等超微結(jié)構(gòu)清晰， 細(xì)胞核染色質(zhì)濃密，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器數(shù)目正常，上皮細(xì)胞腔面刷狀緣微絨毛排列整齊，血管內(nèi)皮細(xì)胞及彈性膜完整，顯示腎臟經(jīng)冷凍保存后組織形態(tài)未見明顯破壞。通過(guò)本發(fā)明所述器官玻璃化冷凍保存液在-80°C保存2周的新西蘭大白兔腎臟， 離體灌注后進(jìn)行酚紅排泌試驗(yàn)(PSP試驗(yàn))、靛胭脂實(shí)驗(yàn)測(cè)定腎小管功能，PSP15分鐘和120 分鐘排泌量，均接近正常值(25% ；55% )，靛胭脂灌注后即刻見到藍(lán)色尿液排出，顯示腎臟經(jīng)冷凍保存后腎小管具有排泌功能。通過(guò)本發(fā)明所述器官玻璃化冷凍保存液在-80°C保存2周的比格犬腎臟，自體腎移植術(shù)后1個(gè)月進(jìn)行彩色多普勒超聲、發(fā)射單光子計(jì)算機(jī)斷層掃描(ECT)和靜脈分泌造影 (IVP)等檢查，彩超可見移植腎臟內(nèi)血流通過(guò)，IVP和ECT顯示腎臟分泌/濾過(guò)功能持續(xù)存在。
權(quán)利要求
1.一種器官玻璃化冷凍保存液，其特征在于，包含二甲基亞砜、乙酰胺、甘油、乙二醇、 丙二醇、蔗糖、聚乙二醇等成份。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的保存液，其特征在于，二甲基亞砜、乙酰胺、甘油、乙二醇、丙二醇、蔗糖濃度均為0. l-6mol/L，聚乙二醇濃度為l-20mmol/L，PH值范圍為5. 0-8. 0。
3.根據(jù)利權(quán)要求1所述的保存液，其特征在于，保存溫度為-200-30攝氏度。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一所述的保存液，其特征在于所述的器官為腎臟、肝臟、心臟、 肺臟、皮膚或者肢體等。
5.一種器官保存方法，包括將器官放入保存液中，其特征在于，所述保存液中包含二甲基亞砜、乙酰胺、甘油、乙二醇、丙二醇、蔗糖、聚乙二醇等成份。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的保存方法，其特征在于，將器官進(jìn)行玻璃化冷凍保存。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)器官保存領(lǐng)域，具體公開了用于器官長(zhǎng)期保存的玻璃化冷凍保存液，其特征在于該保存液由二甲基亞砜、乙酰胺、甘油、乙二醇、丙二醇、蔗糖、聚乙二醇等成份組成，二甲基亞砜、乙酰胺、甘油、乙二醇、丙二醇、蔗糖濃度均為0.1-6mo/L，聚乙二醇濃度為1-20mmol/L，pH值范圍為5.0-8.0。實(shí)施按照本發(fā)明提供的用于器官保存的玻璃化保存液，在降溫冷凍過(guò)程中呈玻璃態(tài)不形成冰晶，保護(hù)組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)完整性，在冷凍條件下完全抑制組織細(xì)胞的能量代謝，復(fù)蘇后恢復(fù)其生物學(xué)功能，可用于腎臟的冷凍保存，也可進(jìn)一步推廣應(yīng)用于其他器官的長(zhǎng)期冷凍保存，供科研和臨床應(yīng)用。
文檔編號(hào)A01N1/00GK102550541SQ201010601358
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2010年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月23日
發(fā)明者劉迪, 潘峰 申請(qǐng)人:劉迪, 潘峰