專利名稱：抗小麥矮縮病毒的rna干涉載體、構(gòu)建方法及其在小麥遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明特別涉及一種適合單子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化抗小麥矮縮病毒的RNA干涉載體的構(gòu)建及其在小麥遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。進(jìn)一步涉及小麥矮縮病毒(WDV)的外殼蛋白(CP)基因表達(dá)載體及其遺傳轉(zhuǎn)化小麥并得到有抗性的植株。
背景技術(shù)：
小麥矮縮病(wheat dwarf disease)是小麥重要病害之一。它是由小麥矮縮病毒 (ffheatdwarf virus, WDV)弓丨起。小麥矮縮病毒的傳毒介體是條沙葉蟬，它以成、若蟲(chóng)刺吸作物莖葉，導(dǎo)致受害幼苗變色，生長(zhǎng)受到抑制。20世紀(jì)80年代最先在瑞典報(bào)道了小麥矮縮病毒的發(fā)生(Kvarnheden等，2002)。近年來(lái)，該病毒已經(jīng)在非洲、歐洲、亞洲、和大洋洲引起了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。2007年本實(shí)驗(yàn)室在國(guó)內(nèi)首次報(bào)道了該病毒引起矮縮病的發(fā)生。隨后在陜西、甘肅、河北、云南等12個(gè)省被發(fā)現(xiàn)。該病在陜西北部麥區(qū)已經(jīng)引起嚴(yán)重的減產(chǎn)，如 2007和2008年陜西韓城發(fā)病面積超過(guò)10萬(wàn)畝，病株率20%以上，重病田達(dá)1萬(wàn)畝。目前小麥矮縮病已經(jīng)成為威脅我國(guó)西北、華北和西南麥區(qū)重要的病毒病。目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上防治此類病害的主要方法化學(xué)藥劑、耕作措施和抗病育種?；瘜W(xué)藥劑容易造成人蓄中毒、農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染等危害；輪作換茬等耕作措施不能根除病害； 綜合比較來(lái)看培育抗病小麥新品種是比較有效的防治措施，但由于小麥抗病種質(zhì)資源的缺乏，常規(guī)育種方法又存在周期長(zhǎng)、定向性差、易帶入不良性狀等缺點(diǎn)，因此單靠傳統(tǒng)育種培育抗病害的小麥新品種的方法獲得抗病、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的雙重特性品種的難度很大。于是小麥生物技術(shù)抗病育種應(yīng)運(yùn)而生。RNA干涉(RNA interference，RNAi)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種重要基因沉默現(xiàn)象，它是指通過(guò)雙鏈RNA介導(dǎo)的特異性的降解對(duì)應(yīng)序列的mRNA，從而特異性地抑制相應(yīng)基因的表達(dá)，是植物對(duì)外來(lái)入侵者的一種重要的防御機(jī)制近年來(lái)，RNAi技術(shù)在研究植物病毒基因功能與致病機(jī)制和植物抗病機(jī)理中有了廣泛應(yīng)用，但在國(guó)內(nèi)外RNAi介導(dǎo)的WDV抗性還未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述不足，本發(fā)明在WDV(來(lái)自陜西韓城SXHC-2樣品，目前序列還未登錄 GenBank)上設(shè)計(jì)了 WDV高保守性的外殼蛋白(CP)介導(dǎo)的RNAi的dsRNA前體，將WDV-CP基因連接到雙向干涉載體PMCG161載體的正義鏈位點(diǎn)，而后在正義鏈載體的基礎(chǔ)上將WDV-CP 基因連接到雙向干涉載體PMCG161載體的反義鏈酶切位點(diǎn)上，最終構(gòu)建了適合禾本科植物轉(zhuǎn)化的干涉載體。利用基因槍的方法進(jìn)行小麥的遺傳轉(zhuǎn)化，借助小麥組織中RdRp的轉(zhuǎn)錄作用，產(chǎn)生WDV-CP基因的dsRNA的形式，再由Dicer酶的作用產(chǎn)生SiRNA，當(dāng)小麥?zhǔn)躓DV侵染時(shí)，就可產(chǎn)生SiRNA，從而達(dá)到利用RNAi介導(dǎo)對(duì)WDV的抗性的目的。但由于本發(fā)明所選擇的序列為WDV的保守序列，因此所得到的轉(zhuǎn)基因植株可以使入侵的致病病毒發(fā)生RNA沉默現(xiàn)象，且這種沉默具有普遍性，從而使植物對(duì)病毒具備普遍的抗性。期望篩選出免疫或高抗WDV的轉(zhuǎn)基因小麥植株，探索利用分子生物學(xué)技術(shù)獲得抗WDV的基因工程新策略，最終實(shí)現(xiàn)利用RNAi獲得抗WDV小麥新品種的預(yù)期目標(biāo)。依據(jù)現(xiàn)有的WDV的保守序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增小麥矮縮病毒陜西韓城SXHC-2樣品的cp基因，其核苷酸序列如SEQ ID N09所示?？剐←湴s病毒的RNA干涉載體，包括骨架載體和含有正、反義鏈的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其特征在于以SEQ ID N09所示的WDV-CP基因序列作為正、反義鏈。所述骨架載體為pMCG161。所述WDV-CP基因的正義鏈插入pMCG161中上游的兩個(gè)酶切位點(diǎn)AscI、AvrII間， WDV-CP基因的反義鏈插入pMCG161中下游的兩個(gè)酶切位點(diǎn)SpeI、SgfI間。上述干涉載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟(I)WDV-CP基因的獲得以陜西韓城SXHC-2樣品的總DNA為模板，以SEQ ID NOl和SEQ ID N02為引物對(duì)，經(jīng)PCR擴(kuò)增WDV-CP，得到PCR產(chǎn)物，回收目的片段，與pMD18_T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5 α 得到陽(yáng)性質(zhì)粒 pMD18-T-WDV-CP。SEQ ID NO 1 :5，-ATGGTGACCAACAAGGACTCCC-3，SEQ ID Ν02 :5， -TTACTGAATGCCGATGGCTTTG-3，(2) WDV-CP正義鏈載體的獲得以陽(yáng)性質(zhì)粒pMD18-T-WDV-CP為模板，以SEQ ID Ν03和SEQ ID Ν04為引物對(duì)，經(jīng) PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物，回收目的片段，與pMDIS-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α得到陽(yáng)性質(zhì)粒PMD18-T-WDV-CP+，用AscI、AvrII雙酶切陽(yáng)性質(zhì)粒和載體pMCG161，再用T4 DNA連接酶將正義鏈片段和載體連接，得到WDV-CP正義鏈載體pMCG161+WDV。SEQ ID N03 :5’ -AT GGCGCGCC ATGGTGACCAACAAGGACTCCC-3，SEQ ID N04 5' -AT CCTAGG TTACTGAATGCCGATGGCTTTG-3，(3) WDV-CP干涉載體的獲得以陽(yáng)性質(zhì)粒pMD18-T-WDV-CP為模板，以SEQ ID N05和SEQ ID N06為引物對(duì)，經(jīng) PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物，回收目的片段，與pMDIS-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci得到陽(yáng)性質(zhì)粒PMD18-T-WDV-CP-，用SpeI、SgfI雙酶切陽(yáng)性質(zhì)粒和WDV-CP正義鏈載體，再用T4DNA 連接酶將反義鏈片段和載體連接，得到干擾載體PMCG161+/-WDV。SEQ ID N05 :5’ -AT GCGATCGC TTACTGAATGCCGATGGCTTTG-3’SEQ ID N06 :5， -AT ACTAGT ATGGTGACCAACAAGGACTCCC-3‘(4) WDV-CP反義鏈載體的獲得以陽(yáng)性質(zhì)粒pMD18-T-WDV-CP為模板，以SEQ ID N05和SEQ ID N06為引物對(duì)，經(jīng) PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物，回收目的片段，與pMDIS-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α得到陽(yáng)性質(zhì)粒PMD18-T-WDV-CP-，用SpeI、SgfI雙酶切陽(yáng)性質(zhì)粒再用T4 DNA連接酶將反義鏈片段和載體連接，得到反義鏈載體PMCG161-WDV。SEQ ID N05 :5’ -AT GCGATCGC TTACTGAATGCCGATGGCTTTG-3’SEQ ID N06 :5， -AT ACTAGT ATGGTGACCAACAAGGACTCCC-3，(5)另一種方法獲得WDV-CP干涉載體
用Spel、SgfI 雙酶切 pMD18_T-WDV_CP-陽(yáng)性質(zhì)粒和載體 pMCG161，再用 T4DNA 連接酶將反義鏈片段和載體PMCG161連接，得到WDV-CP反義鏈載體；再用AscI、AvrII雙酶切pMD18-T-WDV-CP+陽(yáng)性質(zhì)粒和WDV-CP反義鏈載體，再用T4 DNA連接酶將正義鏈片段和酶切后的WDV-CP反義鏈載體連接，得到干擾載體pMCG161+/-WDV。上述RNA干涉載體在遺傳轉(zhuǎn)化單子葉植物中的應(yīng)用。所述應(yīng)用是將上述RNA干涉載體轉(zhuǎn)化有關(guān)單子葉受體植物，使之對(duì)小麥矮縮病毒產(chǎn)生抗性。所述轉(zhuǎn)化方法為基因槍法。所述受體植物為禾本科植物。 所述禾本科植物為小麥。本發(fā)明根據(jù)WDV的基因組序列，設(shè)計(jì)了 SEQ ID NOl和SEQ ID N02,以感染小麥矮縮病毒(WDV)的陜西韓城SXHC-2樣品的總DNA為模板，擴(kuò)增得到了外殼蛋白(CP)的目的片段為783bp。根據(jù)雙向干涉載體PMCG161的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，在其上游的兩個(gè)酶切位點(diǎn)AscI、AvrII間插入WDV-CP基因的正義鏈，在下游的兩個(gè)酶切位點(diǎn)Spel、SgfI間插入 WDV-CP基因的反義鏈。通過(guò)載體上的intron(rice ffaxy-a intron 1)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，這樣可用于基因槍轉(zhuǎn)化單子葉植物的干擾載體就構(gòu)建成功。本發(fā)明為植物抗病基因工程提供了一種干擾病毒基因表達(dá)載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，為轉(zhuǎn)基因技術(shù)及RNA干擾在生物抗性育種中的應(yīng)用提供了新的思路。將該載體轉(zhuǎn)入小麥中，成功獲得了抗病毒植株，實(shí)現(xiàn)了利用RNAi原理獲得抗WDV小麥新品種的預(yù)期目標(biāo)， 為RNAi介導(dǎo)的植物抗性育種及基因工程提供了成功的實(shí)例，彌補(bǔ)了 RNAi介導(dǎo)的WDV抗性在本領(lǐng)域研究中的空缺。本發(fā)明的干擾載體并不只限于對(duì)WDV進(jìn)行轉(zhuǎn)化和用于培育對(duì)WDV有抗性的轉(zhuǎn)基因植株。利用本發(fā)明的干擾載體轉(zhuǎn)化所得的抗性生物體可以是任何微生物、植物或其組織、細(xì)胞，以及由此所獲得具有任何抗病活性的微生物、植物，以及該類植物后代的種子、雜交和轉(zhuǎn)育后代。


圖1. PCR擴(kuò)增獲得WDV外殼蛋白(CP)基因的電泳圖泳道l.DL2000，5.健康小麥植株，2、3、4、6、7克隆得到WDV外殼蛋白(CP)圖2.正義鏈載體中正義鏈片段的PCR檢測(cè)電泳圖泳道1. 8DL2000, 2陽(yáng)性對(duì)照，3水，4. 5. 6. 7. 8. 9正義鏈PCR產(chǎn)物圖3.反義鏈載體中反義鏈片段的PCR檢測(cè)電泳圖泳道1. 8DL2000, 2陽(yáng)性對(duì)照，3水，4. 5. 6反義鏈PCR產(chǎn)物圖4.正、反義鏈載體的正、反義片段酶切鑒定電泳圖泳道1-2正義鏈載體雙酶切，3為DNA Marker DL2000，4_5.反義鏈載體雙酶切， 6. DNAMarker HandIII圖5.干涉載體中正、反義鏈片段的酶切鑒定電泳圖泳道IDNA Marker DL2000，2 雙酶切正義鏈，圖6.載體pMCG161的結(jié)構(gòu)示意圖7.質(zhì)粒載體pMCG161外源片斷構(gòu)建線性圖；AscI和AvrII兩個(gè)酶切位點(diǎn)，用來(lái)插入cp基因的正義鏈；在它的下游含有SpeI與 SgfI兩個(gè)酶切位點(diǎn)，用來(lái)插入CP基因的反義鏈圖8.小麥 基因槍轉(zhuǎn)化小麥幼胚愈傷組織獲得轉(zhuǎn)基因植株的過(guò)程；A基因槍轉(zhuǎn)化前愈傷組織處理，B基因槍轉(zhuǎn)化后愈傷組織恢復(fù)培養(yǎng)，C基因槍轉(zhuǎn)化后打槍后愈傷組織出現(xiàn)綠芽點(diǎn)，D誘導(dǎo)生根壯苗培養(yǎng)，E移栽到溫室花盆中的轉(zhuǎn)基因小麥圖9A. T0代轉(zhuǎn)基因植株WDV-CP的PCR電泳圖泳道1. DL2000 2.陽(yáng)性對(duì)照；3.陰性對(duì)照；4.水；5. 6. 7. 8…轉(zhuǎn)基因植株；5、8為陽(yáng)
性植株，圖9B. T0代轉(zhuǎn)基因植株intron的PCR電泳圖泳道1. DL2000 2.陽(yáng)性對(duì)照；3.陰性對(duì)照；4.水；5. 6. 7. 8…轉(zhuǎn)基因植株；5、7、11
為陽(yáng)性植株圖9C. T1代轉(zhuǎn)基因植株的WDV-CP片段(783bp)的PCR電泳圖泳道1. DL2000 2.陽(yáng)性對(duì)照；3.性對(duì)照· ；5水· ；4. 6.7轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株；圖10.轉(zhuǎn)基因植株WDV的抗性測(cè)定對(duì)照?qǐng)D1、感病的對(duì)照小麥品種揚(yáng)麥158未接種未發(fā)病2、小偃22(抗病的對(duì)照小麥品種)接種未發(fā)病3、感病的對(duì)照小麥品種揚(yáng)麥158接種發(fā)病4、5、6、7、8轉(zhuǎn)基因植株接種未發(fā)病
具體實(shí)施例方式實(shí)驗(yàn)中使用的載體PMCG161 (該載體保存在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所病毒組實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，可向公眾發(fā)放)是專門適用于禾本科植物轉(zhuǎn)化的干擾載體(圖6)，它含有來(lái)源于水稻的Rice waxy-a intron 1，位于5442bp_6576bp，在它的上游含有AscI和AvrII兩個(gè)酶切位點(diǎn)，用來(lái)構(gòu)建cp基因的正義鏈，在它的下游含有SpeI與SgfI位點(diǎn)，用來(lái)構(gòu)建cp 基因的反義鏈(圖7)。實(shí)驗(yàn)中所用的pGEM T-easy，購(gòu)自Promega生物技術(shù)公司。pMD18_T為常用載體。陜西韓城SXHC-2樣品，在申請(qǐng)人的論文“陜西韓城嚴(yán)重發(fā)生的小麥矮縮病病原鑒定與原因分析”中公開(kāi)過(guò)，該材料保存在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所病毒組實(shí)驗(yàn)室內(nèi)， 可向公眾發(fā)放。實(shí)施例1，抗小麥矮縮病毒(WDV)的RNA干涉載體的構(gòu)建步驟1、依據(jù)已知的WDV的基因組序列，設(shè)計(jì)全長(zhǎng)cp基因的引物，如下SEQ ID NOl (WDV-CP) 5，-ATGGTGACCAACAAGGACTCCC-3，SEQ ID N02 (WDV-CP) 5，-TACTGAATGCCGATGGCTTTG-3， 以陜西韓城SXHC-2樣品的總DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增WDV-CP，得到PCR產(chǎn)物，目的片段為783bp (圖1)?；厥誔CR產(chǎn)物，與pMDIS-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，進(jìn)行克隆測(cè)序鑒定，如SEQ ID Ν09所示，得到cp基因的陽(yáng)性克隆。步驟2 設(shè)計(jì)帶有2個(gè)酶切位點(diǎn)AscI、AvrI的引物AscI
SEQ ID N03 =WDV-CP+(F) :5， -AT GGCGCGCC ATGGTGACCAACAAGGACTCCC-3，AvrIISEQ ID N04=WDV-CP+(R) :5， -AT CCTAGG TTACTGAATGCCGATGGCTTTG-3，
以陽(yáng)性質(zhì)粒pMD18-T-WDV_CP為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物(圖2)，回收PCR 產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，得到陽(yáng)性質(zhì)粒pMD18-T-WDV_CP+。用AscI、 Avrl，雙酶切陽(yáng)性質(zhì)粒和載體pMCG161，再用T4 DNA連接酶將正義鏈片段和載體連接，得到 WDV-CP正義鏈載體pMCG161+W(簡(jiǎn)寫pS)。正義鏈載體酶切檢測(cè)結(jié)果(圖3)步驟3、設(shè)計(jì)帶有2個(gè)酶切位點(diǎn)SpeI和SgfI的引物SgfISEQ ID N05 =WDV-CP-(F) :5，-AT GCGATCGC TTACTGAATGCCGATGGCTTTG-3，SpeISEQ ID N06 =WDV-CP-(R) :5，-AT ACTAGT ATGGTGACCAACAAGGACTCCC-3，以陽(yáng)性質(zhì)粒pMD18-T-WDV-CP為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到產(chǎn)物、回收與pMD18_T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，得到陽(yáng)性質(zhì)粒pMD18-T-WDV-CP-。用SpeI和SgfI雙酶切陽(yáng)性質(zhì)粒和載體PMCG161，再用T4DNA連接酶將反義鏈片段和載體連接，得到WDV-CP反義鏈載體pMCG161-W(簡(jiǎn)寫pA)。反義鏈載體酶切檢測(cè)結(jié)果(圖4)步驟4、WDV_CP正義鏈載體陽(yáng)性質(zhì)粒經(jīng)SpeI、SgfI酶切，將經(jīng)SpeI、SgfI酶切得到的反義鏈連接到WDV-CP正義鏈載體上，最終構(gòu)建成干擾載體pMCG161+/-W(簡(jiǎn)寫pSA)。干擾載體酶切檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5。實(shí)施例2轉(zhuǎn)基因植物的獲得(圖8)步驟1、干擾載體及其對(duì)照載體，分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5ci，涂板，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單菌落，經(jīng)過(guò)小量液體LB(3-5ml)震蕩培養(yǎng)；中量培養(yǎng)(20_30ml)后；以1 50 的比例接種200ml液體LB培養(yǎng)ζ基，37°C震蕩培養(yǎng)2_3小時(shí)；加入終濃度為170 μ g/ml的氯霉素，繼續(xù)培養(yǎng)16-18小時(shí)；5000rpml0分鐘離心收集菌體；采用大量質(zhì)粒提取試劑盒 (TIANGEN)純化質(zhì)粒。方法參見(jiàn)廠家說(shuō)明書(shū)。獲得質(zhì)粒濃度達(dá)2-3mg/ml，含有90%以上的超螺旋DNA，可用于基因槍轉(zhuǎn)化。步驟2、將授粉14天左右的小麥幼穗(品種揚(yáng)麥158、科農(nóng)199等)從田間采回， 人工剝粒后在超凈工作臺(tái)中70%乙醇和10% (V/V)次氯酸鈉溶液消毒，用解剖刀取小麥幼胚，幼胚直徑約1-1. 5mm為宜，放于SD2培養(yǎng)基上，盾片向上，胚芽向下，兩胚芽相互間距 0. 5cm左右。26°C黑暗條件下誘導(dǎo)愈傷組織，7-10d后將愈傷組織集中于培養(yǎng)皿中央，直徑約2cm左右，經(jīng)0.4mol/L滲透壓培養(yǎng)基(SD2添加0. 2mol/L甘露醇，0. 2mol/L山梨醇)處理4 6h以備基因槍轟擊之用。步驟3、將步驟2備好的小麥愈傷組織和步驟1中提取的質(zhì)粒應(yīng)用于基因槍的轉(zhuǎn)化。轟擊后的愈傷組織繼續(xù)在原滲透壓培養(yǎng)基上處理16 18h，然后轉(zhuǎn)入SD2培養(yǎng)基黑暗條件下(26°C )恢復(fù)培養(yǎng)2周。步驟4、恢復(fù)培養(yǎng)后的愈傷組織移到MS+NAA(lmg/L)+KT lmg/ L+Bialaphos (PPT) 3mg/L的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)分化3周(每日IOh光照，24 °C )，出現(xiàn)綠芽分化后，轉(zhuǎn)到無(wú)激素培養(yǎng)基(MS+Bialaphos 5mg/L)上培養(yǎng)1周，再轉(zhuǎn)入無(wú)激素培養(yǎng)基 (MS+Bialaphos 5mg/L)上繼續(xù)培養(yǎng)(每日IOh光照，24°C )，直到小苗生長(zhǎng)到1 2cm時(shí)，移入MS+IAA(0. 5mg/L)+Bialaphos (6mg/L)的培養(yǎng)基上壯苗，再生植株生長(zhǎng)到適宜大小(苗高6 8cm，根系較好)時(shí)放入4°C冰箱中春化處理20 30天，然后移入裝有滅菌土的紙營(yíng)養(yǎng)缽中，外罩保鮮膜保濕。最后移入花盆，置于溫室。通過(guò)基因槍的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了四個(gè)載體的Ttl代植株。 實(shí)施例3轉(zhuǎn)基因小麥植株的分子檢測(cè)(見(jiàn)圖9)本發(fā)明以SEQ ID N03/SEQ ID N04和 Intron 1/Intron 2 為引物，對(duì)以揚(yáng)麥 158 為受體的轉(zhuǎn)WDV全長(zhǎng)cp基因的400株Ttl代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果表明，獲得了四個(gè)載體的Ttl代轉(zhuǎn)基因小麥，pSA、pS、pA和PMCG161的陽(yáng)性Ttl代轉(zhuǎn)基因小麥植株分別是14株、 6株、4株和4株。對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥的TciJ1代分別進(jìn)行了 PCR鑒定，T1代植株呈現(xiàn)出3 1分罔。實(shí)施例7、轉(zhuǎn)基因小麥植株對(duì)WDV的抗病性鑒定(見(jiàn)圖10)本發(fā)明采用生物學(xué)方法測(cè)定了轉(zhuǎn)基因小麥植株對(duì)WDV的抗病性。方法如下待小麥長(zhǎng)到3葉期時(shí)，對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥進(jìn)行WDV接種試驗(yàn)。將已在WDV毒源上飼毒5天的條沙葉蟬接種轉(zhuǎn)基因小麥植株、對(duì)照小麥感病品種揚(yáng)麥158和對(duì)照小麥抗病品種小偃22。每株接種帶毒(WDV)條沙葉蟬10-20頭，待條沙葉蟬在麥苗上取食5天后，用殺蟲(chóng)劑把條沙葉蟬殺死，接種25天后觀察記錄發(fā)病情況?？共⌒怨δ軝z測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖10所示。感病的對(duì)照小麥品種揚(yáng)麥158接種條沙葉蟬后發(fā)病，而轉(zhuǎn)基因植株接種條沙葉蟬后未發(fā)病。由于WDV于2007年在我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)，因此關(guān)于它的病情級(jí)別的劃分只鑒于我們實(shí)驗(yàn)室與西北農(nóng)林科技大學(xué)所做的WDV抗病品種的調(diào)查，建議目前WDV的級(jí)別劃分如下0 級(jí)不發(fā)病；1級(jí)中感，矮化分蘗少；2級(jí)感病，嚴(yán)重矮化分蘗多。接種的四個(gè)載體的T2代轉(zhuǎn)基因小麥中，干涉載體的小麥抗病性好。干擾載體的T2代轉(zhuǎn)基因小麥的接種WDV試驗(yàn)表明獲得了干擾載體的四個(gè)抗病性株系pSA-l、6、7、17。抗病性功能檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖10所示。
權(quán)利要求
1.抗小麥矮縮病毒的RNA干涉載體，包括骨架載體和含有正、反義鏈的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其特征在于以SEQ ID N09所示的WDV-CP基因序列作為正、反義鏈。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的RNA干涉載體，所述骨架載體為PMCG161。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的RNA干涉載體，所述WDV-CP基因的正義鏈插入pMCG161中上游的兩個(gè)酶切位點(diǎn)AscI、AvrII間，WDV-CP基因的反義鏈插入pMCG161中下游的兩個(gè)酶切位點(diǎn) SpeI、SgfI 間。
4.權(quán)利要求3所述的RNA干涉載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟(1)WDV-CP基因的獲得以陜西韓城SXHC-2樣品的總DNA為模板，以SEQ ID NOl和SEQ ID N02為引物對(duì)，經(jīng) PCR擴(kuò)增WDV-CP得到PCR產(chǎn)物，回收目的片段，與pMD18_T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α 得到陽(yáng)性質(zhì)粒PMD18-T-WDV-CP ；SEQ ID NOl :5’ -ATGGTGACCAACAAGGACTCCC-3’， SEQ ID Ν02 :5’ -TTACTGAATGCCGATGGCTTTG-3，，(2)WDV-CP正義鏈載體的獲得以陽(yáng)性質(zhì)粒PMD18-T-WDV-CP為模板，以SEQ ID Ν03和SEQ ID Ν04為引物對(duì)，經(jīng)PCR 擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物，回收目的片段，與pMDlS-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α得到陽(yáng)性質(zhì)粒pMD18-T-WDV-CP+，用AscI、AvrII雙酶切陽(yáng)性質(zhì)粒和載體pMCG161，再用T4DNA連接酶將正義鏈片段和載體連接，得到WDV-CP正義鏈載體；SEQ ID N03 :5’ -AT GGCGCGCC ATGGTGACCAACAAGGACTCCC-3，， SEQ ID N04 5' -AT CCTAGG TTACTGAATGCCGATGGCTTTG-3，，(3)WDV-CP干涉載體的獲得以陽(yáng)性質(zhì)粒PMD18-T-WDV-CP為模板，以SEQ ID N05和SEQ ID N06為引物對(duì)，經(jīng)PCR 擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物，回收目的片段，與pMDlS-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α得到陽(yáng)性質(zhì)粒pMD18-T-WDV-CP-，用Spel、SgfI雙酶切陽(yáng)性質(zhì)粒和WDV-CP正義鏈載體，再用T4DNA連接酶將反義鏈片段和正義鏈載體連接，得到干擾載體PMCG161+/-WDV ； SEQ ID N05 :5’ -AT GCGATCGC TTACTGAATGCCGATGGCTTTG-3，， SEQ ID N06 :5’ -AT ACTAGT ATGGTGACCAACAAGGACTCCC-3，。
5.權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法的第C3)步WDV-CP干涉載體的獲得用下列方法替代A)WDV-CP反義鏈載體的獲得以陽(yáng)性質(zhì)粒PMD18-T-WDV-CP為模板，以SEQ ID N05和SEQ ID N06為引物對(duì)，經(jīng)PCR 擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物，回收目的片段，與pMDlS-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α得到陽(yáng)性質(zhì)粒PMD18-T-WDV-CP-，用Spel、SgfI雙酶切陽(yáng)性質(zhì)粒和載體pMCG161，再用T4DNA連接酶將反義鏈片段和載體連接，得到反義鏈載體PMCG161-WDV ；SEQ ID N05 :5’ -AT GCGATCGC TTACTGAATGCCGATGGCTTTG-3’ SEQ ID N06 :5’ -AT ACTAGT ATGGTGACCAACAAGGACTCCC-3，B)WDV-CP干涉載體的方法用AscI、AvrII雙酶切pMD18-T_WDV_CP+陽(yáng)性質(zhì)粒和WDV-CP反義鏈載體，再用T4DNA 連接酶將正義鏈片段和酶切后的WDV-CP反義鏈載體連接，得到干擾載體PMCG161+/-WDV。
6.權(quán)利要求2-4任一所述RNA干涉載體在遺傳轉(zhuǎn)化單子葉植物中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述應(yīng)用，是將上述RNA干涉載體轉(zhuǎn)化單子葉受體植物，使之對(duì)小麥矮縮病毒產(chǎn)生抗性。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述應(yīng)用，所述轉(zhuǎn)化方法為基因槍法。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述應(yīng)用，所述受體植物為禾本科植物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述應(yīng)用，所述禾本科植物為小麥。
全文摘要
本發(fā)明涉及“抗小麥矮縮病毒的RNA干涉載體、構(gòu)建方法及其在小麥遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用”，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明中抗小麥矮縮病毒的RNA干涉載體骨架載體是pMCG161，在其上游的兩個(gè)酶切位點(diǎn)AscI、AvrII間插入WDV-CP基因的正義鏈，在下游的兩個(gè)酶切位點(diǎn)SpeI、SgfI間插入WDV-CP基因的反義鏈，通過(guò)載體上的intron形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，這樣可得到了用于基因槍轉(zhuǎn)化單子葉植物的雙價(jià)載體。本發(fā)明通過(guò)基因槍法將其轉(zhuǎn)入小麥中，獲得對(duì)小麥矮縮病毒具有抗性的轉(zhuǎn)基因小麥品種。本發(fā)明為植物抗病育種提供了一種高效的育種途徑和新的策略。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102154353SQ20101061989
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2010年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月31日
發(fā)明者劉艷, 吳蓓蕾, 龐俊蘭, 李莉, 王錫鋒 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所