專利名稱：雙抗大麥黃矮病毒和小麥矮縮病毒的rna干涉載體、構(gòu)建方法及在小麥遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。特別是涉及一種適合單子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化、并兼抗兩種病毒病的RNA干涉載體的構(gòu)建及其在小麥遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。進(jìn)一步涉及大麥黃矮病毒BYDV-GAV和小麥矮縮病毒W(wǎng)DV的外殼蛋白(CP)基因的表達(dá)載體的構(gòu)建及其遺傳轉(zhuǎn)化并得到雙抗性小麥植株。
背景技術(shù)：
小麥黃矮病是小麥重要病害之一。它是由蚜蟲傳播的大麥黃矮病毒 (ffarleyyellow dwarf virus, BYDVs)引起的。感病的小麥表現(xiàn)為代謝紊亂、葉片發(fā)黃、植株矮化、有效分孽減少、穗粒數(shù)和千粒重降低而嚴(yán)重減產(chǎn)，因此該病有“黃色瘟疫”之稱。根據(jù)不同種的麥蚜傳播大麥黃矮病毒的能力不同，美國學(xué)者Rochow將大麥黃矮病毒劃分成5個株系，PAV, MAY, SGV、RPV和RMV。在國內(nèi)周廣和等將我國的大麥黃矮病毒分離物劃分為GAV、GPV、PAGV和RMV，其中GPV為我國特有的株系。幾乎所有種植小麥的國家均發(fā)生過此病。1978年美國小麥黃矮病大爆發(fā)使其減產(chǎn)60-80%，1988年德國發(fā)生小麥黃矮病，使其冬小麥減產(chǎn)40%。我國在1966、1970、1973、1978、1980等五年均發(fā)生過該病， 平均每次產(chǎn)量損失達(dá)20%以上。目前該病害在我國西北、華北、西南及華東等近20個省、 市、自治區(qū)的冬春麥區(qū)每年都有不同程度的為害。其中以豫西、晉南、關(guān)中、隴東及華東和西南地區(qū)為冬小麥的主要流行區(qū)，甘肅省河西走廊、陜北等地為冬春麥混種流行區(qū)，寧夏、內(nèi)蒙古、晉北、冀北及東北地區(qū)為春小麥的主要流行區(qū)。近年有加重趨勢。小麥的另一個主要病害是小麥矮縮病(Wheat dwarf disease)，是由小麥矮縮病毒(Wheatdwarf virus,WDV)引起的。WDV的傳毒介體是條沙葉蟬，它以成蟲、若蟲刺吸作物莖葉，導(dǎo)致受害幼苗變色，生長受到抑制。20世紀(jì)80年代最先在瑞典報道了小麥矮縮病毒的發(fā)生(Kvarnheden等，2002)。近年來，小麥矮縮病已經(jīng)在非洲、歐洲、亞洲和大洋洲引起了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。2007年本實驗室在國內(nèi)首次報道了小麥矮縮病毒引起矮縮病的發(fā)生。 隨后該病在陜西、甘肅、河北、云南等12個省被發(fā)現(xiàn)。其中陜西北部麥區(qū)已經(jīng)引起嚴(yán)重的減產(chǎn)，如2007和2008年陜西韓城發(fā)病面積超過10萬畝，病株率20%以上，重病田達(dá)1萬畝， 目前該病已經(jīng)成為威脅我國西北、華北和西南麥區(qū)的重要病毒病。目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上防治這兩種病害的主要方法化學(xué)藥劑、耕作措施和抗病育種。化學(xué)藥劑容易造成人蓄中毒、農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染等危害；輪作換茬等耕作措施不能根除病害。綜合比較而言，培育抗病害的小麥新品種是有效的防治措施，但是由于小麥抗病種質(zhì)資源的缺乏，常規(guī)的育種方法又存在周期長、定向性差、易帶入不良性狀等缺點(diǎn)，常規(guī)育種方法培育抗病害的小麥新品種已經(jīng)不能滿足人類和社會發(fā)展的需要，因此小麥生物技術(shù)抗病育種應(yīng)運(yùn)而生。近年來，RNA干涉(RNA interference, RNAi)在研究植物病毒基因功能、致病機(jī)制和植物抗病機(jī)理中有了廣泛應(yīng)用。RNAi技術(shù)是由RNA介導(dǎo)的通過特異性的相互作用來抑制基因表達(dá)的遺傳干涉現(xiàn)象。它能夠特異、有效地降解mRNA，從而引起轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默。當(dāng)表達(dá)來源與病毒某一基因或核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因植物發(fā)生RNA沉默時，能對入侵的同一病毒或同屬中相近病毒的RNA進(jìn)行降解，使入侵的病毒不能在植物中積累，從而賦予轉(zhuǎn)基因植物病毒抗性。近年來，雖然RNAi技術(shù)在植物病毒基因工程中有了廣泛應(yīng)用，但是在國內(nèi)外RNAi介導(dǎo)的BYDV-GAV和WDV雙抗性還未見報道。本實驗以近年在我國主麥區(qū)嚴(yán)重發(fā)生的大麥黃矮病毒BYDV-GAV和小麥矮縮病毒 WDV為研究重點(diǎn)，利用植利用植物轉(zhuǎn)基因工程技術(shù)將BYDV-GAV-CP和WDV-CP核苷酸片段導(dǎo)入小麥，通過其特異地干擾、降解或沉默BYDV-GAV和WDV基因在小麥植株內(nèi)的正常復(fù)制、積累和傳播，篩選獲得分別或同時抗BYDV-GAV和WDV的小麥品系，為進(jìn)一步結(jié)合常規(guī)育種工作，改良現(xiàn)有的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)但不抗病的小麥品種，以便實現(xiàn)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得免疫或高抗 BYDV-GAV和WDV的小麥新品系的目的。

發(fā)明內(nèi)容
基于上述領(lǐng)域中的空白，本發(fā)明構(gòu)建了可用于基因槍遺傳轉(zhuǎn)化單子葉植物的含有大麥黃矮病毒BYDV-GAV-CP和小麥矮縮病毒W(wǎng)DV-CP基因的RNA干擾載體，這些載體包含大麥黃矮病毒BYDV-GAV核苷酸序列中高保守性的CP基因與小麥矮縮病毒W(wǎng)DV核苷酸序列中高保守性的CP基因連接形成的CP基因片段(簡寫為BW-CP基因)，并利用基因槍法將其導(dǎo)入受體小麥。由于本發(fā)明所選擇的序列為各病毒的保守序列，因此所得到的轉(zhuǎn)基因植株可以使入侵的致病病毒發(fā)生RNA沉默現(xiàn)象，且這種沉默現(xiàn)象使植物對該病毒具有普遍的抗性。本發(fā)明還提供這些干擾病毒基因表達(dá)載體的構(gòu)建方法及應(yīng)用，為植物抗病育種工程提供了一種新的策略和思路。雙抗大麥黃矮病毒和小麥矮縮病毒的RNA干涉載體，包括骨架載體和含有正、反義鏈的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其特征在于以SEQ ID N013所示的BW-CP基因序列作為正、反義鏈。所述骨架載體為PMCG161。所述BW-CP基因的正義鏈插入pMCG161中上游的兩個酶切位點(diǎn)AscI、AvrII間， BW-CP基因的反義鏈插入pMCG161中下游的兩個酶切位點(diǎn)SpeI、SgfI間。上述干涉載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟(1)以感染大麥黃矮病毒小麥總DNA為模板，以SEQ ID NOl和SEQ ID N02為引物對，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增BYDV-GAV-CP，得到PCR產(chǎn)物I，所述SEQ ID NOl (BYDV-GAV-CP) 5 ‘ -ATGAATTCAGTAGGCCGTAGA-3，所述SEQ ID N02 (BYDV-GAV-CP) 5 ‘ -CTATTTGGGAGTCATGTTGGC-3，(2)以感染小麥矮縮病毒小麥總DNA為模板，以SEQ ID N03和SEQ ID N04為引物對，經(jīng)PCR擴(kuò)增WDV-CP，得到PCR產(chǎn)物11，所述SEQ ID N03 (WDV-CP) 5' -ATGGTGACCAACAAGGACTCCC-3，所述SEQ ID N04 (WDV-CP) 5' -TTACTGAATGCCGATGGCTTTG-3，(3)以PCR產(chǎn)物I和II的混合物(1 1)為模板，以SEQ ID N05和SEQ ID N06 為弓I物對，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物III，目的片段為1383bp，回收PCR產(chǎn)物III，與pMD 18-T 載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 5 α，得到陽性質(zhì)粒pMD18-T-BW-CP，
SEQ ID N04的互補(bǔ)逆序歹Ij
SEQ ID NOl正序列 SEQ ID N05 =Bff-CP :5， -GCCAACATGACTCCCAAATAG ATGGTGACCAACAAGGACTCCC-3‘
SEQ ID N02正序列 TCTATTTGGGAGTCATGTTGGC-3‘SEQ ID N03互補(bǔ)逆序列SEQ ID N06 =Bff-CP :5，-GGGAGTCCTTGTTGGTCACCA(4)以陽性質(zhì)粒pMD18-T-Bff-CP為模板，以SEQ ID N07和SEQ ID N08為引物對， 經(jīng)PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物IV，回收目的片段，與pMDIS-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α得到陽性質(zhì)粒PMD18-T-BW-CP+，用AscI、AvrI雙酶切陽性質(zhì)粒和載體pMCG161，，再用T4DNA 連接酶將正義鏈片段和載體連接，得到干擾載體PMCG161+BW;AscISEQ ID NOlSEQ ID NO. 7 =Bff-CP+ :5，-ATGGCGCGCC ATGAATTCAGTAGGCCGTAGA-3’SEQ ID NO. 8 =Bff-CP+ :5，-ATCCTAGG TTACTGAATGCCGATGGCTTTG-3’AvrllSEQ ID N04(5)以陽性質(zhì)粒pMD18-T-BW-CP為模板，以SEQ ID N09和SEQ ID NOlO為引物對， 經(jīng)PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物V，回收目的片段，與pMDIS-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α得到陽性質(zhì)粒 PMD18-T-BW-CP-，用 SpeI、SgfI 雙酶切陽性質(zhì)粒 pMD18-T-BW_CP-和 pMCG161+BW， 再用T4DNA連接酶將反義鏈片段和載體連接，得到干擾載體pMCG161+/-BW;或者用Spel、 SgfI雙酶切pMD18-T-BW-CP-陽性質(zhì)粒和載體pMCG161，用T4 DNA連接酶將反義鏈片段和酶切后的載體PMCG161連接，得到反義鏈載體PMCG161-BW，再用Spel、SgfI雙酶切正義鏈載體和反義鏈載體，再用T4 DNA連接酶將反義鏈片段和酶切后的正義鏈載體連接，得到干擾載體 PMCG161+/-BW，SgfISEQ ID N04SEQ ID N09 =Bff-CP- 5，-ATGCGATCGC TTACTGAATGCCGATGGCTTTG-3 ’SEQ ID NO 10 =Bff-CP- :5，-ATACTAGT ATGAATTCAGTAGGCCGTAGA -3，SpelSEQ ID NOl上述RNA干涉載體在遺傳轉(zhuǎn)化單子葉植物中的應(yīng)用。所述應(yīng)用是將上述雙抗大麥黃矮病毒和小麥矮縮病毒RNA干涉載體轉(zhuǎn)化有關(guān)受體植物，使之對大麥黃矮病毒和小麥矮縮病毒產(chǎn)生抗性。所述轉(zhuǎn)化方法為基因槍法。所述受體植物為禾本科植物。所述禾本科植物為小麥。本發(fā)明在BYDV-GAV (Genebank 登錄號AY220739 ；晉治波等，2003)和 WDV (來自陜西韓城SXHC-2樣品)的基因組上設(shè)計了 BYDV-GAV外殼蛋白(CP)和WDV外殼蛋白(CP) 的連接片段BW-CP，根據(jù)干涉載體pMCG161的酶切位點(diǎn)設(shè)計引物，在其上游的兩個酶切位點(diǎn) AscI、AvrII間插入BW-CP基因的正義鏈，在下游的兩個酶切位點(diǎn)Spel、SgfI間插入BW-CP 基因的反義鏈。通過載體上的intron(rice ffaxy-a intron 1)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，這樣可用于基因槍轉(zhuǎn)化單子葉植物的干擾載體就構(gòu)建成功。本發(fā)明為植物抗病基因工程提供了一種雙抗干擾病毒基因表達(dá)載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，為轉(zhuǎn)基因技術(shù)及RNA干擾在生物抗性育種中的應(yīng)用提供了新的思路。將該載體轉(zhuǎn)入小麥中，成功獲得了抗病毒植株，實現(xiàn)了利用RNA干擾原理獲得抗BYDV-GAV和WDV小
6麥新品種的預(yù)期目標(biāo)，為RNA干擾介導(dǎo)的植物抗性育種及基因工程提供了成功的實例，彌補(bǔ)了 RNAi介導(dǎo)的BYDV-GAV和WDV雙抗性研究在本研究領(lǐng)域中的空白。本發(fā)明的干擾載體組合并不只限于對BYDV-GAV和WDV進(jìn)行轉(zhuǎn)化和用于培育對 BYDV-GAV和WDV有抗性的轉(zhuǎn)基因植株。利用本發(fā)明的干擾載體轉(zhuǎn)化所得的抗性生物體可以是任何微生物、植物或其組織、細(xì)胞，以及由此所獲得具有任何抗病活性的微生物、植物，以及該類植物后代的種子、雜交和轉(zhuǎn)育后代。


圖1. BYDV-GAV的外殼蛋白(CP)基因的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(I)電泳圖片；泳道1DL2000，2健康小麥植株，3. 4. 5. BYDV-GAV分離物，圖2. WDV的外殼蛋白(CP)基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(II)；泳道1. DL2000, 2-4. WDV分離物，5.健康小麥植株圖3A. PCR擴(kuò)增獲得串聯(lián)的BW-CP的PCR產(chǎn)物III電泳圖；泳道1DL200，4-5 泳道.PCR 產(chǎn)物 III圖3B. PCR擴(kuò)增獲得串聯(lián)的BW-CP的產(chǎn)物III回收電泳圖；泳道1DL2000，2-3 泳道.PCR 產(chǎn)物 III圖4.干擾載體重組質(zhì)粒pMCG161+/-BW(目的片段1383bp)的PCR鑒定結(jié)果；泳道1、8為DL2000，3_4.正義鏈目的片段，6_7反義鏈目的片段圖5.干擾載體重組質(zhì)粒PMCG161+/-BW的酶切鑒定結(jié)果；泳道1為DL2000，3. AscI、AvrII雙酶切得正義鏈目的片段，5. SpeI和SgfI雙酶切得反義鏈目的片段，7.質(zhì)粒PMCG161空載體對照圖6.載體pMCG161的結(jié)構(gòu)示意圖；圖7.質(zhì)粒載體pMCG161外源片斷構(gòu)建線性圖；AscI和AvrII兩個酶切位點(diǎn)，用來插入CP基因的正義鏈；在它的下游含有SpeI與 SgfI兩個酶切位點(diǎn)，用來插入CP基因的反義鏈，圖8.小麥基因槍轉(zhuǎn)化小麥幼胚愈傷組織獲得轉(zhuǎn)基因植株的過程；A基因槍轉(zhuǎn)化前愈傷組織處理，B基因槍轉(zhuǎn)化后愈傷組織恢復(fù)培養(yǎng)，C基因槍轉(zhuǎn)化后打槍后愈傷組織出現(xiàn)綠芽點(diǎn)，D選擇壓為PPT 6mg/L長勢旺盛的轉(zhuǎn)基因再生小麥，E誘導(dǎo)生根壯苗培養(yǎng)，F(xiàn)移栽到花盆中的轉(zhuǎn)基因小麥，G轉(zhuǎn)基因小麥移栽溫室圖9A轉(zhuǎn)基因后代中WDV-CP的PCR電泳圖泳道1.DL2000 2.陽性對照；3.性對照.；4水· ；5. 6. 7. 8. 9. 10轉(zhuǎn)基因陽性植株;圖9B轉(zhuǎn)基因后代中intron的PCR電泳圖泳道1. DL2000 2.陽性對照；3.陰性對照；4.水；5. 6. 7. 8…轉(zhuǎn)基因植株；5、7、11 為陽性植株圖9C轉(zhuǎn)基因后代中BYDV-CP的PCR電泳圖泳道1.水2. DL2000 ；3.陽性對照；4.陰性對照；5. 6. 7. 8…轉(zhuǎn)基因植株；6. 7. 8…轉(zhuǎn)基
因陽性植株圖9D轉(zhuǎn)基因后代中BW-CP基因的PCR電泳圖泳道1. DL2000 3.陽性對照；4陰性對照.；5水.；2. 5. 6. 7. 8轉(zhuǎn)基因植株；6.7.8···轉(zhuǎn)基因陽性植株圖10.轉(zhuǎn)基因小麥植株BYDV、WDV的抗性鑒定對照圖1、感病的對照小麥品種揚(yáng)麥158未接種BYDV-GAV未發(fā)病2、感病的對照小麥品種揚(yáng)麥158接種BYDV-GAV發(fā)病3、抗病的對照小麥品種中5接種BYDV-GAV未發(fā)病4、小偃22 (抗病的對照小麥品種)接種WDV未發(fā)病5、6、7轉(zhuǎn)基因植株接種BYDV-GAV和WDV未發(fā)病
具體實施例方式實驗中使用的載體PMCG161是專門適用于禾本科植物轉(zhuǎn)化的干擾載體(圖6)，它含有來源于水稻的Rice waxy-a intron 1，位于M42bp_6576bp，在它的上游含有AscI和 AvrII兩個酶切位點(diǎn)，用來構(gòu)建BW-CP基因的正義鏈，在它的下游含有SpeI與SgfI位點(diǎn)，用來構(gòu)建BW-CP基因的反義鏈(圖7)。實驗中所用的pGEM T-easy，購自Promega生物技術(shù)公司。BYDV-GAV 基因組在 Genebank 登錄號是 AY220739。陜西韓城SXHC-2樣品，在申請人的論文“陜西韓城嚴(yán)重發(fā)生的小麥矮縮病病原鑒定與原因分析”中公開過，該材料保存在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所病毒組實驗室內(nèi)， 可向公眾發(fā)放。實施例1，雙抗大麥黃矮病毒和小麥矮縮病毒的RNA干涉載體的構(gòu)建步驟1、依據(jù)BYDV-GAV的基因組序列，本發(fā)明首先設(shè)計全長CP基因引物，如下SEQ ID NOl (BYDV-GAV-CP) 5，-ATGAATTCAGTAGGCCGTAGA-3，SEQ ID N02 (BYDV-GAV-CP) 5’ -CTATTTGGGAGTCATGTTGGC-3，以BYDV-GAV的總RNA為模板，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增全長CP基因片段(600bp)(圖1)，目的片段回收后連接到pGEM T-easy載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci，進(jìn)行克隆測序鑒定，得到 BYDV-GAV-CP基因的陽性克隆。步驟2、依據(jù)WDV的基因組序列，本發(fā)明設(shè)計全長CP基因的引物，如下SEQ ID N03 (WDV-CP) 5，-ATGGTGACCAACAAGGACTCCC-3，SEQ ID N04 (WDV-CP) 5，-TTACTGAATGCCGATGGCTTTG-3，以感染小麥矮縮病毒(WDV)的陜西韓城SXHC-2樣品的小麥總DNA為模板，經(jīng)PCR 擴(kuò)增WDV-CP,得到PCR產(chǎn)物，目的片段為783bp (圖2)?；厥誔CR產(chǎn)物，與pMD18_T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，進(jìn)行克隆測序鑒定，得到WDV-CP基因的陽性克隆。步驟3、依據(jù)BYDV-GAV-CP和WDV-CP序列設(shè)計連接引物，獲得連接片段BW-CP基因連接引物如下
SEQ ID N04的互補(bǔ)逆序列 SEQ ID NOl正序列 SEQ ID N05 =Bff-CP :5， -GCCAACATGACTCCCAAATAG ATGGTGACCAACAAGGACTCCC-3‘SEQ ID N03互補(bǔ)逆序列SEQ ID N06 =Bff-CP :5，-GGGAGTCCTTGTTGGTCACCA以 BYDV-GAV-CP 和 WDV-CP 的 PCR 產(chǎn)物混合物(1
SEQ ID N02正序列 TCTATTTGGGAGTCATGTTGGC-3‘
1)為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到 PCR產(chǎn)物III，目的片段為1383bp(圖3)?；厥誔CR產(chǎn)物，與pMD18_T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿
8菌DH5 α，進(jìn)行克隆測序鑒定，得到BW-CP基因的陽性克隆，即可用于雙價RNA干涉載體的構(gòu)建。步驟4、設(shè)計帶有2個酶切位點(diǎn)AscI、AvrII的引物SEQ ID N07和SEQ ID N08AscISEQ ID NOlSEQ ID N07 =Bff-CP+ :5，-ATGGCGCGCC ATGAATTCAGTAGGCCGTAGA-3’SEQ ID N08 =Bff-CP+ :5，-ATCCTAGG TTACTGAATGCCGATGGCTTTG-3’AvrIISEQ ID NO. 4以陽性質(zhì)粒pMD18-T-BW-CP為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物回收PCR 產(chǎn)物(138;3bp)(圖4)，與PMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci，得到陽性質(zhì)粒 PMD18-T-BW-CP+。用AscI、AvrII雙酶切陽性質(zhì)粒和載體pMCG161，再用T4DNA連接酶將正義鏈片段和載體連接，得到BW-CP正義鏈載體pMCG161+BW(簡寫pS)。步驟5、設(shè)計帶有2個酶切位點(diǎn)SpeI和SgfI的引物SEQ ID N09和SEQ ID NOlOSgfISEQ ID N04SEQ ID N09 =Bff-CP- 5，-ATGCGATCGC TTACTGAATGCCGATGGCTTTG-3 ’SEQ ID NOlO =Bff-CP- 5，-ATACTAGT ATGAATTCAGTAGGCCGTAGA-3’SpeISEQ ID NOl以陽性質(zhì)粒pMD18-T-BW-CP為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR(1383bp)(圖4)，回收
PCR產(chǎn)物，與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 5 α，得到陽性質(zhì)粒pMD18-T-BW_CP-。用 SgfKSpeI雙酶切陽性質(zhì)粒和載體PMCG161，再用T4DNA連接酶將經(jīng)SgfI、SpeI雙酶切得到的反義鏈片段和載體連接，得到BW-CP反義鏈載體pMCG161-BW(簡寫pA)。步驟6、Bff-CP正義鏈載體陽性質(zhì)粒經(jīng)SpeI、SgfI酶切，再用T4DNA連接酶將經(jīng)Spel、SgfI酶切得到的反義鏈連接到BW-CP正義鏈載體上，最終構(gòu)建成干擾載體 pMCG161+/"Bff(簡寫pSA)。干擾載體pMCG161+/_BW的酶切檢測結(jié)果見圖5?；蛘呤荁W-CP反義鏈載體陽性質(zhì)粒經(jīng)AscI、AvrI雙酶切，再用T4DNA連接酶將經(jīng)AscI、AvrI雙酶切得到的正義鏈連接到BW-CP反義鏈載體上，最終構(gòu)建成干擾載體 pMCG161+/"Bffo實施例2轉(zhuǎn)基因植物的獲得(圖8)步驟1、干擾載體及其對照載體，分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH 5 α，涂板，37°C培養(yǎng)過夜。挑取單菌落，經(jīng)過小量液體LB(3-5ml)震蕩培養(yǎng)；中量培養(yǎng)O0_30ml)后；以1 50 的比例接種200ml液體Lff培養(yǎng)基，37°C震蕩培養(yǎng)2-3小時；加入終濃度為140 μ g/ml的氯霉素，繼續(xù)培養(yǎng)16-18小時；5000rpml0分鐘離心收集菌體；采用大量質(zhì)粒提取試劑盒 (TIANGEN)純化質(zhì)粒。方法參見廠家說明書。獲得質(zhì)粒濃度達(dá)2-;3mg/ml，含有90%以上的超螺旋DNA，可用于基因槍轉(zhuǎn)化。步驟2、將授粉14天左右的小麥幼穗(品種揚(yáng)麥158、揚(yáng)麥12、揚(yáng)麥18、科農(nóng)199 等)從田間采回，人工剝粒后在超凈工作臺中用70%乙醇和10% (V/V)次氯酸鈉溶液消毒，用解剖刀取小麥幼胚，幼胚直徑約1-1. 5mm為宜，放于SD2培養(yǎng)基上，盾片向上，胚芽向下，兩胚芽相互間距0.5cm左右。黑暗條件下誘導(dǎo)愈傷組織，7-10d后將愈傷組織集中于培養(yǎng)皿中央，直徑約2cm左右，經(jīng)0. 4mol/L滲透壓培養(yǎng)基(S&添加0. 2mol/L甘露醇， 0. 2mol/L山梨醇)處理4 他以備基因槍轟擊之用。
步驟3、將步驟2備好的小麥愈傷組織和步驟1中提取的質(zhì)粒應(yīng)用于基因槍的轉(zhuǎn)化。轟擊后的愈傷組織繼續(xù)在原滲透壓培養(yǎng)基上處理16 18h，然后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基黑暗條件下)恢復(fù)培養(yǎng)2周。步驟4、恢復(fù)培養(yǎng)后的愈傷組織移到MS+NAA(lmg/L)+KT lmg/ L+ffialaphos (PPT) 3mg/L的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)分化3周(每日IOh光照，M °C )，出現(xiàn)綠芽分化后，轉(zhuǎn)到無激素培養(yǎng)基(MS+Wialaphos 5mg/L)上培養(yǎng)1周，再轉(zhuǎn)入無激素培養(yǎng)基 (MS+ffialaphos 5mg/L)上繼續(xù)培養(yǎng)(每日IOh光照，24°C )，直到小苗生長到1 2cm時， 移入MS+IAA(0. 5mg/L)+Wialaphos (6mg/L)的培養(yǎng)基上壯苗，再生植株生長到適宜大小(苗高6 8cm，根系較好)時放入4°C冰箱中春化處理20 30天，然后移入裝有滅菌土的紙營養(yǎng)缽中，外罩保鮮膜保濕。最后移入花盆，置于溫室。通過基因槍的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了四個載體的Ttl代植株。實施例3轉(zhuǎn)基因小麥植株的分子檢測(圖9)本發(fā)明以SEQ ID NOl/SEQ ID N02、SEQ ID N03/SEQ ID N04、SEQ ID N08/SEQ ID N08、SEQ ID N010/SEQ ID NOll為引物，對以揚(yáng)麥158、揚(yáng)麥12和揚(yáng)麥158為受體的518株 T0代轉(zhuǎn)基因再生植株進(jìn)行PCR檢測，得到pSA、pS、pA和pMCG161的TO代轉(zhuǎn)基因小麥陽性株數(shù)分別是觀株、8株、6株、4株。并對獲得的Tl和T2、轉(zhuǎn)基因再生植株進(jìn)行了跟蹤檢測， 轉(zhuǎn)基因后代植株呈現(xiàn)出3 1分離。檢測結(jié)果見圖9 圖9A是對轉(zhuǎn)基因后代中WDV-CP全長(78;3bp)的PCR檢測；圖9B 是對轉(zhuǎn)基因后代中intron(513bp)的PCR檢測；圖9C是對對轉(zhuǎn)基因后代中BYDV-CP全長 (600bp)的PCR檢測；圖9D是對對轉(zhuǎn)基因后代中Bff-CP基因(1383bp)的PCR檢測。實施例4、轉(zhuǎn)基因小麥植株的抗病性功能鑒定(圖10)本發(fā)明采用生物學(xué)方法測定了轉(zhuǎn)基因小麥植株對BYDV和WDV的抗病性。步驟一接種T1代種子經(jīng)過干燥后全部種植。先將其放入培養(yǎng)皿，用0. 7%的雙氧水處理過夜， 用清水清洗干凈，以便打破休眠。等待1-2天麥粒發(fā)芽后，放入4°C冰箱春化處理，兩周后轉(zhuǎn)入溫室生長(18°C)，待小麥長到3葉期時，對轉(zhuǎn)基因小麥進(jìn)行接種試驗。接種的類型分為三種，一部分只進(jìn)行BYDV-GAV的接種，一部分只進(jìn)行WDV的接種，還有一部分要同時進(jìn)行兩種病毒的接種。將已在GAV毒源上飼毒2天的麥二叉蚜接種轉(zhuǎn)基因小麥植株、對照小麥感病品種揚(yáng)麥158和對照小麥抗病品種中5。每株接種帶毒(GAV)蚜蟲10-20頭，待蚜蟲在麥苗上取食5天后，用殺蟲劑把蚜蟲殺死，接種25天后觀察記錄發(fā)病情況。對轉(zhuǎn)基因陽性植株進(jìn)行WDV的接種的方法如下待小麥長到3葉期時，對轉(zhuǎn)基因小麥進(jìn)行WDV接種試驗。將已在WDV毒源上飼毒5天的條沙葉蟬接種轉(zhuǎn)基因小麥植株、對照小麥感病品種揚(yáng)麥158和抗病品種小偃22。每株接種帶毒(WDV)條沙葉蟬10-20頭，待條沙葉蟬在麥苗上取食5天后，用殺蟲劑把條沙葉蟬殺死，接種25天后觀察記錄發(fā)病情況。步驟二、接種后的發(fā)病級別調(diào)查按照小麥黃矮病國內(nèi)11級法，調(diào)查病情級別，按0-3級的方法統(tǒng)計發(fā)病情況，以一個株系為例。發(fā)現(xiàn)接種的四個載體的T2代轉(zhuǎn)基因小麥中，干涉載體的小麥抗病性好。干擾載體的T2代轉(zhuǎn)基因小麥的接種試驗表明獲得了干擾載體的8個抗病性株系pSA-3、6、7、
1012、15、17、35、57。病情的嚴(yán)重度平均為3級以下(即抗病)。目前已對轉(zhuǎn)基因再生植株T2 代進(jìn)行了鑒定，篩選到了高抗BYDV的植株。由于WDV于2007年有本實驗是報道在我國首次發(fā)現(xiàn)，因此關(guān)于它的病情級別的劃分只鑒于本實驗室與西北農(nóng)林科技大學(xué)所做的WDV抗病品種的調(diào)查，建議目前WDV的級別劃分如下0級不發(fā)??；1級中感，矮化分蘗少；2級感病，嚴(yán)重矮化分蘗多。發(fā)現(xiàn)接種的四個載體的T2代轉(zhuǎn)基因小麥中，干涉載體的小麥抗病性好。干擾載體的T2代轉(zhuǎn)基因小麥的接種WDV試驗表明獲得了干擾載體的6個抗病性株系pSA-7、12、15、17、35、57。綜上所述，目前，我們已經(jīng)獲得了獲得對大麥黃矮病毒GVA和小麥矮縮病毒具有雙重抗性的轉(zhuǎn)基因再生小麥植株共4個株系。其中pSA-12、15、17、57等4個株系抗性最好?？共⌒怨δ軝z測結(jié)果見圖10所示。
權(quán)利要求
1.雙抗大麥黃矮病毒和小麥矮縮病毒的RNA干涉載體，包括骨架載體和含有正、反義鏈的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其特征在于以SEQ ID N013所示的BW-CP基因序列作為正、反義鏈。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的RNA干涉載體，所述骨架載體為pMCG161。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的RNA干涉載體，所述BW-CP基因的正義鏈插入pMCG161中上游的兩個酶切位點(diǎn)AsCI、AvrII間，BW-CP基因的反義鏈插入pMCG161中下游的兩個酶切位點(diǎn) SpeI、SgfI 間。
4.權(quán)利要求3所述的RNA干涉載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟(1)以感染大麥黃矮病毒小麥總DNA為模板，以SEQID NOl和SEQ ID N02為引物對， 經(jīng) RT-PCR 擴(kuò)增 BYDV-GAV-CP，得到 PCR 產(chǎn)物 I，所述 SEQ ID NOl (BYDV-GAV-CP) 5，-ATGAATTCAGTAGGCCGTAGA-3，，所述 SEQ ID N02 (BYDV-GAV-CP) 5，-CTATTTGGGAGTCATGTTGGC-3，，(2)以感染小麥矮縮病毒小麥總DNA為模板，以SEQID N03和SEQ ID N04為引物對， 經(jīng)PCR擴(kuò)增WDV-CP，得到PCR產(chǎn)物11，所述 SEQ ID N03 (WDV-CP) 5' -ATGGTGACCAACAAGGACTCCC-3，，所述 SEQ ID N04 (WDV-CP) 5，-TTACTGAATGCCGATGGCTTTG-3，，(3)以PCR產(chǎn)物I和II的1 1混合物為模板，以SEQ ID N05和SEQ ID N06為引物對，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物III，目的片段為138;3bp，回收PCR產(chǎn)物III，與pMD18_T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 5 α，得到陽性質(zhì)粒pMD18-T-BW-CP，SEQ ID Ν05 =Bff-CP :5’ -GCCAACATGACTCCCAAATAGATGGTGACCAACAAGGACTCCC-3’，SEQ ID Ν06 =Bff-CP :5’ -GGGAGTCCTTGTTGGTCACCATCTATTTGGGAGTCATGTTGGC-3，，(4)以陽性質(zhì)粒pMD18-T-BW-CP為模板，以SEQID Ν07和SEQ ID Ν08為引物對，經(jīng)PCR 擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物IV，回收目的片段，與pMDIS-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α得到陽性質(zhì)粒pMD18-T-BW-CP+，用AscI、AvrI雙酶切陽性質(zhì)粒和載體pMCG161，再用T4DNA連接酶將正義鏈片段和載體連接，得到正義鏈載體PMCG161+BW ；SEQ ID NO. 7 =Bff-CP+ :5’ -ATGGCGCGCCATGAATTCAGTAGGCCGTAGA-3’，SEQ ID NO. 8 =Bff-CP+ :5’ -ATCCTAGGTTACTGAATGCCGATGGCTTTG-3，，(5)以陽性質(zhì)粒pMD18-T-BW-CP為模板，以SEQID N09和SEQ ID NOlO為引物對，經(jīng) PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物V，回收目的片段，與pMDIS-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α得到陽性質(zhì)粒 PMD18-T-BW-CP-，用 SpeI、SgfI 雙酶切陽性質(zhì)粒 pMD18-T-BW_CP-和 pMCG161+BW， 再用T4DNA連接酶將反義鏈片段和載體連接，得到干擾載體PMCG161+/-BW ；SEQ ID N09 =Bff-CP- :5，-ATGCGATCGC TTACTGAATGCCGATGGCTTTG _3，，SEQ ID NO 10 =Bff-CP- :5，-ATACTAGT ATGAATTCAGTAGGCCGTAGA -3，。
5.權(quán)利要求4所述的方法，所述步驟(5)由下列方法代替以陽性質(zhì)粒PMD18-T-BW-CP為模板，以SEQ ID N09和SEQ ID NOlO為引物對，經(jīng)PCR 擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物V，回收目的片段，與pMDIS-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α得到陽性質(zhì)粒 PMD18-T-BW-CP-，用 Spel、SgfI 雙酶切 pMD18_T-BW_CP-陽性質(zhì)粒和載體 pMCG161，用 T4DNA連接酶將反義鏈片段和酶切后的載體pMCG161連接，得到反義鏈載體pMCG161_BW，再用AscI、AvrI雙酶切雙酶切陽性質(zhì)粒和反義鏈載體，用T4 DNA連接酶將正義鏈片段和酶切后的反義鏈載體連接，得到干擾載體PMCG161+/-BW，SEQ ID N09 Bff-CP- :5，-ATGCGATCGC TTACTGAATGCCGATGGCTTTG -3，， SEQ ID NOlO =Bff-CP- :5，-ATACTAGT ATGAATTCAGTAGGCCGTAGA -3，。
6.權(quán)利要求1-3任一所述的RNA干涉載體在遺傳轉(zhuǎn)化單子葉植物中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求6所述應(yīng)用，是將權(quán)利要求1-3任一所述的RNA干涉載體轉(zhuǎn)化有關(guān)單子葉受體植物，使之對大麥黃矮病毒和小麥矮縮病毒產(chǎn)生抗性。
8.權(quán)利要求7所述應(yīng)用，所述轉(zhuǎn)化的方法為基因槍法。
9.權(quán)利要求8所述應(yīng)用，所述受體植物為禾本科植物。
10.權(quán)利要求9所述應(yīng)用，所述禾本科植物為小麥。
全文摘要
本發(fā)明涉及“雙抗大麥黃矮病毒和小麥矮縮病毒的RNA干涉載體、構(gòu)建方法及在小麥遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用”，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。該表達(dá)載體采用的骨架載體是pMCG161，在其上游的兩個酶切位點(diǎn)AscI、AvrII間插入BW-CP基因的正義鏈，在下游的兩個酶切位點(diǎn)SpeI、SgfI間插入BW-CP基因的反義鏈，通過載體上的intron形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，適合基因槍轉(zhuǎn)化單子葉植物，可獲得抗BYDV-GAV和WDV的轉(zhuǎn)基因后代。通過基因槍法將其轉(zhuǎn)入小麥中，獲得對大麥黃矮病毒GVA和小麥矮縮病毒具有雙重抗性的轉(zhuǎn)基因小麥品種。本發(fā)明為植物抗病育種提供了一種高效的育種途徑和新的策略。
文檔編號A01H5/00GK102154354SQ201010619909
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月31日
發(fā)明者劉艷, 吳蓓蕾, 龐俊蘭, 李莉, 王錫鋒 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所