專(zhuān)利名稱(chēng)：一種枯草芽孢桿菌制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種枯草芽孢桿菌制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
畜禽腸道內(nèi)的微生物與飼料在體內(nèi)的消化吸收有著密切關(guān)系，其直接影響到體內(nèi)的合成代謝。保持腸道內(nèi)有益菌群保持正?？梢灶A(yù)防畜禽感染疾病，對(duì)抗有害菌，同時(shí)產(chǎn)生乳酸、過(guò)氧化氫以及抗菌物質(zhì)，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收?？莶菅挎邨U菌(Bacillussubtilis)呈桿狀，直徑為0. 6 1. 0 μ m，長(zhǎng)1. 5 2.0μπι。芽孢中生，橢圓，孢囊不膨大，革蘭氏反應(yīng)陽(yáng)性。菌落粗糙，不透明，不閃光，擴(kuò)張， 呈污白色或微帶黃色。在畜牧和養(yǎng)殖業(yè)中，枯草芽孢桿菌相比其他有益細(xì)菌具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)它的腸道內(nèi)定殖力強(qiáng)，繁殖速度快；能夠產(chǎn)生大量的內(nèi)生消化酶，可提高日增重和飼料轉(zhuǎn)化率，可抗拉稀、抗應(yīng)激、優(yōu)化環(huán)境；抗逆性強(qiáng)、耐酸堿和高溫高壓，在飼料加工和儲(chǔ)存過(guò)程中不易失活。將其應(yīng)用于飼料工業(yè)中，可以有效調(diào)節(jié)畜禽腸道中的菌群平衡，明顯改善腸道微生態(tài)環(huán)境，抑制有害菌生長(zhǎng)，提高免疫力，降低發(fā)病率，增加成活率；促進(jìn)生長(zhǎng)，提高日增重，提高飼料消化吸收率，降低飼養(yǎng)成本，改善肉質(zhì)；使畜禽對(duì)冷熱應(yīng)激、斷奶應(yīng)激、食物應(yīng)激、環(huán)境變化等有很好的抵抗作用；優(yōu)化生態(tài)環(huán)境，降低動(dòng)物舍內(nèi)氨氣、硫化氫等有害氣體的濃度，減少糞便中有機(jī)物的排泄。因此，枯草芽孢桿菌被廣泛應(yīng)用于飼料添加劑的生產(chǎn)中。但是，現(xiàn)有的枯草芽孢桿菌制劑普遍存在所含活菌數(shù)量不夠高的缺陷，另外其在運(yùn)輸、保存和使用過(guò)程中的穩(wěn)定性較差，不能完全有效地適應(yīng)外界環(huán)境以及畜禽體內(nèi)環(huán)境，這些都導(dǎo)致現(xiàn)有枯草芽孢桿菌制劑的效力降低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于飼料添加劑的枯草芽孢桿菌制劑及其制備方法， 該枯草芽孢桿制劑的活菌含量更高，并且在畜禽腸道環(huán)境和外部環(huán)境中更加高效穩(wěn)定。用于實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下一方面，本發(fā)明提供了一種枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的制備方法，該制備方法包括以下步驟以0. 5% 5% (重量/重量)的接種量將枯草芽孢桿菌種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基， 在壓力為0. 02 0. 15MPa、攪拌轉(zhuǎn)速為100 300轉(zhuǎn)/分、通風(fēng)比為1 0.3 1.5(體積/體積)的條件下發(fā)酵20 40小時(shí)；其中，按重量百分比計(jì)算，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包含一種或幾種選自豆餅粉0. 3%、尿素0. 2%、硫酸銨0. 05% 0. 3%、磷酸氫二銨 0. 05% 0.3%、大豆蛋白胨0. 05% 0.3%、酵母膏 3%、魚(yú)粉0. 1.2%、豆粕粉0. 1% 5%、棉粕0.01% 0. 和豆粕水解液0. 5%的氮源；一種或幾種選自大米粉0. 05% 2. 1%、面粉0. 3. 5%、葡萄糖0. 05% 1.0%、乳糖0. 0.8%、淀粉0. 05% 0. 5%、蔗糖0. 05% 0. 5%、玉米粉0. 1. 5%、玉米淀粉0. 1. 5%和麩皮0. 05 % 0. 5 %的碳源；以及碳酸鈣0. 05 % 0. 8 %，磷酸氫二鉀0. 01 % 0. 06 %，硫酸鎂0. 01% 0. 40%，硫酸錳0. 01% 0. 06%，氯化鈉0. 05% 0. 5%，氯化鉀0. 05%
0.3%，磷酸二氫鉀0. 005% 0. 07%和碳酸氫鈉0. 005% 0. 03%，pH為7. 0 7. 5。在上述制備方法中，優(yōu)選地，豆粕水解液是由豆粕與水的混合物在pH為9 11、溫度為80 90°C的條件下水解20 60分鐘制得的，其中豆粕與水的質(zhì)量比為1 5 100。在上述制備方法中，優(yōu)選地，枯草芽孢桿菌種子液的制備方法包括以下步驟(1)將枯草芽孢桿菌接種于斜面培養(yǎng)基，于觀 45°C下培養(yǎng)15 36小時(shí)得到單菌落；所述斜面培養(yǎng)基包含牛肉浸膏5. 0 15. Og/mL,大豆蛋白胨5. O 15. Og/mL,酵母膏 5. O 15. Og/mL,氯化鈉 5. O 15. Og/mL,葡萄糖 3. O 10. Og/mL 和瓊脂 20 30g/mL，pH 為 7. O 7. 5 ；(2)將步驟(1)獲得的單菌落接種于菌液培養(yǎng)基，在觀 451、100 300轉(zhuǎn)/分的條件下培養(yǎng)15 36小時(shí)得到枯草芽孢桿菌液；所述培養(yǎng)基包含蛋白胨5 15g/mL，牛肉膏2 8g/mL和氯化鈉3 8g/mL, pH為7. 4 ；(3)將步驟⑵得到的枯草芽孢桿菌液以0.5% 5%接種量(重量/重量)接種于種子培養(yǎng)基，于觀 45°C、100 300轉(zhuǎn)/分的條件下培養(yǎng)15 36小時(shí)得到枯草芽孢桿菌種子液；按重量百分比計(jì)算，所述菌液培養(yǎng)基包含玉米粉0. 5 % 2. O %，葡萄糖0. 1 %
1.0%，豆餅粉0. 5% 3%，魚(yú)粉0. 1. 5%，碳酸鈣0. 31% 1. 69%，硫酸銨0. 05% 0. 15%，磷酸氫二鉀0. 01% 0. 06%，硫酸鎂0. 01% 0. 06%和硫酸錳0. 01% 0. 06%。在上述制備方法中，優(yōu)選地，發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵前先在105 130°C下滅菌20 40分鐘。另一方面，本發(fā)明提供了一種枯草芽孢桿菌液體制劑，該液體制劑包含根據(jù)上述制備方法制備的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液；優(yōu)選地，該液體制劑包含的枯草芽孢桿菌活菌數(shù)彡 lX1010CFU/mL。又一方面，本發(fā)明提供了一種枯草芽孢桿菌粉體制劑的制備方法，該制備方法包括以下步驟(1)向上述制備方法制備的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中加入10% 70% (g/mL)的硫酸銨水溶液和助濾劑，進(jìn)行過(guò)濾；(2)將濾餅在進(jìn)風(fēng)溫度為120 180°C、進(jìn)料速度為50 200轉(zhuǎn)/分、出口溫度為 70 90°C的閃蒸干燥機(jī)中進(jìn)行閃蒸。在上述粉體制劑的制備方法中，優(yōu)選地，過(guò)濾為向上述制備方法制備的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中加入10% 70% (g/mL)的硫酸銨水溶液和助濾劑，攪拌10 60分鐘后靜置10 120分鐘，然后進(jìn)入板框過(guò)濾機(jī)進(jìn)行過(guò)濾，過(guò)濾溫度為30 60°C，過(guò)濾壓力為2 5kg/cm2。在上述粉體制劑的制備方法中，優(yōu)選地，助濾劑選自碳酸鈣、珍珠巖和硅藻土中的一種或幾種；優(yōu)選地，按照重量百分比計(jì)算，所述枯草芽孢桿菌發(fā)酵液包含助濾劑 6%。本發(fā)明還提供了上述粉體制劑的制備方法制備的枯草芽孢桿菌粉體制劑；優(yōu)選地，該粉體制劑包含的枯草芽孢桿菌活菌數(shù)> ι χ 10"CFU/g。在一方面，本發(fā)明提供了一種飼料添加劑，該飼料添加劑包含上述枯草芽孢桿菌液體制劑或枯草芽孢桿菌粉體制劑。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，枯草芽孢桿菌液體制劑以及粉體制劑的制備方法包括如下步驟(1)枯草芽孢桿菌一級(jí)斜面培養(yǎng)采用常規(guī)方法將枯草芽孢桿菌接種于一級(jí)斜面培養(yǎng)基上，于觀 45°C下培養(yǎng)15 36小時(shí)，得到一級(jí)枯草芽孢桿菌單菌落；所述一級(jí)斜面培養(yǎng)基為按下述比例和成分配制的混合物牛肉浸膏5. 0 15. Og,大豆蛋白胨5. 0 15. Og,酵母膏5. 0 15. Og,氯化鈉5. 0 15. Og,葡萄糖3. 0 10. Og,瓊脂20 30g,蒸餾水 IOOOmL, pH 為 7. 0 7. 5 ；(2)枯草芽孢桿菌二級(jí)液體培養(yǎng)采用常規(guī)方法將步驟(1)培養(yǎng)的一級(jí)枯草芽孢桿菌單菌落接種于二級(jí)培養(yǎng)液中，裝液量為20 200mL/500mL，在觀 45°C、100 300轉(zhuǎn) /分的條件下培養(yǎng)15 36小時(shí)，得到二級(jí)枯草芽孢桿菌種子液；所述二級(jí)培養(yǎng)液為按下述比例和成分配制的混合液蛋白胨5 15g，牛肉膏2 8g，氯化鈉3 8g，蒸餾水IOOOmL, PH 為 7. 4 ；(3)枯草芽孢桿菌三級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)將步驟(2)得到的二級(jí)枯草芽孢桿菌種子液以 0. 5% 5%的重量比接種于發(fā)酵罐中，采用常規(guī)方法在培養(yǎng)基中于28 45°C、100 300 轉(zhuǎn)/分的條件下培養(yǎng)15 36小時(shí)，得到三級(jí)枯草芽孢桿菌種子液；所述三級(jí)枯草芽孢桿菌種子液的培養(yǎng)基包含(重量百分比)玉米粉0.5% 2.0%，葡萄糖0. 1.0%，豆餅粉0. 5% 3%，魚(yú)粉0. 1. 5%，碳酸鈣0. 31% 1.69%，硫酸銨0. 05% 0. 15%，磷酸氫二鉀0. 01% 0. 06%，硫酸鎂0. 01% 0. 06%和硫酸錳0. 01% 0. 06% ；(4)枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵發(fā)酵罐通蒸汽于100 130°C下保溫滅菌20 60分鐘后，將發(fā)酵底物粉碎到60 120目放入發(fā)酵罐中，再加入一定量的水，所加入水的重量與發(fā)酵底物的重量之比為100 2 15，然后通高壓蒸汽升溫至105 130°C，并保溫20 40 分鐘后自然冷卻15 45分鐘，通冷卻水冷卻至觀 451，無(wú)菌條件下接入步驟(3)中所述的三級(jí)枯草芽孢桿菌種子液，接種量為0. 5% 5% (重量比)，罐壓為0. 02 0. 15MPa，攪拌轉(zhuǎn)速為100 300轉(zhuǎn)/分，通風(fēng)比為1 0.3 1.5(體積比)，發(fā)酵時(shí)間為20 40小時(shí)， 直至得到活菌數(shù)達(dá)到lX101(lCFU/mL的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液；按重量百分比計(jì)算，所述發(fā)酵底物中的氮源為豆餅粉0. 1% 3(%、尿素0. 2%、硫酸銨0. 05% 0.3%、磷酸氫二銨0. 05% 0. 3%、大豆蛋白胨0. 05% 0.3%、酵母膏1% 3%、魚(yú)粉0. 1.2%、豆粕粉0. 1% 5%、棉粕0.01% 0. 和豆粕水解液0. 5%中的一種或幾種；所述的發(fā)酵底物中的碳源為大米粉0. 05 % 2. 1 %、面粉0. 1 % 3. 5 %、葡萄糖0. 05 % 1. 0 %、 乳糖0. 0.8%、淀粉0. 05% 0. 5%、蔗糖0. 05% 0. 5%、玉米粉0. 1.5%、玉米淀粉0. 1. 5%和麩皮0. 05% 0. 5%中的一種或幾種；所述發(fā)酵底物中除氮源和碳源外的其他成分包括(重量比)碳酸鈣0.05% 0.8%，磷酸氫二鉀0.01% 0.06%，硫酸鎂0. 01% 0. 40%，硫酸錳0. 01% 0. 06%，氯化鈉0. 05% 0. 5%，氯化鉀0. 05% 0. 3%，磷酸二氫鉀0. 005% 0. 07%和碳酸氫鈉0. 005% 0. 03%, pH為7. 0 7. 5 ；所述的豆粕水解液為豆粕與水的混合物，豆粕含量 5%，在pH為9 11、溫度為80 90°C的條件下水解20 60分鐘。該枯草芽孢桿菌發(fā)酵液可以直接作為枯草芽孢桿菌液體制劑。所述枯草芽孢桿菌粉體制劑的制備還包括如下步驟(5)(5)采取鹽析、板框過(guò)濾和閃蒸干燥工藝，向上述枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中加入10% 70% (g/mL)的硫酸銨水溶液后，再加入一定比例的助濾劑，攪拌10 60分鐘后靜置10 120分鐘；然后壓入板框過(guò)濾機(jī)進(jìn)行過(guò)濾，過(guò)濾溫度為30 60°C，過(guò)濾壓力為2 ^g/cm2，板框過(guò)濾的物料水分保持在20% 50% (重量比)；板框過(guò)濾后的濾餅直接進(jìn)入氣流干燥機(jī)進(jìn)行干燥，進(jìn)風(fēng)溫度為120 180°C，進(jìn)料速度為50 200轉(zhuǎn)/分，物料出口溫度為70 90°C，最終物料水分為0. 5% 5% (重量比)，得到的枯草芽孢桿菌粉劑的活菌數(shù)彡IXlO11 CFU/g;按重量百分比計(jì)算，所述助濾劑為碳酸鈣 6%、珍珠巖 5% 和硅藻土 5%中的一種或幾種。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌液體制劑或粉體制劑的使用方法為(1)將枯草芽孢桿菌液體制劑或粉體制劑與飼料混合或拌料；在豬的全價(jià)料中的添加比例為500 2000克/噸全價(jià)飼料；在肉雞和肉鴨全價(jià)料中的添加比例為500 2000 克/噸全價(jià)飼料；在蛋雞和蛋鴨料中的添加比例為500 2000克/噸全價(jià)飼料；在牛和羊等反芻動(dòng)物全價(jià)料中的添加比例為1000 3000克/噸精料；在水產(chǎn)動(dòng)物飼料中的添加比例為500 IOOOg/(畝 米)；(2)也可直接口服或加入水中飲用。本發(fā)明提供兩種枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑，它們分別達(dá)到了如下的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)液體制劑為棕黃色液體，具有濃郁的臭腳丫味道，活菌數(shù)達(dá)到lX101(lCFU/mL以上，芽孢形成率彡90%。鉛彡10mg/kg，無(wú)機(jī)砷彡;3mg/kg，氟彡100mg/kg，大腸桿菌彡3000 個(gè)/100g，黃曲霉毒素Bl ^ 10 μ g/kg，沙門(mén)氏菌未見(jiàn)檢出，符合國(guó)家飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。粉體制劑為淺黃或白色粉末，活菌數(shù)彡IXlO11 CFU/g，芽孢形成率彡90%。干燥粉劑的水分含量為0. 5% 5 %，菌體得率為90%。鉛彡10mg/kg，無(wú)機(jī)砷彡:3mg/kg，氟彡100mg/kg,大腸桿菌彡3000個(gè)/100g，黃曲霉毒素Bl彡10 μ g/kg,沙門(mén)氏菌未見(jiàn)檢出，符合國(guó)家飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌液體制劑或粉體制劑及其制備方法與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下顯著的優(yōu)點(diǎn)(1)本發(fā)明采用液體深層發(fā)酵法代替固體發(fā)酵法使得制備工藝的效率得到提高， 通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化各步驟采用的培養(yǎng)基的組成以及發(fā)酵工藝條件，使得最終產(chǎn)品中的枯草芽孢桿菌的活菌含量被大幅度提高，其中液體制劑中的活菌含量可達(dá)IX 101° CFU/mL，粉體制劑中的活菌含量可達(dá)IXlO11 CFU/g，充分地保證了枯草芽孢桿菌制劑的有效性；(2)本發(fā)明制備的枯草芽孢桿菌制劑耐酸、耐膽鹽，在腸道環(huán)境中保持高效穩(wěn)定， 為枯草芽孢桿菌制劑的廣泛推廣使用奠定了基礎(chǔ)；(3)本發(fā)明的枯草芽孢桿菌制劑中枯草芽孢桿菌的芽孢形成率高，更耐高溫，便于加工和保存；(4)本發(fā)明的枯草芽孢桿菌制劑無(wú)毒副作用、無(wú)耐藥性、無(wú)殘留，成本低、效果顯著。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。 實(shí)施例1制備枯草芽孢桿菌液體制劑-Ll
1)枯草芽孢桿菌的一級(jí)斜面培養(yǎng)以購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心的保藏號(hào)為ACCC10619的枯草芽孢桿菌作為出發(fā)菌株。采用常規(guī)方法將枯草芽孢桿菌 ACCC10619接種于一級(jí)斜面培養(yǎng)基上，于30°C培養(yǎng)M小時(shí)，得到一級(jí)枯草芽孢桿菌單菌落； 所述培養(yǎng)基為按下述比例和成分配制的混合物牛肉浸膏5. 0g，大豆蛋白胨15. 0g，酵母膏 5. Og,氯化鈉5. Og,葡萄糖10. Og,瓊脂20g，蒸餾水lOOOmL，pH為7. 0 ；2)枯草芽孢桿菌的二級(jí)液體培養(yǎng)采用常規(guī)方法將步驟1)培養(yǎng)的一級(jí)枯草芽孢桿菌單菌落接種于二級(jí)培養(yǎng)液中，裝液量為100mL/500mL，在30°C、150轉(zhuǎn)/分的條件下培養(yǎng)15小時(shí)，得到二級(jí)枯草芽孢桿菌種子液；所述二級(jí)培養(yǎng)液為按下述比例和成分配制的混合液蛋白胨15g ；牛肉膏2g ；氯化鈉3g ；蒸餾水IOOOmL ；pH為7. 4 ；3)枯草芽孢桿菌的三級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)將步驟2、得到的二級(jí)枯草芽孢桿菌種子液以 0. 5%的重量比接種于發(fā)酵罐中，采用常規(guī)方法在培養(yǎng)基上于30°C、150轉(zhuǎn)/分的條件下培養(yǎng)36小時(shí)，得到三級(jí)枯草芽孢桿菌種子液；所述培養(yǎng)基包含(重量比)玉米粉0.5% ；葡萄糖1.0% ；豆餅粉3% ；魚(yú)粉0. 1% ；碳酸鈣1.69% ；硫酸銨0. 05% ；磷酸氫二鉀0.01% ； 硫酸鎂0. 01 % ；硫酸錳0. 01 % ；4)枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵發(fā)酵罐通蒸汽于130°C下保溫滅菌40分鐘后，將發(fā)酵底物粉碎到60目放入發(fā)酵罐中，再加入一定量的水，所加入水的重量與發(fā)酵底物重量之比為100 2，然后通高壓蒸汽升溫至130°C，并保溫40分鐘后自然冷卻45分鐘，通冷卻水冷卻至30°C，無(wú)菌條件下接入步驟幻中所述的三級(jí)枯草芽孢桿菌種子液，接種量為0. 5% (重量比)，罐壓為0.05MPa，攪拌轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分，通風(fēng)比為1 0. 5 (體積比)，發(fā)酵時(shí)間為40小時(shí)；直至得到活菌數(shù)達(dá)到1 X 101° CFU/mL的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液；按重量百分比計(jì)算，所述發(fā)酵底物包含硫酸銨0. 2%、碳酸鈣0. 6%、魚(yú)粉0. 4%、豆粕粉3%、葡萄糖0. 7%、 玉米粉1. 5%、磷酸氫二鉀0. 02%、硫酸鎂0. 02%和硫酸錳0. 02%，pH為7. 0 7. 5。實(shí)施例2制備枯草芽孢桿菌液體制劑-L21)枯草芽孢桿菌的一級(jí)斜面培養(yǎng)以購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心的保藏號(hào)為ACCC10619的枯草芽孢桿菌作為出發(fā)菌株。采用常規(guī)方法將枯草芽孢桿菌 ACCC10619接種于一級(jí)斜面培養(yǎng)基上，于下培養(yǎng)36小時(shí)，得到一級(jí)枯草芽孢桿菌單菌落；所述的一級(jí)斜面培養(yǎng)基為按下述成分和比例配制的混合物牛肉浸膏15. Og ；大豆蛋白胨15. Og ；酵母膏5. Og ；氯化鈉5. Og ；葡萄糖10. Og ；瓊脂30g ；蒸餾水IOOOmL ；pH為7. 4 ；2)枯草芽孢桿菌二級(jí)液體培養(yǎng)采用常規(guī)方法將步驟1)培養(yǎng)的一級(jí)枯草芽孢桿菌單菌落接種于二級(jí)培養(yǎng)液中，裝液量200111175001^，在^°C、300轉(zhuǎn)/分的條件下培養(yǎng)36 小時(shí)，得到二級(jí)枯草芽孢桿菌種子液；所述的二級(jí)培養(yǎng)液為按下述成分和比例配制的混合液蛋白胨15g ；牛肉膏8g ；氯化鈉3g ；蒸餾水IOOOmL ；pH為7. 4 ；3)枯草芽孢桿菌三級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)將步驟幻得到的二級(jí)枯草芽孢桿菌種子液以5% 的重量比接種于發(fā)酵罐中，采用常規(guī)方法在培養(yǎng)基上于^°C、300轉(zhuǎn)/分的條件下培養(yǎng)36 小時(shí)，得到三級(jí)枯草芽孢桿菌種子液；所述的三級(jí)枯草芽孢桿菌種子液的培養(yǎng)基包含(重量比)玉米粉2.0%;葡萄糖1.0%;豆餅粉3 % ；魚(yú)粉1. 5 % ；碳酸鈣0. 31 % ；硫酸銨0. 15 % ； 磷酸氫二鉀0. 06% ；硫酸鎂0. 06%和硫酸錳0. 06% ；4)枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵發(fā)酵罐通蒸汽于121°C保溫滅菌30分鐘后，將發(fā)酵底物粉碎到120目放入發(fā)酵罐中，再加入一定量的水，所加入水的重量與發(fā)酵底物重量之比
8為100 15，然后通高壓蒸汽升溫至130°C，并保溫40分鐘后自然冷卻30分鐘，通冷卻水冷卻至^°C，無(wú)菌條件下接入步驟幻中所述的三級(jí)枯草芽孢桿菌種子液，接種量為5% (重量比)，罐壓為O.lOMPa，攪拌轉(zhuǎn)速為300轉(zhuǎn)/份，通風(fēng)比為1 1. 5 (體積/體積)，發(fā)酵時(shí)間為40小時(shí)；直至得到活菌數(shù)達(dá)1 X 101° CFU/mL的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液；所述的發(fā)酵底物包含氯化鈉0. 3 %、酵母膏1 %、魚(yú)粉1. 2 %、大米粉1. 4 %、面粉3. 5 %、葡萄糖0. 5 %、硫酸鎂0. 4 %、硫酸錳0.02%、氯化鉀0.2%、磷酸二氫鉀0. 03 %和碳酸氫鈉0. 02 %，pH為7. 0 7. 5。 實(shí)施例3制備枯草芽孢桿菌液劑-L31)枯草芽孢桿菌一級(jí)斜面培養(yǎng)以獲自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心的保藏號(hào)為CGMCCl 1508的枯草芽孢桿菌作為出發(fā)菌株。采用常規(guī)方法將枯草芽孢桿菌 CGMCCl 1508接種于一級(jí)斜面培養(yǎng)基上，于36°C下培養(yǎng)20小時(shí)，得到一級(jí)枯草芽孢桿菌單菌落；所述的一級(jí)斜面培養(yǎng)基為按下述成分和比例配制的混合物牛肉浸膏5. 0 15. 0g，大豆蛋白胨10. Og,酵母膏5. Og,氯化鈉5. Og,葡萄糖10. Og,瓊脂25g，蒸餾水IOOOmL, pH為 7. 5 ；2)枯草芽孢桿菌二級(jí)液體培養(yǎng)采用常規(guī)方法將步驟1)培養(yǎng)的一級(jí)枯草芽孢桿菌單菌落接種于二級(jí)培養(yǎng)液中，裝液量為150mL/500mL，在36°C、200轉(zhuǎn)/分的條件下培養(yǎng) 20小時(shí)，得到二級(jí)枯草芽孢桿菌種子液；所述的二級(jí)培養(yǎng)液為按下述成分和比例配制的混合液蛋白胨15g，牛肉膏2g，氯化鈉5g，蒸餾水lOOOmL，pH為7. 4 ；3)枯草芽孢桿菌三級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)將步驟2、得到的二級(jí)枯草芽孢桿菌種子液以 4. 5%的重量比接種于發(fā)酵罐中，采用常規(guī)方法在培養(yǎng)基上于36°C、200轉(zhuǎn)/分的條件下培養(yǎng)18小時(shí)，得到三級(jí)枯草芽孢桿菌種子液；所述的三級(jí)枯草芽孢桿菌種子液培養(yǎng)基包含(重量比)玉米粉0.2%，葡萄糖0.5%，豆餅粉3%，魚(yú)粉1.5%，碳酸鈣0.7%，硫酸銨 0. 10%，磷酸氫二鉀0. 03%，硫酸鎂0. 03%和硫酸錳0. 03% ；4)枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵發(fā)酵罐通蒸汽于保溫滅菌20分鐘后，將發(fā)酵底物粉碎到80目放入發(fā)酵罐中，再加入一定量的水，所加入水的重量與發(fā)酵底物重量之比為 100 10，然后通高壓蒸汽升溫至U6°C，并保溫30分鐘后自然冷卻30分鐘，通冷卻水冷卻至36°C，無(wú)菌條件下接入步驟幻中所述的三級(jí)枯草芽孢桿菌種子液，接種量為4% (重量比)，罐壓為0.05MPa，攪拌轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分，通風(fēng)比為1 1 (體積/體積)，發(fā)酵時(shí)間為35小時(shí)，直至得到活菌數(shù)達(dá)IXIOki CFU/mL的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液；所述的發(fā)酵底物包含(重量比)豆餅粉5%、蛋白胨0.5%、酵母膏0.4%、葡萄糖0.5%、玉米淀粉2.3%、碳酸鈣0.2%，硫酸鎂0.04%和磷酸二氫鉀0.06%，pH 7. 0 7. 5 ；實(shí)施例4制備枯草芽孢桿菌液劑-L41)枯草芽孢桿菌的一級(jí)斜面培養(yǎng)以獲自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心的保藏號(hào)為CGMCC11627的枯草芽孢桿菌作為出發(fā)菌株。采用常規(guī)方法將枯草芽孢桿菌 CGMCCl 1627接種于一級(jí)斜面培養(yǎng)基上，于32°C下培養(yǎng)M小時(shí)，得到一級(jí)枯草芽孢桿菌單菌落；所述的培養(yǎng)基為按下述成分和比例配制的混合物牛肉浸膏5. Og,大豆蛋白胨15. Og, 酵母膏5. Og,氯化鈉5. Og,葡萄糖10. Og,瓊脂20g，蒸餾水lOOOmL，pH為7. 0 ；2)枯草芽孢桿菌的二級(jí)液體培養(yǎng)采用常規(guī)方法將步驟1)培養(yǎng)的一級(jí)枯草芽孢桿菌單菌落接種于二級(jí)培養(yǎng)液中，裝液量為150mL/500mL，在32°C、180轉(zhuǎn)/分的條件下培養(yǎng)15小時(shí)，得到二級(jí)枯草芽孢桿菌種子液；所述的二級(jí)培養(yǎng)液為按下述成分和比例配制的混合液蛋白胨15g ；牛肉膏2g ；氯化鈉3g ；蒸餾水IOOOmL ；pH為7. 4 ；3)枯草芽孢桿菌的三級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)將步驟2、得到的二級(jí)枯草芽孢桿菌種子液以 0. 5%重量比接種于發(fā)酵罐中，采用常規(guī)方法在培養(yǎng)基上于32°C、180轉(zhuǎn)/分的條件下培養(yǎng) 36小時(shí)，得到三級(jí)枯草芽孢桿菌種子液；所述的培養(yǎng)基包含(重量比)玉米粉0.5%;葡萄糖1. 0% ；豆餅粉3% ；魚(yú)粉0. 1% ；碳酸鈣1. 69% ；硫酸銨0. 05% ；磷酸氫二鉀0. 01% ；硫酸鎂0. 01 %和硫酸猛0.01% ；4)枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵發(fā)酵罐通蒸汽于130°C保溫滅菌40分鐘后，將發(fā)酵底物粉碎到80目放入發(fā)酵罐中，再加入一定量的水，所加入水的重量與發(fā)酵底物重量之比為 100 5，然后通高壓蒸汽升溫至130°C，并保溫40分鐘后自然冷卻45分鐘，通冷卻水冷卻至30°C，無(wú)菌條件下接入步驟幻中所述的三級(jí)枯草芽孢桿菌種子液，接種量為0.5% (重量比)，罐壓為0.05MPa，攪拌轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分，通風(fēng)比為1 0. 5 (體積比)，發(fā)酵時(shí)間為36 小時(shí)；直至得到活菌數(shù)達(dá)IX 101° CFU/mL的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液；所述的發(fā)酵底物包含(重量比)酵母粉3 %、3 %的豆粕水解液3 %、葡萄糖0.7%、玉米淀粉1.5%、碳酸鈣0. 5 %，pH 為 7. 0 7. 5。實(shí)施例5制備枯草芽孢桿菌粉劑-Si向?qū)嵤├?制得的發(fā)酵液中加入10% (g/mL)的硫酸銨水溶液后，再加入4% (重量比)碳酸鈣助濾，攪拌10分鐘后靜置10 120分鐘，然后壓入板框過(guò)濾機(jī)進(jìn)行過(guò)濾。過(guò)濾溫度為30°C，過(guò)濾壓力為^cg/cm2。板框過(guò)濾的物料水分保持在20% (重量比)。板框過(guò)濾后的濾餅直接進(jìn)入閃蒸干燥機(jī)進(jìn)行干燥。進(jìn)風(fēng)溫度為120°C，進(jìn)料速度為50轉(zhuǎn)/分，物料出口溫度為70°C。最終物料水分為0.5% (重量)，制劑的活菌數(shù)彡lX10"CFU/g。實(shí)施例6制備枯草芽孢桿菌粉劑-S2向?qū)嵤├?制得的發(fā)酵液加入70% (g/mL)的硫酸銨水溶液后，再加入5% (重量比)珍珠巖助濾，攪拌60分鐘后靜置120分鐘，然后壓入板框過(guò)濾機(jī)進(jìn)行過(guò)濾。過(guò)濾溫度為60°C，過(guò)濾壓力為^g/cm2。板框過(guò)濾的物料水分保持在50% (重量比)。板框過(guò)濾后的濾餅直接進(jìn)入閃蒸干燥機(jī)進(jìn)行干燥。進(jìn)風(fēng)溫度為180°C，進(jìn)料速度為200轉(zhuǎn)/分，物料出口溫度為90°C。最終物料水分為5% (重量比)，制劑的活菌數(shù)彡lX10"CFU/g。實(shí)施例7制備枯草芽孢桿菌粉劑-S3向?qū)嵤├?制得的發(fā)酵液加入35% (g/mL)的硫酸銨水溶液后，再加入3% (重量比)碳酸鈣、(重量比)珍珠巖助濾，攪拌30分鐘后靜置60分鐘，然后壓入板框過(guò)濾機(jī)進(jìn)行過(guò)濾。過(guò)濾溫度為40°C，過(guò)濾壓力4kg/cm2。板框過(guò)濾的物料水分保持在30% (重量比)。板框過(guò)濾后的濾餅直接進(jìn)入閃蒸干燥機(jī)進(jìn)行干燥。進(jìn)風(fēng)溫度為160°C，進(jìn)料速度為100轉(zhuǎn)/分，物料出口溫度為80°C。最終物料水分為1.5% (重量比)，制劑的活菌數(shù)彡 lX10"CFU/g。實(shí)施例8制備枯草芽孢桿菌粉劑-S4向?qū)嵤├?得到發(fā)酵液加入50% (g/mL)硫酸銨水溶液后，再加入4% (重量比) 碳酸鈣、2% (重量比)珍珠巖助濾，攪拌30分鐘后靜置60分鐘，然后壓入板框過(guò)濾機(jī)進(jìn)行過(guò)濾。過(guò)濾溫度為39°C，過(guò)濾壓力為4kg/cm2。板框過(guò)濾的物料水分保持在30% (重量比)。 板框過(guò)濾后的濾餅直接進(jìn)入閃蒸干燥機(jī)進(jìn)行干燥。進(jìn)風(fēng)溫度為130°C，進(jìn)料速度為200轉(zhuǎn)/分，物料出口溫度為85°C。最終物料水分為2.0% (重量比)，制劑的活菌數(shù)彡IXIO11CFU/ g°實(shí)施例9枯草芽孢桿菌制劑的耐高溫性以4% (重量比)的比例將實(shí)施例1制備的枯草芽孢桿菌液劑加到預(yù)混料或全價(jià)料中進(jìn)行制粒處理，并檢測(cè)菌株的存活率。分別在80、85、90、95、1001下制粒處理10分鐘， 芽孢存活率分別為100%、95. 2%,90.9%,88.2%,85.4% (結(jié)果見(jiàn)表1)，說(shuō)明該枯草芽孢桿菌制劑可以耐受高溫制粒處理并保持良好的活性。表1枯草芽孢桿菌劑在不同制粒溫度下處理10分鐘后的芽孢存活率(X IO11CFU/ g)
初制粒溫度(°C )始80859095100活法菌存活率活菌存活率；舌菌存活率活菌存活率活菌存活率菌數(shù)數(shù)(%)數(shù)(%)數(shù)(%)數(shù)(%)數(shù)(%)1.871.871001.7895.21.6990.91.6488.21.5985.4實(shí)施例10枯草芽孢桿菌制劑的耐酸性將實(shí)施例5制備的枯草芽孢桿菌粉劑在人工模擬胃液(pH為2.0、3.0、4.0)中 37°C下處理2小時(shí)，菌株存活率分別達(dá)到3. 0%,20. 6%和97. 6% ；在人工模擬胃液(pH為 2.0,3.0,4. 0)中37°C下處理4小時(shí)，菌株的存活率分別達(dá)到2. 2%、12. 0%和59.8% ；在人工模擬胃液(pH為2. 0,3. 0,4. 0)中37°C下處理6小時(shí)，菌株的存活率分別達(dá)到1. 2%, 9. 0%和50. 4% ；說(shuō)明該枯草芽孢桿菌制劑可以在經(jīng)過(guò)胃液后并保持相當(dāng)高的活性而到達(dá)腸道。表2枯草芽孢桿菌粉劑在人工模擬胃液中37°C下處理2、4或6小時(shí)后的存活結(jié)果 (X10nCFU/g)
作用時(shí)間 (小時(shí))初始活菌數(shù)pH2.03.04.0活菌數(shù)存活率 (%)法菌數(shù)存活率 (%)活菌數(shù)存活率 (%)22.530.193.00.5220.62.4797.642.530.062.20.3112.01.5159.862.530.031.20.229.01.2750.4實(shí)施例11枯草芽孢桿菌制劑的儲(chǔ)存穩(wěn)定性以4%的重量比將實(shí)施例7制備的枯草芽孢桿菌粉劑在預(yù)混料中貯存3個(gè)月、6個(gè)
11月和12個(gè)月，其菌株存活率分別為96. 5%,91. 3%和82. 1 %，說(shuō)明該枯草芽孢桿菌制劑的儲(chǔ)存性良好，可以在一定的時(shí)期內(nèi)保持較高的活菌數(shù)量，保證制劑的活性。表3枯草芽孢桿菌粉劑在預(yù)混料中貯藏3、6或12個(gè)月后的菌株存活率 (X10nCFU/g)
權(quán)利要求
1.一種枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的制備方法，該制備方法包括以下步驟以0.5% 5% (重量比)的接種量將枯草芽孢桿菌種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，在壓力為 0. 02 0. 15MPa、攪拌轉(zhuǎn)速為100 300轉(zhuǎn)/分、通風(fēng)比為1 0. 3 1. 5 (體積比)的條件下發(fā)酵20 40小時(shí)；其中，按重量百分比計(jì)算，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包含一種或幾種選自豆餅粉0. 1 % 3 %、尿素0. 1 % 2 %、硫酸銨0. 05 % 0. 3 %、磷酸氫二銨0. 05 % 0. 3 %、 大豆蛋白胨0. 05% 0.3%、酵母膏 3%、魚(yú)粉0. 1.2%、豆粕粉0. 5%、 棉粕0. 01 % 0. 1 %和豆粕水解液0. 1 % 5 %的氮源；一種或幾種選自大米粉0. 05 % 2. 1%、面粉0. 3. 5%、葡萄糖0. 05% 1.0%、乳糖0. 1% 0.8%、淀粉0. 05% 0. 5%、蔗糖0. 05 % 0.5%、玉米粉0. 1.5%、玉米淀粉0. 1.5%和麩皮 0. 05 % 0. 5 %的碳源；以及碳酸鈣0. 05 % 0. 8 %，磷酸氫二鉀0. 01 % 0. 06 %，硫酸鎂0. 01 % 0. 40 %，硫酸錳0. 01 % 0. 06 %，氯化鈉0. 05 % 0. 5 %，氯化鉀0. 05 % 0. 3%，磷酸二氫鉀0. 005% 0. 07%和碳酸氫鈉0. 005% 0. 03%，pH為7. 0 7. 5。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述豆粕水解液是由豆粕與水的混合物在pH為9 11、溫度為80 90°C的條件下水解20 60分鐘制得的，其中豆粕與水的質(zhì)量比為1 5 100。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，所述枯草芽孢桿菌種子液的制備方法包括以下步驟(1)將枯草芽孢桿菌接種于斜面培養(yǎng)基，于觀 45°C下培養(yǎng)15 36小時(shí)得到單菌落；所述斜面培養(yǎng)基包含牛肉浸膏5. 0 15. Og/mL,大豆蛋白胨5. 0 15. Og/mL，酵母膏 5. 0 15. Og/mL,氯化鈉 5. 0 15. Og/mL,葡萄糖 3. 0 10. Og/mL 和瓊脂 20 30g/mL，pH 為 7. 0 7. 5 ；(2)將步驟(1)獲得的單菌落接種于菌液培養(yǎng)基，在觀 451、100 300轉(zhuǎn)/分的條件下培養(yǎng)15 36小時(shí)得到枯草芽孢桿菌液；所述菌液培養(yǎng)基包含蛋白胨5 15g/mL，牛肉膏2 8g/mL和氯化鈉3 8g/mL, pH為7. 4 ；(3)將步驟( 獲得的枯草芽孢桿菌液以0.5% 5%(重量比)接種量接種于種子培養(yǎng)基，于觀 45°C、100 300轉(zhuǎn)/分的條件下培養(yǎng)15 36小時(shí)得到枯草芽孢桿菌種子液； 按重量百分比計(jì)算，所述種子培養(yǎng)基包含玉米粉0.5% 2.0%，葡萄糖0. 1^-1.0^,5 餅粉0.5% 3%，魚(yú)粉0. 1. 5%，碳酸鈣0. 31% 1.69%，硫酸銨0. 05% 0. 15%, 磷酸氫二鉀0. 01% 0. 06%，硫酸鎂0. 01% 0. 06%和硫酸錳0. 01% 0. 06%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵前先在105 130°C下滅菌20 40分鐘。
5.一種枯草芽孢桿菌液體制劑，該液體制劑包含根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的制備方法制備的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液；優(yōu)選地，該液體制劑包含的枯草芽孢桿菌活菌數(shù)≥ lX1010CFU/mLo
6.一種枯草芽孢桿菌粉體制劑的制備方法，該制備方法包括以下步驟(1)向根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的制備方法制備的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中加入10% 70% (克/毫升)的硫酸銨水溶液和助濾劑，進(jìn)行過(guò)濾；(2)將濾餅在進(jìn)風(fēng)溫度為120 180°C、進(jìn)料速度為50 200轉(zhuǎn)/分、出口溫度為70 90°C的閃蒸干燥機(jī)中進(jìn)行閃蒸。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述過(guò)濾為向根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的制備方法制備的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中加入10% 70% (克/毫升)的硫酸銨水溶液和助濾劑，攪拌10 60分鐘后靜置10 120分鐘，然后進(jìn)入板框過(guò)濾機(jī)進(jìn)行過(guò)濾，過(guò)濾溫度為30 60°C，過(guò)濾壓力為2 ^g/cm2。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的制備方法，其特征在于，所述助濾劑選自碳酸鈣、珍珠巖和硅藻土中的一種或幾種；優(yōu)選地，按照重量百分比計(jì)算，所述枯草芽孢桿菌發(fā)酵液包含 6%的助濾劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求6至8中任一項(xiàng)所述的制備方法制備的枯草芽孢桿菌粉體制劑；優(yōu)選地，該粉體制劑包含的枯草芽孢桿菌活菌數(shù)> 1 X 10"CFU/g。
10.一種飼料添加劑，該飼料添加劑包含根據(jù)權(quán)利要求5所述的枯草芽孢桿菌液體制劑或根據(jù)權(quán)利要求9所述的枯草芽孢桿菌粉體制劑。
全文摘要
本發(fā)明提供一種枯草芽孢桿菌制劑及其制備方法，該枯草芽孢桿菌制劑由包括以下步驟的制備方法制備的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液制成，其中以0.5％～5％(重量比)的接種量將枯草芽孢桿菌種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，在壓力為0.02～0.15MPa、攪拌轉(zhuǎn)速為100～300轉(zhuǎn)/分、通風(fēng)比為1∶0.3～1.5(體積比)的條件下發(fā)酵20～40小時(shí)。本發(fā)明采用液體深層發(fā)酵法代替固體發(fā)酵法使得制備工藝的效率提高，通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化各步驟采用的培養(yǎng)基的組成以及發(fā)酵工藝條件，使得最終產(chǎn)品中的枯草芽孢桿菌活菌含量得到大幅度提高；該枯草芽孢桿菌制劑耐酸、耐膽鹽，在腸道環(huán)境中保持高效穩(wěn)定；芽孢形成率高，更耐高溫，便于加工和保存。
文檔編號(hào)A23K1/16GK102168045SQ201010604530
公開(kāi)日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2010年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月24日
發(fā)明者吳培均, 姚琨, 李兆勇, 李富偉, 楊忠廣 申請(qǐng)人:北京科為博生物科技有限公司