專利名稱：用于增加植物穗軸中的淀粉含量的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物分子生物學，特別地涉及用于增加植物穗軸中的淀粉積累的方法和組合物及這些植物組織在商業(yè)應用中的用途。
背景技術：
植物生物質由糖構成，并且代表地球上可再生碳氫化合物的最大來源。與其它可再生能源不同，生物質可以直接轉化成液體燃料。兩種最常見的生物燃料類型是乙醇(乙基醇)和生物柴油。乙醇是一種醇，其可以通過發(fā)酵碳水化合物高的任何生物質(淀粉、糖、 或纖維素)來生成。一旦自生物質材料獲得可發(fā)酵糖，便可以使這些糖發(fā)酵以經由與釀造啤酒相似的方法來生成乙醇。然而，此巨大的資源由于糖被鎖在復雜的聚合物(其經常統(tǒng)稱為木質纖維素)中的實情而利用不足。將木質纖維素常規(guī)分解成單體(單糖)需要經由化學和/或物理預處理來使生物質來源材料軟化。也可以添加酶，其將生物質中含有的聚合形式的糖水解成單糖。然后，可以利用6-碳和5-碳糖兩者來實施隨后的發(fā)酵以生成乙醇或其它期望的生物產物。自植物生物質的降解生成的糖可以為發(fā)酵成化學品、塑料、飼料添加劑和燃料提供豐富的、有經濟競爭力的給料。碳水化合物構成地球上最豐富的有機化合物。它們主要在植物中作為纖維素或淀粉形式的復雜葡萄糖聚合物找到。纖維素、半纖維素和葡聚糖構成植物細胞壁和木質組織的許多結構組分。這些結構組分經常與其它分子，諸如蛋白質、脂肪和木質素復合。淀粉作為種子和谷物中的主要貯存碳水化合物被植物利用，所述種子和谷?；旧嫌杉兊倪B接的葡萄糖聚合物組成。在許多谷物中以及在塊莖和根中找到淀粉。淀粉由于如下的實情而成為一種期望的貯存碳水化合物，即它組成簡單，而且可以被植物容易地分解以得到能量。比較而言，木質纖維素材料由與木質素復合的葡萄糖和/或數(shù)種不同的糖構成。淀粉經由有效且便宜的淀粉水解酶而可容易地水解成單體糖，而木質纖維素材料即不可容易地水解， 也不能相對便宜地加工。碳水化合物還以簡單的二糖蔗糖形式豐富地找到?？梢栽谥T如甘蔗、甜菜、和甜高梁等作物中找到蔗糖。與蔗糖不同，淀粉是穩(wěn)定的，而且可以以脫水形式貯存一段很長的時間。植物穗軸主要由木質纖維素組成，并且一般在大多數(shù)農業(yè)實踐中作為廢物丟棄。 例如，收獲玉米的聯(lián)合收割機首先對穗軸剝去其仁，然后將剝掉的穗軸作為廢物釋放回耕地中。玉米穗軸構成地上玉米植物總生物質的約15-18%。隨著目前的玉米價格上漲，玉米的供應已經非常有限，而且已經有從不太昂貴的非食物來源或廢產物生產燃料的動力。目前，美國每年生產約86億加侖乙醇，其中大多數(shù)乙醇源自玉米淀粉。已經預測到穗軸的纖維素發(fā)酵可以使美國的乙醇總產量增加額外的50億加侖乙醇。其它評估預測在發(fā)酵中使用玉米穗軸可以將玉米乙醇總產率提高每蒲式耳11%或每英畝27%。然而，將穗軸發(fā)酵成燃料受限于成本和不太有效的方法。目前的穗軸發(fā)酵實踐需要用幫助分解穗軸的木質纖維素和纖維結構的酶混合物來預處理穗軸。也可以采用熱化學條件以幫助分解穗軸(例如高熱、堿性PH，等等)。在預處理后，然后從經處理的穗軸提取糖，并且在一些情況中，可以添加額外的酶以將糖進一步降解成更小的糖。然后，經由酵母發(fā)酵來將這些糖轉化成乙醇。已經評估了目前的穗軸發(fā)酵成本比商業(yè)玉米淀粉乙醇發(fā)酵每生產一加侖多約1美元。穗軸的結構木質纖維素組成對目前的穗軸發(fā)酵實踐造成數(shù)項限制。目前的穗軸發(fā)酵實踐的一項限制可以是對用于自穗軸提取糖的預處理方法的需要可能是昂貴且適時的(timely)。目前的穗軸發(fā)酵實踐的另一項限制可以是需要提取合適的糖或者實施酶處理以將復合糖進一步降解成單糖，其可以被酵母容易地轉化成乙醇。還可以有必要尋找或創(chuàng)建最佳的酵母菌株， 其能夠利用源自預處理和酶水解的特定糖譜。另一項限制可以是自穗軸提取糖的方法由于木質纖維素的密集結構而導致效率低。會期望生成在生產單體糖中有益的穗軸組織，其中較高比例的碳水化合物為淀粉形式。提供了用于創(chuàng)建富含淀粉的穗軸生物質的方法和用于自穗軸生物質生成游離的糖和寡糖的方法以及這些游離糖在生產化學品、塑料、飼料添加劑和燃料中的用途。發(fā)明概述提供了用于增加植物的穗軸組織中的淀粉含量的組合物和方法。進一步提供了如下的方法，其中含有增加量的淀粉的穗軸可以在生物質轉化法中以及在動物飼料應用中使用。該方法牽涉獨立地或共同地下調植物暫時性淀粉降解途徑中涉及的酶的內源活性?？梢员榧罢麄€植物或在優(yōu)選的靶組織(例如莖、葉、穗軸等)內組成性靶向下調。本發(fā)明的轉基因植物在穗軸組織中具有增加的淀粉含量。本文中所描述的方法在提高植物穗軸組織在生產生物燃料和動物飼料應用的用途中的價值方面可以是有益的?？梢赞D化自這些轉基因植物獲得的穗軸以生成水平升高的游離糖，其在將游離糖下游發(fā)酵成化學品、塑料、飼料添加劑和燃料中是有用的。還提供了生成具有增加的淀粉含量的自身加工穗軸的方法，其中植物或植物部分表達加工酶(例如alpha-淀粉酶、葡糖淀粉酶、纖維素酶、CBHI，等等)，其中將加工酶靶定得遠離其相對底物，而且在活化(例如碾磨、加水、PH、溫度調節(jié))加工酶 (嗜溫性、嗜熱性、或超嗜熱性)后，植物或植物部分能夠自身加工其起作用的底物以獲得期望的結果。發(fā)明詳述概述冠詞“一個”和“一種”在本文中用于指一個/種或超過一個/種(即至少一個/ 種)該冠詞的語法對象。舉例而言，“一個/種元件”指一個/種或多個/種元件。遍及說明書，詞“包含”或變型應當理解為暗示包括規(guī)定的元件、整數(shù)或步驟，或元件、整數(shù)或步驟的組，但是不排除任何其它元件、整數(shù)或步驟，或元件、整數(shù)或步驟的組。提供了用于增加植物的穗軸組織中的淀粉含量的方法和組合物。該方法包括下調植物中的短暫性淀粉降解途徑中涉及的酶的活性。本發(fā)明所得的轉基因植物在穗軸組織中具有增加的淀粉含量。進一步提供了在穗軸組織中具有增加的淀粉含量的植物的使用方法。提供了轉基因植物、種子、植物組織和植物部分。認可的是，可以通過使用組成性、 組織、時間或化學調節(jié)性啟動子來控制該過程?？梢栽趩巫尤~植物的穗軸和單子葉或雙子葉植物中找到的類似結構中實施以下實施方案。一種增加穗軸組織中的淀粉的方法在多個產業(yè)(例如但不限于乙醇、動物飼料、 塑料、化學品和其它工業(yè)應用)間可以是期望的。目前的應用的一個實施方案涉及操作植物以下調短暫性淀粉降解途徑中涉及的一種或多種葉綠體或胞質酶(在本文中稱為“淀粉降解酶”)的活性。本發(fā)明所得的植物在穗軸組織中具有增加的淀粉含量。淀粉降解酶包括但不限于alpha-淀粉酶、葡聚糖水雙激酶、磷酸葡聚糖水雙激酶、極限糊精酶、異淀粉酶、 beta-淀粉酶、葡聚糖磷酸化酶、歧化酶、葉綠體麥芽糖轉運蛋白、葉綠體葡萄糖轉運蛋白、 葉綠體丙糖磷酸轉運蛋白、胞質轉葡糖苷酶、葡聚糖磷酸化酶、磷酸葡聚糖磷酸酶(淀粉過量4)和己糖激酶。本發(fā)明的方法在整合目前用于栽培作物植物的實踐以獲得在作物植物的穗軸組織中具有增加的淀粉積累的商業(yè)上期望的植物材料，及作物植物穗軸作為用于生產可發(fā)酵糖的生物質來源或用于農業(yè)和/或人消耗的用途中得到應用。經修飾的植物和植物部分可以在醇的生產中使用，并通過工程化改造植物穗軸以積累淀粉來產生增加的乙醇。如本文中所使用的，“作物植物”指為了生成植物材料而栽培的任何植物，所述植物材料是人或動物為了食用，或為了在工業(yè)、醫(yī)藥、或商業(yè)過程中利用而尋找的。本發(fā)明可以適用于任何品種的植物，包括但不限于玉米、小麥、稻、大麥、大豆、棉、高粱、一般的豆、 油菜/蕓苔、苜蓿、亞麻、向日葵、紅花、黍/粟(millet)、黑麥、甘蔗、甜菜、可可(cocoa)、 茶、熱帶甜菜、蕓苔屬(Brassica)、棉、咖啡、甘薯、亞麻、花生、三葉草(clover)；蔬菜諸如萵苣、番茄、葫蘆、木薯、馬鈴薯、胡蘿卜、蘿卜、豌豆、小扁豆、甘藍、花椰菜、花莖甘藍 (broccoli)、孢子甘藍、胡椒、和鳳梨；樹果實諸如柑橘、蘋果、梨、桃、杏、胡桃、鱷梨、香蕉、 和椰子；和花諸如蘭花、香石竹(carnation)和薔薇/玫瑰?？捎糜趯嵤┍景l(fā)明的其它植物包括多年生草，諸如柳枝稷、北美草原草(prairie grass)、印第安草andiangrass)、大須芒草(Big bluestem grass)、芒(miscanthus)等。認可可以使用植物的混合物。如本文中所使用的，術語“能源作物”指可有利于在生物質轉化法中在將植物生物質轉化成燃料方面使用的作物。此組包括但不限于甘蔗、甜菜、高粱、柳枝稷、芒、小麥、稻、 燕麥、大麥和玉米。如本文中所使用的，術語“植物部分”或“植物組織”包括植物細胞、植物原生質體、可以使植物再生的植物細胞組織培養(yǎng)物、植物愈傷組織、植物塊、和植物或植物部分諸如胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果實、仁、穗、穗軸、外皮、莖、根、根尖、花藥，等等中完整的植物細胞。在一個實施方案中，植物是不確定的植物。在溫帶地區(qū)，這些品種無限期地營養(yǎng)生長。不確定的植物可以工程化改造為在穗軸組織中積累淀粉，并且可以在初霜前一直種植。 在那時，可以讓植物變干，收獲干的，并用于食物、家畜飼料、或在生物質轉化法中使用。如本文中所使用的，“生物質”指包括感興趣的產物的有用的生物學材料，該材料要進行收集，并意圖進一步加工以分離或濃縮感興趣的產物?！吧镔|”可以包含果實或其部分或種子、葉、或莖、穗軸或根，其中這些是對于產業(yè)目的而言特別感興趣的植物部分。 “生物質”在其指植物材料時包括植物中含有或呈現(xiàn)感興趣的產物的任何一種或多種結構。穗軸淀粉積累的增加例如在通過青貯(silage)或干燥來保藏的穗軸組織中可以是期望的。在一個實施方案中，青貯具有增加的穗軸淀粉的植物可以是有益的。在另一個實施方案中，工程化改造具有增加的穗軸淀粉和增加的綠色組織淀粉兩者的植物諸如記載于美國公開文本US 2009/0119800-A1 (通過提及而將其收入本文)的植物及在青貯飼料中使用所述植物可以是有益的。在另一個實施方案中，生成所述具有增加的穗軸淀粉的植物可以是有益的，其中已經將植物工程化改造成表達肌醇六磷酸酶或者已經用肌醇六磷酸酶處理。在另一個實施方案中，生成另外被工程化改造成表達淀粉酶的所述工程化改造成表達肌醇六磷酸酶或者用肌醇六磷酸酶處理的植物可以是期望。如本文中所使用的，術語“淀粉酶”涵蓋具有α -淀粉酶活性的酶(例如Ε. C. 3. 2. 1. 1類)，例如能夠水解多糖中的內部α-1，4_葡聚糖連接的α-淀粉酶，包括能夠在堿性ρΗ或在酸性ρΗ將淀粉水解成糖的淀粉酶酶。這些酶也已經被描述為那些實現(xiàn)對含有1，4-α-連接的D-葡萄糖單元的多糖中的l，4-a_D-葡糖苷連接的外水解或內水解的。用于描述這些酶的另一個術語是“糖原酶”。美國專利公開文本2003/0125534和美國專利公開文本2004/0018607 (通過提及而將這兩篇收入本文)描述了可以在本發(fā)明的多個實施方案中使用的多種α-淀粉酶酶。在美國專利公開文本No. 2003/0135885 (通過提及而將其完整收入本文)中還提供了用于生成并使用表達α-淀粉酶酶的生物體(例如以生成供生產乙醇用的可發(fā)酵底物)的方法。如本文中所定義的，術語“收獲指數(shù)”指收獲時的生物質產率與累積的生物質的比率。目前的兩種最好的能源作物，即甘蔗和甜菜就收獲指數(shù)而言在貯存穩(wěn)定性方面具有限制，而且在收獲時具有高含水量。高含水量具有數(shù)項缺點，諸如收獲的運輸成本較高，因為需要與作物一起移動較高比例的水。貯存穩(wěn)定性是一項重要的問題，因為可以有持續(xù)的代謝，或微生物污染，其可以導致作物酸敗和糖損失。作物的腐敗性在這些類型的農業(yè)產品的移動、貯存、 和利用方面具有非常不同的基礎設施牽連。淀粉含量的增加會導致干物質和貯存穩(wěn)定性的相當大的升高。本申請的一個實施方案提供了一種用于提高植物穗軸組織中的淀粉水平的方法， 包括將表達盒插入包含多核苷酸的植物細胞中，其中所述多核苷酸序列的表達降低或抑制一種或多種選自下組的淀粉降解酶的活性alpha-淀粉酶、葡聚糖水雙激酶、磷酸葡聚糖水雙激酶、極限糊精酶、異淀粉酶、beta-淀粉酶、葉綠體葡聚糖磷酸化酶、歧化酶、葉綠體麥芽糖轉運蛋白(Mexl)、磷酸葡聚糖磷酸酶(淀粉過量4)、葉綠體葡萄糖轉運蛋白、和葉綠體丙糖磷酸轉運蛋白。自包含表達盒的植物細胞再生轉基因植物，其中所述多核苷酸序列的表達降低或抑制一種或多種淀粉降解酶的活性。優(yōu)選地，所述多核苷酸會與可操作的穗軸組織優(yōu)選性啟動子，諸如但不限于稻(Oryza sativa)MADS框(OsMADS)啟動子，諸如記載于公開文本US 2007/0006344(通過提及而將其收入本文)的啟動子連接。所得的穗軸會具有水平升高的淀粉，如此具有更高的收獲指數(shù)和商業(yè)價值。在一個優(yōu)選的實施方案中，淀粉降解酶與0sMADS13啟動子(GenBank登錄號AF151693)可操作連接。“可操作連接”指各核酸序列在單一核酸片段上的聯(lián)合，使得一個的功能受到另一個影響。例如，啟動子在其能夠影響編碼序列或功能性RNA表達時(S卩，編碼序列或功能性 RNA在啟動子的轉錄控制下)與所述編碼序列或功能性RNA可操作連接。有義或反義取向的編碼序列可以與調節(jié)序列可操作連接。在一些實施方案中，目前公開的主題涉及一種表達盒，其包含5’ -調節(jié)序列和與所述5’ -調節(jié)序列可操作連接的核酸分子，其中所述核酸分子對于5’ -調節(jié)序列而言是異源的，且其中所述核酸分子的表達產物靶定于植物的穗軸組織。5’ -調節(jié)序列包含下列區(qū)域啟動子、第一外顯子、第一內含子、第二外顯子的5’部分，其中已經工程化改造所述 5’-調節(jié)序列以在所述5’-調節(jié)序列的3’端包括翻譯起始密碼子，而在所述翻譯起始密碼子的上游不含其它翻譯起始密碼子。目前公開的主題進一步涉及一種表達盒，其中所述第二外顯子的5’部分包含來自外顯子5’端的前15個核苷酸和Kozak序列。在一些實施方案中，目前公開的主題提供了一種表達盒，其包含與異源基因可操作連接的SEQ ID NO :8。在一方面，表達盒包含5’ -調節(jié)序列和與5’ -調節(jié)序列可操作連接的核酸分子，其中所述核酸分子對于5’ -調節(jié)序列而言是異源的。5’ -調節(jié)序列可以包含下列區(qū)域啟動子、第一外顯子、第一內含子、和第二外顯子的5’部分。工程化改造 5’ -調節(jié)序列以在其3’端包括翻譯起始密碼子，而在所述翻譯起始密碼子的上游不含其它翻譯起始密碼子。如本文所使用的，術語“部分”可以指具有期望長度的來自內含子或外顯子，諸如來自外顯子2的5’端的序列，如可以通過本文中所提供的指導(包括下文實施例)來確定的。作為例子而非限制，所述盒中包括的第二外顯子的5’部分可以包括來自外顯子5’端的前15個核苷酸。核酸分子的表達產物可以靶定植物的穗軸組織。美國申請 No. 2007/0006344(通過提及而將其收入本文)中第一次披露了表達盒設計。淀粉生物合成和降解淀粉是自然界中生成的最豐富的聚合物之一，并且在整個植物界中作為貯存碳水化合物合成。在貯存器官中，它充當長期的碳儲備物，而在有光合能力的組織中，它被短暫積累以在對光合作用不利的期間提供降低的碳和能量兩者。淀粉由于其與纖維素材料相比在組成上簡單而成為一種期望的貯存碳水化合物。纖維素材料包含與木質素復合的數(shù)種不同糖。木質纖維素非常難以用酶分解。相反，淀粉由葡萄糖組成，并且經由有效且便宜的淀粉水解酶而可容易地水解成單體糖。植物穗軸組織中的淀粉積累會在植物生物質中提供單糖的豐富來源。綠色組織中的淀粉降解涉及多種酶和轉運蛋白。短暫性淀粉在葉綠體基質中經由淀粉降解酶的作用而基本上被轉化成葡萄糖、麥芽糖和丙糖磷酸。然后，這些糖經由糖轉運蛋白而從葉綠體基質轉運到胞質溶膠。一旦在胞質溶膠中，便會在植物細胞代謝中利用這些單糖。先前的研究聚焦于將葉綠體基質內的關鍵的淀粉降解酶和轉運蛋白阻抑或失活以在綠色組織內積累淀粉。令人驚訝地，已經發(fā)現(xiàn)了下調穗軸中的淀粉降解酶導致穗軸中的淀粉增加。植物經由OsMAD啟動子的潛在的泄漏表達還在其綠色組織中展現(xiàn)出淀粉過量表型?！靶孤币鉃閱幼涌梢詢?yōu)選地指導基因在一種組織類型中表達，而非優(yōu)選地較小程度地指導基因在第二種組織中表達。本領域中已知的是，許多啟動子展現(xiàn)出此類表達譜，其中基因表達針對特定組織，但是可以在其它組織類型中在較小程度上表達基因。玉米“穗軸優(yōu)先性啟動子”指優(yōu)選對玉米植物的穗軸指導基因表達，并且隨后可以在其它玉米植物組織中在較小或相等程度上表達或不表達相同基因的任何啟動子。在一個實施方案中，可以期望使用組成性啟動子，其中在整個植物中組成性下調淀粉降解酶。淀粉包含線性(直鏈淀粉)和分枝(支鏈淀粉)葡萄糖聚合物兩者。來自許多， 但是不是所有植物來源的支鏈淀粉含有磷酸單酯，其主要與糖基殘基的C6和C3位置連接。 然而，僅最近才已經闡明了淀粉磷酸化的生物化學機制。轉基因馬鈴薯植物(Lorberth等 (1998) Nat Biotechnol. 16(5) :473-7)和擬南芥屬(Arabidobsis)的 sexl 突變體(Yu 等 (2001)Plant Cell 13 (8) :1907-18)缺乏淀粉有關的蛋白質(其在本文中稱為Rl)，并且它們合成具有降低的磷酸酯含量的淀粉。自馬鈴薯純化的重組Rl-蛋白能夠使α-葡聚糖磷酸化(Ritte 等 Q002)Proc Natl Acad Sci U S A 99(10) :7166-71)。它催化雙激酶型反應，釋放ATP的Y-磷酸(導致正磷酸的釋放)，但是使用β-磷酸來使聚葡聚糖的葡糖基殘基磷酸化。由于此活性，認為蛋白質是葡聚糖水雙激酶(GWD) (Ritte等OO(^)Planta 216(5) :798-801)。在轉基因馬鈴薯植物中抑制編碼來自馬鈴薯的Rl蛋白的Rl基因導致可以自馬鈴薯塊莖分離的淀粉的磷酸含量降低(Lorberth等)。此外，Lorberth等顯示了來自馬鈴薯(Solanum tuberosum)的Rl蛋白能夠使細菌糖原磷酸化，若相應的Rl cDNA在大腸桿菌(E.coli)中表達的話(Lorberth 等，Nature Biotech. 16，(1998)，473-477)。Ritte 等 (Plant J. 21，(2000)，387-391)顯示了來自馬鈴薯的Rl蛋白可逆地結合馬鈴薯植物中的淀粉粒，其中對淀粉粒的結合強度取決于植物的代謝狀態(tài)。在淀粉粒結合形式中，馬鈴薯植物中的蛋白質主要存在于黑暗中保持的葉中。然而，在對葉照明后，蛋白質主要以不結合淀粉粒的可溶性形式存在。淀粉的磷酸化強烈地影響其體內降解性。此活性以GWD缺陷型馬鈴薯或擬南芥植物的葉中觀察到的淀粉過量表型指示(Lorberth等，1998，見上文；Yu等，2001，見上文)。 Rl蛋白及其同系物在植物或植物細胞中的表達和/或活性的降低導致此淀粉過量表型，這意味著缺乏Rl活性的植物不再能夠動員其光合或貯存組織中合成的淀粉(短暫性淀粉)。 因此，這些植物顯示淀粉在其綠色組織中的積累。“綠色組織”意指植物中的所有綠色結構， 包括葉、莖、和未成熟的果實。令人驚訝地，已經發(fā)現(xiàn)了下調穗軸中的淀粉降解酶導致穗軸組織中的淀粉積累?？梢詼y定此淀粉過量特性，例如如記載于美國專利申請公開文本 No. 2006/0236426的，通過提及而將其收入本文。具體地，將植物的來源葉在黑暗中保持不同時間間隔，然后用碘染色以測定其淀粉含量。在黑暗中不能動員短暫性淀粉的植物葉顯示藍色染色，或者與可以在相應的野生型植物的葉中發(fā)生的染色相比，這些葉中的藍色染色更強或者染色在黑暗中更長的時間間隔后是明顯的?？梢孕揎椣嗨频姆椒ㄒ詼y量穗軸組織中的淀粉積累。此外，也可以通過酶法測定淀粉含量來測試穗軸組織中的短暫性淀粉的積累。這可以例如如Muller-Rober等(EMBO J. 11 (1992),1229-1238)中所描述的那樣完成。在與相應的野生型植物的穗軸組織相比時，一種或多種淀粉降解酶的活性被降低的植物的穗軸組織優(yōu)選地具有增加至少約50 %、至少約75 %、至少約100 %、至少約150 %、至少約200 %、 至少約250%、至少約300%、至少約350%、至少約400%、至少600%、或更大的淀粉含量。對淀粉降解酶活性的抑制在本發(fā)明的方法和組合物中，在淀粉降解酶或其同系物的活性受到下調的植物的穗軸組織中發(fā)生淀粉積累。通過下調活性，與尚未進行操作以降低淀粉降解酶活性的相應的對照植物中的活性相比，植物中的淀粉降解蛋白或酶的活性水平被降低或完全阻抑。若活性小于95 %、小于約90 %、小于約80 %、小于約70 %、小于約60 %、小于約50 %、小于約 40%、小于約30%、小于約20%、小于約10%，或者比不是突變體或者尚未進行遺傳修飾以抑制淀粉降解酶表達的植物中的淀粉降解酶活性小100%，則淀粉降解酶，即靶蛋白的活性受到抑制、降低、或消除?？梢酝ㄟ^測量植物穗軸組織中的淀粉含量來測量淀粉降解酶的活性。用于測量淀粉含量的方法在本領域中可獲得。參見例如Yu等QOODThe Plant Cell 13:1907-1918?？梢酝ㄟ^例如在 Ritte 等 Q002)Proc. Natl. Acad, ki USA 14:7166-7171 中所列的方法來測量Rl酶活性。同樣地，可以通過表明植物中的淀粉降解酶減少的免疫印
10跡，通過Western印跡分析等來直接測量淀粉降解酶的表達水平。可以在本發(fā)明方法的實施中使用降低植物中的淀粉降解酶的活性的任何方法。例如，可以通過將抑制Rl蛋白水平或活性的多核苷酸導入植物中來降低或消除Rl蛋白的活性和/或水平。多核苷酸可以抑制信使RNA的表達或翻譯。同樣地，可以通過用編碼多肽的核酸序列轉化植物來實現(xiàn)下調，所述多肽抑制淀粉降解酶的轉錄或翻譯，或者抑制淀粉降解酶的活性。如本文中所使用的，術語“抑制”、“下調”指靶基因產物的表達或功能的任何降低， 包括表達或功能的任何相對減少，直至且包括完全消除靶基因產物的表達或功能。如本文中所使用的，術語“表達”在基因產物的語境中指所述基因產物的生物合成，包括基因產物的轉錄和/或翻譯和/或裝配。抑制靶基因產物(即感興趣的基因產物)的表達或功能可以在任何兩種植物間的比較的語境中，例如經遺傳改變的植物中的靶基因產物的表達或功能對相應的野生型植物中的所述靶基因產物的表達或功能?；蛘撸种瓢谢虍a物的表達或功能可以在同一植物內或植物間的植物細胞、細胞器、器官、組織、至植物部分間的比較的語境中，并且包括同一植物內或植物間的發(fā)育或時間階段間的比較。用于抑制或消除植物中的基因表達的方法是本領域中公知的，并且可以在本發(fā)明的方法中使用任何此類方法?？梢岳弥辽倥c靶序列的信使RNA (mRNA)的一部分互補的反義構建體。構建反義核苷酸以與相應的mRNA雜交?？梢赃M行反義序列的修飾，只要該序列與相應的mRNA雜交，并干擾相應的mRNA的表達。如此，可以使用與相應的有義序列具有至少約70%、至少約80%、至少約85%或更高序列同一性的反義構建體。此外，可以使用反義核苷酸的一部分來破壞靶基因的表達。一般地，可以使用至少約10個核苷酸、至少約20 個核苷酸、至少約30個核苷酸、至少約40個核苷酸、至少約50個核苷酸、至少約100個核苷酸、至少約200個核苷酸、至少約300個核苷酸、至少約400個核苷酸、至少約450個核苷酸、至少約500個核苷酸、至少約550、或更大的序列。反義方法是本領域中已知的，參見例如 Sheehy 等(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :8805-8809 ；及美國專利 No. 5，107, 065 ； 5，453，566 ；及5，759，829)；通過提及而將其收入本文。也可以使用共阻抑來阻抑靶基因的表達。如此，以有義的取向在感興趣的植物中表達異源淀粉降解酶序列以阻抑內源淀粉降解酶基因在植物中的表達。用于共阻抑的方法是本領域中已知的。參見例如 Taylor(1997)Plant Cell 9 :1245 Jorgensen(1990) Trends Biotech. 8(12) :340-344 Jorgensen 等(1996)Plant Mol. Biol. 31 :957-973 ； Johansen 禾口 Carrington(2001)Plant Physiol. 126 :930-938 ；Broin 等(2002)Plant Cell 14 :1417-1432 ;Stoutjesdijk 等(2002)Plant Physiol. 129 :1723—1731 ;Yu 等 (2003)Phytochemistry 63 :753-763 ；Flavell (1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 3490-3496 ;Finnegan 等(1994)Bio/technology 12 :883-888 ;Neuhuber 等(1994)Mol. Gen. Genet. 244 :230-241 ；及美國專利 No. 5，034，323，5，283，184，及 5，942，657 ；通過提及而將它們均收入本文。共阻抑涉及用包含驅動植物中的表達的啟動子的DNA構建體轉化植物，所述啟動子至少與多核苷酸的一部分可操作連接，所述多核苷酸對應于感興趣的基因或靶基因的轉錄物。將核苷酸序列構建或選擇為與內源基因的轉錄物的序列具有實質序列同一性，通常大于約60%序列同一性，更通常大于約80%序列同一性，更通常大于約90%序列同一性，且在一些情況中大于約95%序列同一性。也可以使用RNA干擾(RNAi)來下調淀粉降解酶基因。一般地，參見Napoli等 (1990)Plant Cell 2 :279-289 ；美國專利 No. 5，034，323 ；Sharp(1999)Genes Dev.13 139-141 ；Zamore 等 O000)Cell 101 :25-33 ；及 Montgomery 等(1998)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:15502-15507。在RNAi中，可以使用長的雙鏈RNA(dsRNA)(通常大于200個核苷酸)來使植物中的靶基因表達沉默。在導入后，長的dsRNA進入細胞途徑，其通常稱為 RNA干擾(RNAi)途徑。首先，RNA酶III樣酶將dsRNA加工成20-25個核苷酸(nt)的小干擾RNA(siRNA)。這些siRNA裝配成稱為RNA誘導的沉默復合物(RISC)的含有內切核糖核酸酶的復合物，在該過程中解旋。隨后，siRNA鏈將RISC引導至互補的RNA分子，在那里它們切割并破壞關聯(lián)的RNA。在被siRNA鏈結合的區(qū)域的中間附近發(fā)生對關聯(lián)RNA的切割。如此，可以使用雙鏈RNA(dsRNA)干擾。對于dsRNA干擾，可以在同一細胞中表達有義RNA分子和與有義RNA分子完全或部分互補的反義RNA分子，導致對相應的內源信使 RNA的表達的抑制?？梢詮膯我换虿煌磉_盒表達有義和反義分子。或者，然后篩選用一種或多種 dsRNA干擾表達盒轉化的多個植物品系以鑒定對淀粉降解酶表達顯示最大抑制的植物品系。使用dsRNA干擾來抑制內源植物基因表達的方法記載于Waterhouse等(1998)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 :13959_13964，Liu 等(2002) Plant Physiol. 129 :1732_1743，及 WO 99/49029, WO 99/53050, WO 99/61631，及 WO 00/49035 ；通過提及而將每篇收入本文。在本發(fā)明的一些實施方案中，可以通過發(fā)夾RNA(hpRNA)干擾或含有內含子的發(fā)夾RNA(ihpRNA)干擾來獲得對淀粉降解酶表達的抑制。短發(fā)夾RNA(shpRNA)是一種生成可以用于使基因表達沉默的緊密發(fā)夾轉角的RNA序列。這些方法在抑制內源基因表達方面是高度有效的。參見，Waterhouse 和 Helliwell (2003)Nat. Rev. Genet. 4 :29-38 及其中引用的參考文獻。對于hpRNA干擾，表達盒設計為表達與自身雜交以形成包含單鏈環(huán)區(qū)和堿基配對莖的發(fā)夾結構的RNA分子。堿基配對莖區(qū)包含與整個或部分編碼表達要受抑制的基因的內源信使RNA對應的有義序列和與有義序列完全或部分互補的反義序列。如此，分子的堿基配對莖區(qū)一般決定RNA干擾的特異性。hpRNA分子在抑制內源基因的表達方面是高度有效的，并且它們誘導的RNA干擾被植物的后續(xù)世代繼承。參見例如 Chuang 和 MeyerowitzU000)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 :4985-4990 ；Stoutjesdijk 等 (2002)Plant Physiol. 129 :1723-1731 ；及 Waterhouse and Helliwell(2003)Nat. Rev. Genet. 4 :29_38。使用hpRNA干擾來抑制或沉默基因表達的方法記載于例如Chuang和 Meyerowitz(2000)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 :4985-4990 ；Stoutjesdijk 等(2002) Plant Physiol. 129 :1723-1731 ；Waterhouse 禾口 Helliwell(2003)Nat. Rev. Genet.4 : 29-38 ；Pandolfini 等 BMC Biotechnology 3 :7，及美國專利公開文本 No. 20030175965 ；通過提及而將每篇收入本文。Panstruga等O00;3)Mol. Biol. R印.30 :1；35_140 (通過提及而將其收入本文)已經描述了 hpRNA構建體在體內使基因表達沉默的效率的瞬時測定法。也可以在本發(fā)明的方法中使用干擾發(fā)夾RNA(ihpRNA)。ihpRNA與hpRNA具有相同的一般結構，但是該RNA分子另外包含能夠在表達ihpRNA的細胞中被剪接的內含子。 內含子的使用使剪接后的發(fā)夾RNA分子中的環(huán)大小最小化，如此提高干擾的效率。參見例如Smith等(2000)Nature 407:319-320。使用ihpRNA干擾來抑制內源植物基因表達的方法記載于例如 Smith 等(2000)Nature 407 :319-320 ；Wesley 等(2001)Plant J. 27 581-590 ；Wang 禾口 Waterhouse (2001) Curr. Opin. Plant Biol. 5 :146-150 ；Waterhouse 禾口 Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4 :29-38 ；Helliwell 禾口 Waterhouse (2003)Methods 30 觀9-四5，及美國專利公開文本No. 20030180945，通過提及而將每篇收入本文。還可參見WO 02/00904，其中hpRNA設計為使得環(huán)區(qū)決定RNA干擾的特異性。在本發(fā)明的一些實施方案中，可以使用通過表達編碼微小RNA(miRNA)的基因實現(xiàn)的RNA干擾。miRNA是由約22個核糖核苷酸組成的調節(jié)劑。miRNA在抑制內源基因表達方面是高度有效的。參見例如Javier等QO(XB)Nature 425 :257力63，通過提及而將其收入本文。對于miRNA干擾，表達盒設計為表達內源miRNA基因模仿的RNA分子。miRNA基因編碼形成發(fā)夾結構的RNA，所述發(fā)夾結構含有與Rl互補的約22個核苷酸的序列。例如，對于阻抑Rl表達，22個核苷酸的序列選自淀粉降解酶轉錄物序列，并且含有有義取向的所述淀粉降解酶序列的22個核苷酸和與有義序列互補的相應的反義序列的21個核苷酸。用于下調靶蛋白的活性的其它方法包括病毒誘導的基因沉默(Burton等Q000) Plant Cell 12:691-705; R Baulcombe (1999) Curr. Op. Plant Bio. 2 :109-113)；核酶 (Steinecke 等(1992)EMBO J. 11 :1525 ；及 Perriman 等(1993)Antisense Res. Dev. 3 253)；寡核苷酸介導的靶向修飾(例如WO 03/076574和WO 99/25853) ；Si指靶向性分子(例如 WO 01/52620 ；WO 03/048；345 ；及 WO 00/42219)；轉座子加標簽(Maes 等(1999) Trends Plant Sci. 4:90-96 ；Dharmapuri 禾口 Sonti (1999)FEMS Microbiol. Lett. 179 53-59 ；Meissner 等(2000)Plant J. 22 :265-274 ；Phogat 等(2000)J. Biosci. 25 :57-63 ； Walbot (2000)Curr. Opin. Plant Biol. 2 103-107 ;Gai 等 U000)Nucleic Acids Res. 28 94-96 ；Fitzmaurice 等(1999)Genetics 153 :1919-1928 ；Bensen 等(1995)Plant Cell 7 75-84 ；Mena ^ (1996) Science 274 :1537-1540 ；及美國專利 No. 5，962，764)；通過提及而將每篇收入本文。此外，可以使用編碼特異性識別植物細胞中的依照本發(fā)明的淀粉降解酶蛋白或其同系物(例如此類蛋白質的特定片段或表位)的抗體的核酸分子來抑制此蛋白質的活性。這些抗體可以是單克隆抗體、多克隆抗體或合成抗體及抗體片段，諸如Fab、Fv或 scFv片段等。可以例如通過如最初記載于Kohler和Milstein (Nature 256 (1975)，495) 和Galfre(Meth. Enzymol. 73(1981)3)的技術來制備單克隆抗體，所述技術包括融合小鼠骨髓瘤細胞與源自經免疫哺乳動物的脾細胞。此外，可以通過使用記載于例如Harlow and Lane "Antibodies，A Laboratory Manual，，，CSH Press，Cold Spring Harbor，1988 的方法來獲得針對前述肽的抗體或其片段?？梢酝ㄟ^本領域中公知的方法來實現(xiàn)抗體或抗體樣分子在植物中的表達，例如已經在煙草、馬鈴薯(Schouten，F(xiàn)EBS Lett. 415 (1997)， 235-241)或擬南芥中成功表達了全長抗體(full-size antibody) (During, Plant. Mol.Biol. 15(1990)，281-293 ；Hiatt, Nature 342(1989)，469-470 ；Voss, Mol. Breeding 1 (1995)，39-50)、Fab 片段(De Neve, Transgenic Res. 2 (1993)，227—237)、scFvs (Owen, Bio/Technology 10(1992), 790-794 ；Zimmermann, Mol. Breeding 4 (1998),369-379 ； Tavladoraki,Nature 366 (1993)，469—472)禾口 dAb (Benvenuto，Plant Mol. Biol. 17(1991)， 865-874)，達到占總蛋白質高達 6. 8% 的表達水平(Fiedler, Immunotechnology 3(1997)，205-216)。另外，可以使用編碼依照本發(fā)明的酶的突變體形式的核酸分子來干擾野生型蛋白質的活性。此類突變體形式優(yōu)選地已經喪失其活性，而且可以通過蛋白質的氨基酸序列中的氨基酸缺失、取代、和/或添加而從相應的野生型蛋白質衍生。在活性喪失外，此類蛋白質的突變體形式可以顯示升高的底物親和力和/或在細胞中升高的穩(wěn)定性，例如由于摻入使蛋白質在細胞環(huán)境中穩(wěn)定化的氨基酸所致。這些突變體形式可以是天然存在的，或者如優(yōu)選的，經遺傳工程化改造的突變體。進一步涵蓋的是，本發(fā)明的方法可以與用于增加和/或利用植物穗軸組織的淀粉含量的其它方法一起使用。應當認可，降低淀粉的磷酸化的任何機制可以導致淀粉在穗軸組織中的積累，包括抑制磷酸葡聚糖水雙激酶(Kotting等0005斤1￡1壯Physiology 137 242-252)。其它方法包括上調淀粉合成中涉及的酶，例如ADP-葡萄糖磷酸化酶和/或淀粉合酶的表達。淀粉降解酶的核苷酸序列已經在擬南芥葉中鑒定出淀粉降解酶的核苷酸序列。參見alpha-淀粉酶(EC 3. 2. 1. 1)、葡聚糖水雙激酶(EC 2. 7. 9. 4)、磷酸葡聚糖水雙激酶(EC 2. 7. 9. 4)、極限糊精酶(EC 3. 2. 1. 142)、異淀粉酶(EC 3. 2. 1. 68 和 EC3. 2. 1. 68) ,beta-淀粉酶(EC 3. 2. 1. 2)、 葡聚糖磷酸化酶(EC2. 4. 1. 1)和歧化酶(EC 2. 4. 1. 25)。應當認可，可以使用這些序列來下調或阻抑靶基因在任何植物中的表達。然而，若需要其它植物特異性序列，則它可以使用上文所述的核苷酸序列通過雜交或PCR來獲得。來自其它植物的Rl蛋白的核苷酸序列是本領域中已知的。參見例如美國申請公開文本 No. 2006/(^擬917 的 SEQ ID N0:1(玉蜀黍(Zea mays))；美國專利 7，122，727 的 SEQ ID而1、4、5、6、7、和9(小麥)；通過提及而將其收入本文。應當認可，可以使用這些序列來下調或阻抑Rl蛋白在任何植物中的表達。然而，若需要其它植物特異性序列(例如 Rl同系物)，則它可以使用基于上文所述的Rl核苷酸序列的序列通過雜交或PCR來獲得。在PCR方法中，可以設計寡核苷酸引物以在PCR反應中使用，從而從自感興趣的任何植物提取的cDNA或基因組DNA擴增相應的DNA序列。用于設計PCR引物和PCR克隆的方法一般是本領域中已知的。參見例如Sambrook等(1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual (第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)。還可參見 Innis 等編(1990) PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York) ；Innis 禾口 Gelfand 編(1995)PCR Strategies(Academic Press, New York)；及 Innis 禾口 Gelfand 編(1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York)。在雜交技術中，使用整個或部分的已知多核苷酸作為探針，其與存在于來自選定生物體的克隆基因組DNA片段或cDNA片段的群體(即基因組或cDNA文庫)中的其它相應的多核苷酸選擇性雜交。雜交探針可以是基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段、或其它寡核苷酸，并且可以用可檢測基團諸如32P,或任何其它可檢測標志物來標記。用于制備供雜交用以及供構建cDNA和基因組文庫用的探針的方法一般是本領域中已知的，并且披露于 Sambrook 等(1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual (第 2 片反，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)中。“與...雜交”或“與...特異性雜交”指分子僅與特定核苷酸序列在嚴格條件下在所述序列存在于復雜的混合物(例如總細胞)DNA或RNA中時結合、形成雙鏈體、或雜交。 “實質性結合”指探針核酸與靶核酸間的互補雜交，并且包含較少的錯配，其可以通過降低雜交介質的嚴格性以實現(xiàn)靶核酸序列的期望的檢測來容納?！皣栏耠s交條件”和“嚴格雜交清洗條件”在核酸雜交實驗諸如Southern和 Northern雜交的語境中是序列依賴性的，并且在不同環(huán)境參數(shù)下是不同的。較長的序列在較高溫度時特異性雜交。核酸雜交的廣泛指導參見Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes第 I 部分第 2章"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”Elsevier，New York。一般地，高嚴格雜交和清洗條件選擇為比特定序列在限定離子強度和PH的熱熔點(Tm)低5°C。通常，在“嚴格條件下”，探針會與其目標亞序列而非其它序列雜交。1指50%的靶序列與完美匹配的探針雜交的溫度(在限定的離子強度和pH)。非常嚴格的條件選擇為等于特定探針的Tm。用于在Southern或Northern印跡中的濾膜上具有超過100個互補殘基的互補核酸的雜交的嚴格雜交條件的例子是于42°C的含Img肝素的50%甲酰胺，其中實施雜交過夜。高嚴格清洗條件的例子是0. 1 5M NaCl于72°C持續(xù)約 15分鐘。嚴格清洗條件的例子是0. 2X SSC清洗于65°C持續(xù)15分鐘(關于SSC緩沖液的描述，參見Sambrook，見下文)。經常，高嚴格性清洗之前有低嚴格性清洗以除去背景探針信號。針對例如超過100個核苷酸的雙鏈體的典型中等嚴格性清洗是IX SSC于45°C持續(xù) 15分鐘。針對例如超過100個核苷酸的雙鏈體的典型低嚴格性清洗是4-6X SSC于40°C持續(xù)15分鐘。對于短探針(例如約10至50個核苷酸)，嚴格條件通常涉及小于約1. OM Na 離子，通常于PH 7.0至8. 3的約0.01至1.0M Na離子濃度(或其它鹽)的鹽濃度，并且溫度通常是至少約30°C。還可以通過添加去穩(wěn)定劑諸如甲酰胺來實現(xiàn)嚴格條件。一般地，在特定雜交測定法中對無關探針觀察到的信噪比的2X(或更高)的信噪比指示特定雜交的檢出。在嚴格條件下彼此不雜交的核酸仍基本上相同，若它們編碼的蛋白質基本上相同的話。 例如，這在使用遺傳密碼容許的最大密碼子簡并性來創(chuàng)建核酸的拷貝時發(fā)生。以下是可以用于克隆作為本發(fā)明的參照核苷酸序列的同源物的核苷酸序列的雜交/清洗條件集的例子參照核苷酸序列優(yōu)選地在7%十二烷基硫酸鈉(SDQ、0. 5M NaP04、 ImM EDTA中于50°C與參照核苷酸序列雜交，在2X SSC，0. 1 % SDS中于50°C清洗，更期望地在 7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0· 5M NaPO4UmM EDTA 中于 50°C雜交，在 IX SSC,0. 1% SDS 中于50°C清洗，更期望地仍在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4UmM EDTA中于50°C 中雜交，在0. 5X SSC，0. SDS中于50°C清洗，優(yōu)選地在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0. 5M NaPO4UmM EDTA中于50°C雜交，在0. IX SSC, 0. 1 % SDS中于50°C清洗，更優(yōu)選地在7%十二燒基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4UmM EDTA 中于 50°C雜交，在 0· IX SSC, 0. 1% SDS 中于 65°C 清洗。植物表達盒另外，本發(fā)明的組合物可以含有用于在感興趣的植物中轉化和表達的核酸序列。 核酸序列可以存在于DNA構建體或表達盒中。如本文中所使用的，“表達盒”指能夠指導特定核苷酸序列在合適的宿主細胞中表達的核酸分子，其包含與感興趣的核苷酸序列(即 Rl抑制性多核苷酸)可操作連接的啟動子，所述感興趣的核苷酸序列與終止信號可操作連接。它通常還包含核苷酸序列的正確翻譯所需要的序列。編碼區(qū)通常編碼感興趣的蛋白質， 但是也可以以有義或反義方向編碼感興趣的功能性RNA，例如反義RNA或非翻譯RNA。包含感興趣的核苷酸序列的表達盒可以是嵌合的，這意味著至少一種其構件對于至少一種其其它構件而言是異源的。編碼盒也可以是天然存在的，但是已經以可用于異源表達的重組形式獲得的。然而，通常，編碼盒對于宿主而言是異源的，即表達盒的特定DNA序列不在宿主細胞中天然存在，而且必須已經通過轉化事件來導入宿主細胞或宿主細胞的祖先中。表達盒中的核苷酸序列的表達可以在組成性啟動子或誘導型啟動子的控制下，所述誘導型啟動子僅在宿主細胞被暴露于一些特定外部刺激物時才啟動轉錄。另外，啟動子對特定組織或器官或發(fā)育階段也可以是特異性的。本發(fā)明涵蓋用表達盒轉化植物，所述表達盒能夠表達降低或消除一種或多種淀粉降解酶的活性的多核苷酸。表達盒在轉錄的5’-3’方向會包括轉錄和翻譯啟動區(qū)(即啟動子)和感興趣的多核苷酸，即能夠直接或間接(經由蛋白質產物的表達)降低或消除一種或多種淀粉降解酶的活性的多核苷酸。任選地，表達盒可以包含植物中有功能的轉錄和翻譯終止區(qū)(即終止區(qū))。在一些實施方案中，表達盒包含選擇標志基因以容許選擇穩(wěn)定的轉化體。本發(fā)明的表達構建體還可以包含前導序列和/或容許感興趣的多核苷酸誘導型表達的序列。關于容許誘導型表達的序列的例子，參見Guo等O003)Plant J. 34 :383-92和 Chen 等(2003)Plant J. 36 :731_40。表達構建體的調節(jié)序列與感興趣的多核苷酸可操作連接?！翱刹僮鬟B接”意指啟動子與第二序列間的功能性連接，其中所述啟動子序列啟動并介導與第二序列對應的DNA序列的轉錄。一般地，可操作連接意指所連接的核苷酸序列是連續(xù)的?？梢栽诒景l(fā)明的實施中使用能夠在感興趣的植物中驅動表達的任何啟動子。啟動子對于植物宿主而言可以是天然的或類似的或外來的或異源的。術語“異源的”和“外源的”在本文中用于提及核酸序列(例如DNA或RNA序列)或基因時指源自對于特定宿主細胞而言外來來源的，或者如果來自相同來源，自其初始形式修飾的序列。如此，宿主細胞中的異源基因包括對于特定宿主細胞而言內源的，但是已經經由例如使用DNA改組來修飾的基因。該術語還包括天然存在的DNA序列的非天然存在的多個拷貝。如此，該術語指對于細胞而言外來的或異源的，或者對于細胞而言同源的，但是在宿主細胞核酸內通常沒有找到元件的位置中發(fā)現(xiàn)的DNA區(qū)段。表達外源DNA區(qū)段以產生外源多肽。“同源”核酸(例如DNA)序列是與其所導入的宿主細胞天然關聯(lián)的核酸(例如DNA 或RNA)序列。要包括的啟動子的選擇取決于數(shù)項因素，包括但不限于效率、選擇性、誘導性、期望的表達水平、和細胞或組織優(yōu)先性表達。通過相對于序列適當?shù)剡x擇并放置啟動子和其它調節(jié)區(qū)來調節(jié)所述序列的表達對于本領域技術人員是常規(guī)的事情。一些合適的啟動子僅或主要在某些細胞類型中啟動轉錄。如此，如本文中所使用的，細胞類型或組織優(yōu)先性啟動子是優(yōu)先在靶組織中驅動表達，但是也可以在其它細胞類型或組織中導致一些表達的。應當理解，在靶組織中優(yōu)先靶向表達的一些啟動子也可以在非優(yōu)先的靶定組織中展現(xiàn)出“泄露”表達。一個例子可以是如下的啟動子，其表達譜在玉米種子中顯示優(yōu)先性表達，然而在成熟的葉組織中也展現(xiàn)出強烈的表達。用于鑒定和表征植物基因組DNA中的啟動子區(qū)的方法包括例如那些記載于下列參照文獻的Jordano，等，Plant Cell，1 :855-866(1989) ；Bustos，等，Plant Cell，1 :839-854 (1989) ；Green，等， EMBO J. 7,4035-4044(1988) ；Meier，等，Plant Cell，3，309-316 (1991)；及Zhang，等，Plant Physiology 110:1069-1079(1996)。在光合組織中顯示優(yōu)選的活性且在穗軸組織中具有一些活性的啟動子在本發(fā)明的一些實施方案中可以是有用的。啟動子可以在整個植物中組成性，或者在植物穗軸組織方面差異地，或者在發(fā)生表達的植物穗軸組織的發(fā)育階段方面差異地，或響應外部刺激而賦予表達。此類啟動子的例子包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(Rbd)啟動子諸如來自北美落葉松(eastern larch, Larix laricina)的 RbcS 啟動子、松 cab6 啟動子(Yamamoto 等(1994)Plant Cell Physiol. ；35 :773-778)、來自小麥的 Cab-I 基因啟動子(Fejes 等 (1990)Plant Mol. Biol. 15 :921-932)、來自菠菜的 CAB-1 啟動子(Lubberstedt 等(1994) Plant Physiol. 104 :997-1006)、來自稻的 cablR 啟動子(Luan 等(1992)Plant Cell 4 971-981)、來自玉米的丙酮酸正磷酸雙激酶(PPDK)啟動子(Matsuoka等(1993)ft~OC Natl Acad Sci USA 90 :9586-9590)、煙草 LhcbN2 啟動子(Cerdan 等(1997)Plant Mol. Biol. 33 :245-255)、擬南芥(Arabidopsis thaliana) SUC2 蔗糖-H+同向轉運體啟動子 (Truernit等(1995)Planta 196 :564-570)、和來自菠菜的類囊體膜蛋白啟動子(psaD， psaF，psaE，PC, FNR, atpC，atpD，cab, rbcS)。在莖、葉和綠色組織中驅動轉錄的其它啟動子記載于美國專利公開文本No. 2007/0006346，通過提及而將完整收入本文。在本發(fā)明的一些其它實施方案中，誘導型啟動子可以是期望的。誘導型啟動子響應外部刺激諸如化學劑或環(huán)境刺激而驅動轉錄。例如，誘導型啟動子可以響應激素諸如赤霉酸或乙烯，或者響應光或干旱而賦予轉錄。也可以在本發(fā)明中使用衰老誘導型啟動子以在植物的特定發(fā)育階段阻抑淀粉降解酶，從而淀粉在特定時間在植物穗軸組織中積累。一個例子會是在種子胚乳成熟后在玉米穗軸中抑制或阻抑淀粉降解酶?？梢栽诒景l(fā)明的多個實施方案中使用的誘導型啟動子的一些其它例子可以參見Journal of Experimental Botany 200859(2) :377-387 ；根癌土壤桿菌(A. tumefaciens) ipt 基因在小麥中的衰老誘導的異位表達延遲葉衰老，提高細胞分裂素含量、硝酸鹽流入、和硝酸鹽還原酶活性， 但是不景i口向谷粒產率，Blanka S koroval, Gabriela Kure ον 2, Sasha Daskalova3, Marie Tr kova2, Klara Hoyerova1, Ivana Raimanova2, Vaclav Motykal, Alena Travni koval, Malcolm C. Elliott3 和 Miroslav Kaminekl, PNAS 2007 年 12 月 4 日第 104 卷 no. 49 19631—19636 Delayed leaf senescence induces extreme drought tolerance in a flowering plant,及 Rosa M. Rivero*,Mikiko Kojima f, Amira Gepstein Hitoshi Sakakibaraf5Ron Mittler § Tf,Shimon Gepstein卞,禾口Eduardo Blumwald, Plant Physiol. (1999) 120 :1015-1024,通過提及而將它們都收入本文。多種轉錄終止子可用于在表達盒中使用。這些負責終止轉基因外的轉錄，并改正 mRNA聚腺苷酸化。終止區(qū)對于轉錄起始區(qū)而言可以是天然的，對于可操作連接的感興趣的 DNA序列可以是天然的，對于植物宿主而言可以是天然的，或者可以源自另一種來源(即對于啟動子、感興趣的DNA序列、植物宿主、或其任意組合而言是外來或異源的)。合適的轉錄終止子是那些已知在植物中發(fā)揮功能的，并且包括CAMV 35S終止子、tml終止子、胭脂氨酸合酶終止子和豌豆rbcs E9終止子。這些可以在單子葉植物和雙子葉植物兩者中使用。另外，可以使用基因的天然轉錄終止子。一般地，表達盒會包含用于選擇經轉化的細胞的選擇標志基因。利用選擇標志基因來選擇經轉化的細胞或組織。已經發(fā)現(xiàn)了許多序列增強來自轉錄單元內的基因表達，并且這些序列可以與本發(fā)明的基因一起使用以提高其在轉基因植物中的表達。已經顯示了多種內含子序列增強表達，特別在單子葉植物細胞中。例如，已經發(fā)現(xiàn)了玉米Adhl基因的內含子在其關聯(lián)的啟動子下在導入玉米細胞中時顯著提高野生型基因的表達。發(fā)現(xiàn)內含子1是特別有效的，并且在具有氯霉素乙酰轉移酶基因的融合構建體中增強表達(Callis等，Genes Develop. 1 1183-1200 (1987))。在相同的實驗系統(tǒng)中，來自玉米bronze 1基因的內含子在增強表達方面具有相似的效果。已經將內含子序列常規(guī)地摻入植入轉化載體中，通常在非翻譯前導內。還已知源自病毒的許多非翻譯前導序列增強表達，并且這些在雙子葉植物細胞中是特別有效的。具體地，已經顯示了來自煙草花葉病毒01^，“1-序列”)、玉米褪綠斑點病毒(MCMV)、和苜?；ㄈ~病毒(AMV)的前導序列在增強表達方面是有效的(例如 Gallie 等 Nucl. Acids Res. 15 :8693-8711(1987) ；Skuzeski 等 Plant Molec. Biol. 15 65-79(1990))。本領域中已知的其它前導序列包括但不限于小RNA病毒前導，例如EMCV 前導(腦心肌炎 5，非編碼區(qū))(Elroy-Mein，0.，F(xiàn)uerst, T. R.，和 Moss，B. PNAS USA 86 6126-6130(1989))；馬鈴薯Y病毒組前導，例如TEV前導(煙草蝕刻病毒)(Allison等， 1986) ；MDMV前導(玉米矮縮花葉病毒)；Virology 154 9~20)；人免疫球蛋白重鏈結合蛋白(BiP)前導(Macejak，D. G.，和 Samow，P. ,Nature 353:90-94(1991)；來自苜?；ㄈ~病毒的外殼蛋白 mRNA(AMV RNA 4)的非翻譯前導(Jobling，S. Α.，和 Gehrke，L.，Nature 325 622-625(1987)；煙草花葉病毒前導(TMV)，(Gallie，D.R.等，Molecular Biology of RNA, 第237頁-第256頁(1989)；和玉米褪綠斑點病毒前導(MCMV) (Lomme 1, S. A.等，Virology 81:382-385(1991)。還可參見 Della-Cioppa 等，Plant Physiology 84:965-968(1987)。已知用于靶向基因產物的多種機制存在于植物中，而且已經相當詳細地表征了控制這些機制發(fā)揮功能的序列。例如，對葉綠體靶向基因產物受多種蛋白質的氨基端末端處找到的信號序列控制，所述信號序列在葉綠體輸入期間被切割以產生成熟的蛋白質(例如 Comai等J. Biol. Chem. 263 :15104-15109 (1988))。這些信號序列可以與異源基因產物融合以實現(xiàn)異源產物向葉綠體中的輸入(van den Broeck，等Nature 313 :358-363 (1985))?？梢宰跃幋aRUBISC0蛋白、CAB蛋白、EPSP合酶酶、GS2蛋白和已知定位于葉綠體的許多其它蛋白質的cDNA的5，端分離編碼合適的信號序列的DNA。還可參見，美國專利No. 5，639，949 的實施例 37 中題目為"Expression With Chloroplast Targeting” 的部分。上文所描述的細胞靶向機制不僅可以與其關聯(lián)的啟動子一起利用，而且還可以與異源啟動子一起利用，從而在啟動子的轉錄調節(jié)下實現(xiàn)特定細胞靶向目標，所述啟動子與靶向信號來源的啟動子具有不同表達樣式。為了確保在質體中的定位，想到使用下列轉運肽之一菠菜的質體鐵氧還蛋白 NADP+氧化還原酶(FNR)的，其包含在 Jansen 等(Current Genetics 13 (1988)，517-522) 中。具體地，可以使用范圍為其中所披露的cDNA序列的核苷酸-171至165的序列，其包含 5’非翻譯區(qū)及編碼轉運肽的序列。另一個例子是玉米蠟樣蛋白的轉運肽，包括成熟蠟樣蛋白的前34個氨基酸殘基(Klosgen等，Mol. Gen. Genet. 217(1989)，155-161)。也有可能使用沒有成熟蛋白質的前34個氨基酸的此轉運肽。此外，可以使用二磷酸核酮糖羧化酶小亞基 (Wolter 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988)，846-850 ；Nawrath 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994)，12760-12764)、NADP 蘋果酸脫氫酶(Galiardo 等，Planta 197 (1995)， 324-332)、谷胱甘肽還原酶(Creissen等，Plant J. 8(1995)，167-175)或Rl 蛋白(Lorberth 等 Nature Biotechnology 16，(1998)，473-477)的信號肽。植物轉化一旦將抑制淀粉降解酶的核酸序列克隆到表達系統(tǒng)中，便將其轉化入植物細胞中。可以以多種本領域公認的方式將本發(fā)明的受體和靶標表達盒導入植物細胞中。術語“導入”在多核苷酸(例如感興趣的核苷酸構建體)的語境中意圖指以使多核苷酸進入植物細胞內部的方式對植物呈現(xiàn)多核苷酸。在要導入超過一種多核苷酸的情況中，這些多核苷酸可以作為單一核苷酸構建體的一部分，或者作為不同核苷酸構建體裝配，而且可以位于同一或不同轉化載體上。因而，可以在單一轉化事件中、在不同轉化事件中，或者例如在植物中作為育種方案的一部分將這些多核苷酸導入感興趣的宿主細胞中。本發(fā)明的方法不依賴于用于將一種或多種多核苷酸導入植物中的特定方法，只要多核苷酸進入植物的至少一個細胞的內部。用于將多核苷酸導入植物中的方法是本領域中已知的，包括但不限于瞬時轉化方法、穩(wěn)定轉化方法、和病毒介導的方法?！八矔r轉化”在多核苷酸的語境中意圖指將多核苷酸導入植物中，并且其不整合到植物的基因組中?！胺€(wěn)定導入”在導入植物中的多核苷酸的語境中意圖將導入的多核苷酸穩(wěn)定地摻入植物基因組中，并且如此用多核苷酸穩(wěn)定地轉化植物?！胺€(wěn)定轉化”意圖指導入植物中的多核苷酸，例如本文中所描述的核苷酸構建體整合到植物的基因組中，而且能夠被其后代，更特別是，多個連續(xù)世代的后代繼承。多種可用于植物轉化的轉化載體是植物轉化領域中的普通技術人員已知的，并且屬于本發(fā)明的基因可以與任何此類載體一起使用。載體的選擇會取決于優(yōu)選的轉化技術和供轉化用的靶標物種。對于某些靶標物種，不同抗生素或除草劑選擇標志可以是優(yōu)選的。 轉化中常規(guī)使用的選擇標志包括nptll基因(其賦予對卡那霉素或相關抗生素的抗性) (Messing 和 Vierra. Gene 19 :259-268(1982) ；Bevan 等，Nature 304 184-187(1983))、 bar基因(其賦予對除草劑草胺膦的抗性)(White等，Nucl. Acids Res 18 =1062(1990)， Spencer 等 Theor. Appl. Genet 79 :625-631 (1990))、hph 基因(其賦予對抗生素潮霉素的抗性)(Blochinger 和 Diggelmann，Mol Cell Biol 4 :四四_2931)、和 dhfr 基因(其賦予對甲氨蝶呤的抗性)(Bourouis 等，EMBO J. 2 (7) :1099-1104 (1983) )、EPSPS 基因(其賦予對草甘膦的抗性)(美國專利No. 4，940，935和5，188，642)、和甘露糖_6_磷酸異構酶基因 (其提供代謝甘露糖的能力)(美國專利No. 5，767，378和5，994，629)。用于再生植物的方法也是本領域中公知的。例如，已經利用Ti質粒載體來遞送外來DNA，以及直接的DNA攝取、脂質體、電穿孔、微注射、和微粒。另外，可以利用來自土壤桿菌屬(Agrobacterium)的細菌來轉化植物細胞。下文是用于轉化單子葉植物和雙子葉植物兩者的代表性技術及代表性質粒轉化技術的描述。許多載體可用于使用根癌土壤桿菌的轉化。這些通常攜帶至少一個T-DNA邊界序列，并且包括諸如PBIN19的載體(Bevan,Nucl. Acids Res. (1984))。對于構建可用于根癌土壤桿菌的載體，參見例如美國專利申請公開文本No. 2006/(^60011，通過提及而將其收入本文。在不使用根癌土壤桿菌的情況下的轉化回避對選定轉化載體中的T-DNA序列的需要，因此在諸如含有T-DNA序列的上文所描述的載體外，可以利用缺乏這些序列的載體。 不依賴于土壤桿菌的轉化技術包括經由顆粒轟擊、原生質體攝取(例如PEG和電穿孔)和微注射的轉化。載體的選擇很大程度上取決于所轉化的物種的優(yōu)選的選擇。對于構建此類載體，參見例如美國申請No. 20060260011，通過提及而將其收入本文。用于雙子葉植物的轉化技術是本領域中公知的，并且包括基于土壤桿菌的技術和不需要土壤桿菌的技術。非土壤桿菌技術涉及原生質體或細胞直接攝取外源遺傳物質。這可以通過PEG或電穿孔介導的攝取、顆粒轟擊介導的遞送、或微注射來實現(xiàn)。I^aszkowski 等，EMBO J. 3 :2717-2722 (1984), Potrykus 等，Mol. Gen. Genet. 199 :169-177 (1985)，Reich 等，Biotechnology 4 :1001-1004 (1986)，及 Klein 等，Nature 327:70-73(1987)描述了這些技術的例子。在每種情況中，使用本領域中已知的標準技術將經轉化的細胞再生成全植物。土壤桿菌介導的轉化由于其較高的轉化效率及其對許多不同物種的寬效用而成為一種用于轉化雙子葉植物的優(yōu)選的技術。土壤桿菌轉化通常涉及將攜帶感興趣的外來 DNA的二元載體(例如pCIB200或pCIB2001)轉移到合適的土壤桿菌菌株，其可以依賴于由宿主土壤桿菌菌株在共駐留的Ti質粒上或染色體攜帶的vir基因的互補物(例如對于 PCIB200 和 pCIB2001 為菌株 CIB542(Uknes 等 Plant Cell 5:159-169(1993))。對土壤桿菌轉移重組二元載體使用攜帶重組二元載體的大腸桿菌、輔助大腸桿菌菌株(其攜帶質粒諸如PRK2013，而且其能夠使重組二元載體移動到靶標土壤桿菌菌株)通過三親本雜交規(guī)程來實現(xiàn)?；蛘撸梢酝ㄟ^DNA轉化來將重組二元載體轉移到土壤桿菌(Hofgen和 ffillmitzer, Nucl. Acids Res. 16 :9877 (1988))。通過重組土壤桿菌來轉化靶標植物物種通常涉及共培養(yǎng)土壤桿菌與來自植物的外植體，并遵循本領域公知的方案。在選擇培養(yǎng)基上再生經轉化的組織，其攜帶存在于二元質粒T-DNA邊界間的抗生素或除草劑抗性標志物。土壤桿菌介導的原位(In Planta)轉化系統(tǒng)也對擬南芥(Arabidopsis)常規(guī)使用(Bechtold 等 CR Acad. Sci III. Sci Vie 316 1194-1199(1993)，而且可以對歐洲油菜(Brassica napus)使用(Wang W. C.等Plant Cell Report 22 :274-281(2003)。用基因轉化植物細胞的另一種方法涉及在植物組織和細胞處推進惰性或生物學活性顆粒。此技術披露于均為Sanford等的美國專利No. 4，945，050、5，036，006、和 5，100, 792。一般地，此規(guī)程涉及在有效穿透細胞外膜并在其內部內提供摻入的條件下在細胞處推進惰性或生物學活性顆粒。在利用惰性顆粒時，可以通過用含有期望基因的載體包被顆粒來將載體導入細胞中。或者，靶細胞可以被載體環(huán)繞，從而通過激發(fā)顆粒來將載體攜帶到細胞中。也可以將生物學活性顆粒(例如干的酵母細胞、干的細菌或噬菌體，其各自含有設法導入的DNA)推入植物細胞組織中。大多數(shù)單子葉植物物種的轉化現(xiàn)在也已經變得常規(guī)。優(yōu)選的技術包括使用PEG或電穿孔技術來對原生質體進行直接基因轉移，和對愈傷組織的顆粒轟擊?？梢杂脝我?DNA種類或多個DNA種類(即共轉化)來進行轉化，并且這兩種技術都合適于與本發(fā)明一起使用。共轉化可以具有避免完整載體構建和生成在感興趣的基因和選擇標志方面具有未連接的基因座(使選擇標志能夠在隨后的世代中被除去，若這被認為是期望的話)的轉基因植物的優(yōu)點。然而，使用共轉化的缺點在于不同DNA種類整合入基因組中的小于100%的頻率 (Schocher 等 Biotechnology 4 1093-1096 (1986))。專利申請EP 0292435, EP 0392225、和WO 93/07278描述了自玉米的良種近交系制備愈傷組織和原生質體、使用PEG或電穿孔來轉化原生質體、和自經轉化的原生質體再生玉米植物的技術。Gordon-Kamm 等(Plant Cell 2 :603-618 (1990))和 Fromm 等 (Biotechnology 8 :833-839(1990))已經發(fā)表了使用顆粒轟擊來轉化A188衍生的玉米系的技術。此外，WO 93/07278 和 Koziel 等(Biotechnology 11 :194-200(1993))描述了通過顆粒轟擊來轉化玉米良種近交系的技術。此技術利用自傳粉后14-15天的玉米穗切出的 1. 5-2. 5mm長度的未成熟的玉米胚和PDS-IOOOHe生物射彈裝置進行轟擊。稻的轉化也可以利用原生質體或顆粒轟擊通過直接基因轉移技術來進行。已經對Japonica型和hdica型描述了原生質體介導的轉化(Zhang等Plant Cell Rep 7 379-384(1988) ；Shimamoto 等 Nature 338 :274-277(1989) ；Datta 等 Biotechnology 8 :736-740 (1990))。這兩種類型也是使用顆粒轟擊常規(guī)可轉化的(Christou等 Biotechnology 9:957-962(1991))。此外，WO 93/21335描述了經由電穿孔來轉化稻的技術。專利申請EP 0332581描述了生成、轉化和再生早熟禾亞科(Pooideae)原生質體的技術。這些技術容許轉化鴨茅屬(Dactylis)和小麥。此外，Vasil等(Biotechnology 10 :667-674(1992))已經描述了使用對C型長期可再生愈傷組織的細胞進行顆粒轟擊，以及 Vasil 等(Biotechnologyl 11 :1553-1558(1993))和 Weeks 等(Plant Physiol.102 1077-1084(1993))也描述了使用未成熟胚和未成熟胚衍生的愈傷組織的顆粒轟擊進行的小麥轉化。然而，小麥轉化的優(yōu)選技術涉及通過未成熟胚的顆粒轟擊來轉化小麥，并且包括在基因投遞前的高蔗糖或高麥芽糖步驟。在轟擊前，將任何數(shù)目的胚(長0. 75-lmm)鋪板到具有 3%蔗糖(Murashiga 和 Skoog，Physiologia Plantarum 15:473-497(1962))禾Π 3mg/ 1 2，4-D的MS培養(yǎng)基上以誘導體細胞胚，這容許在黑暗中進行。轟擊的選定日當天，從誘導培養(yǎng)基取出胚，并將其鋪板到滲壓劑(即具有以期望的濃度，通常為15%添加的蔗糖或麥芽糖的誘導培養(yǎng)基)上。讓胚進行質壁分離2-3小時，然后轟擊。每個目標平板20個胚是通常的，盡管不是至關重要的。使用標準的規(guī)程將合適的攜帶基因的質粒(諸如PCIB3064 或PS0G3Q沉淀到微米大小的金顆粒上。使用約IOOOpsi的爆破壓力使用標準的80目篩用 DuPont BIOLISTICS 氦裝置來射擊胚的每個平板。轟擊后，將胚放回到黑暗中以恢復約 M小時(仍在滲壓劑上)。24小時后，從滲壓劑取出胚，并將其放回到誘導培養(yǎng)基上，在那里它們保持約1個月，之后再生。約1個月后，將具有形成中的胚發(fā)生愈傷組織的胚外植體轉移到再生培養(yǎng)基(MS+lmg/升NAA，5mg/升GA)，其進一步含有合適的選擇劑(在pCIB3064 的情況中為10mg/l Basta及在pS0G35的情況中為aiig/Ι甲氨蝶呤)。在約1個月后，將形成的枝轉移到稱為“GA7s”的更大的無菌容器，其含有半強度MS、2%蔗糖、和相同濃度的選擇劑。使用土壤桿菌來轉化單子葉植物也已經得到描述。參見WO 94/00977和美國專利No. 5，591，616，通過提及而將這兩篇都收入本文。還可參見Negrotto等，Plant Cell Reports 19 :798-803 QOOO)，通過提及而將其收入本文。例如，可以使用稻(Oryza sativa)來生成轉基因植物?？梢允褂枚喾N稻栽培種(Hiei 等，1994，Plant Journal 6 :271-282 ;Dong 等，1996，Molecular Breeding 2 267-276 ;Hiei 等，1997，Plant Molecular Biology, 35 :205-218)。還有，下文所描述的多種培養(yǎng)基組分可以在數(shù)量上有所變化或者被替代。通過在MS-CIM培養(yǎng)基(MS基礎鹽， 4. 3g/升；B5維生素(200X)，5ml/升；蔗糖，30g/升；脯氨酸，500mg/升；谷氨酰胺，500mg/ 升；酪蛋白水解產物，300mg/升；2,4-0(^^1),21111/^ ；用IN KOH將pH調節(jié)至5. 8 ；植物凝膠，3g/升)上培養(yǎng)來啟動胚發(fā)生響應和/或從成熟的胚建立培養(yǎng)物。將培養(yǎng)物響應的初始階段的成熟胚或建立的培養(yǎng)系接種，并與含有期望的載體構建體的根癌土壤桿菌菌株 LBA4404( 土壤桿菌)共培養(yǎng)。于從甘油貯液在固體YPC培養(yǎng)基(100mg/L大觀霉素和任何其它合適的抗生素)上將土壤桿菌培養(yǎng)約2天。將土壤桿菌在液體MS-CIM培養(yǎng)基中重懸。將土壤桿菌培養(yǎng)物稀釋到0D600為0. 2-0. 3，并添加乙酰丁香酮至終濃度200uM。在混合溶液與稻培養(yǎng)物前添加乙酰丁香酮以誘導土壤桿菌將DNA轉移到植物細胞。對于接種， 將植物培養(yǎng)物浸入細菌懸浮液中。取出液體細菌懸浮液，并將接種的培養(yǎng)物放置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，并于22°C溫育2天。然后，將培養(yǎng)物轉移到具有替卡西林(400mg/升)的MS-CIM 培養(yǎng)基以抑制土壤桿菌的生長。對于利用PMI選擇標志基因的構建體(Reed等，^002) Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 37 :127-132)，在7天后，將培養(yǎng)物轉移到含有甘露糖作為碳水化合物來源的選擇培養(yǎng)基(具有2%甘露糖、300mg/升替卡西林的MQ，并在黑暗中培養(yǎng)3-4周。然后，將抗性菌落轉移到再生誘導培養(yǎng)基(沒有2，4-D，具有0. 5mg/升IAAUmg/ 升玉米素、200mg/升特美汀、2%甘露糖和3%山梨糖醇的MS)，并在黑暗中培養(yǎng)14天。然后，將增殖的菌落轉移到另一輪再生誘導培養(yǎng)基，并移到光生長室。將再生的枝轉移到具有 GA7-1培養(yǎng)基(無激素而具有2%山梨糖醇的MQ的容器達2周，然后在它們足夠大并具有足夠的根時移到溫室。將植物移植到溫室中的土壤(以生成)，培養(yǎng)至成熟，并收獲T1種子。經由用本發(fā)明的核酸序列進行的轉化獲得的植物可以是極其多種植物物種之任一種；然而，在本發(fā)明的方法中使用的植物優(yōu)選地選自上文所列的農藝學上重要的目標作物的列表。可以經由育種將與對于產量和質量重要的其它特征組合的本發(fā)明的基因的表達摻入植物品系中。育種方法和技術是本領域中已知的。參見例如^felsh J. R.，F(xiàn)undamentals of Plant Genetics and Breeding, John Wiley&Sons, NY(1981) ；Crop Breeding, Wood D. R.(編)American Society of Agronomy Madison, Wis. (1983) ；Mayo 0. , The Theory of Plant Breeding，第二片反，Clarendon Press, Oxford(1987) ；Singh, D. P. ,Breeding for Resistance to Diseases and Insect Pests,Springer-Verlag,NY(1986)；及Wricke and Weber,Quantitative Genetics and Selection Plant Breeding,Walter de Gruyter and Co.，Berlin(1986)。對于質體的轉化，在T瓊脂培養(yǎng)基上的1”環(huán)形陣列中以每平板7個使煙草 (Nicotiana tabacum) “Xanthienc”栽培種的種子發(fā)芽，并在播種后12-14天用經來自質粒 pPH143 和 pPH145 的 DNA 包被的 Ium 鎢顆粒(M10, Biorad, Hercules, Calif.)轟擊，基本上如描述的(Svab, Z.和Maliga，P. (1993)PNAS 90,913-917) 將經轟擊的幼苗在T培養(yǎng)基上溫育2天，之后切下葉，并將其在亮光(350-500umol光子/m2/s)中在含有500ug/ml 二鹽酸大觀霉素(Sigma，St. Louis，Mo.)的 RMOP 培養(yǎng)基(Svab,Z. , Hajdukiewicz, P.和 Maliga，P. (1990)PNAS 87,8526-8530)的平板上背軸側向上放置。將轟擊后3_8周出現(xiàn)在漂白的葉下面的抗性枝亞克隆到相同的選擇培養(yǎng)基上，容許其形成愈傷組織，并將二級枝分離并亞克隆。通過Southern印跡的標準技術(Sambrook等，(1989)Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor)來評估獨立亞克隆中的經轉化的質體基因組拷貝的完全分離(同質性)。將經BamHI/EcoRI消化的總細胞0嫩(]^ 161~，1.工(1987) Plant Mol Biol Reporter 5,346349)在 Tris-硼酸鹽(TBE)瓊脂糖凝膠上分離，轉移到尼龍膜(Amersham)，并用經32P標記的隨機引物DNA序列探查，所述隨機引物DNA序列對應于來自含有rps 7/12質體靶向序列的一部分的pC8的 0. 7kb BamHI/HindHI DNA片段。將同質性枝在含有大觀霉素的MS/IBA培養(yǎng)基(McBride， K. Ε.等(1994)PNAS 91，7301-7305)上在無菌條件下生根，并轉移到溫室。通過有性生殖或營養(yǎng)生長來傳遞工程化改造入上文所描述的轉基因種子和植物中的遺傳特性，并且如此可以在后代植物中得到維持并增殖。一般地，維持和增殖利用為了滿足特定目的而開發(fā)的已知農業(yè)方法諸如耕作、播種或收獲?？梢栽谥参镉N中進一步利用依照本發(fā)明的轉基因植物和種子的有益遺傳特性。 根據期望的特性，采用不同育種措施。相關技術是本領域中公知的，并且包括但不限于雜交、近交、雙單倍體、回交育種、多系育種、品種混和、種間雜交、非整倍體技術等。如此，可以使用依照本發(fā)明的轉基因種子和植物來培育改良的植物品系，其例如提高常規(guī)方法諸如除草劑或殺蟲劑處理的效率或者由于其經修飾的遺傳特性而容許省去所述方法。生物質轉化依照本發(fā)明轉化的植物提供一種提高乙醇產率、降低預處理成本的手段，其通過降低生物質糖化的酸/熱預處理需要；和/或降低其它植物生成和加工成本，諸如通過容許商業(yè)上有價值的副產物的多應用和分離來進行。最近已經在本領域中開發(fā)了收集穗軸的收獲方法。例如，通過經改良的聯(lián)合收割機來收集加有仁的全穗軸。聯(lián)合收割機可以修改為既收獲穗軸又進一步在該聯(lián)合收割機內的不同儲存箱中剝離并貯存穗軸和種子。另一種方法可以是用聯(lián)合收割機來收集加有仁的全穗軸，然后在乙醇生產廠分離仁和穗軸。另一種選項可以是使用常規(guī)的聯(lián)合收割機，其將剝離的穗軸釋放到附隨的卡車床中。可以在生物質轉化廠將完全的穗軸剝離仁，在生物質轉化廠中將一條流(stream)中的玉米種子分級成其相對組分(例如胚乳、纖維、胚芽)。然后，可以將這些玉米種子組分進一步加工以生產商業(yè)產品。例如，可以在商業(yè)酵母發(fā)酵中利用經分級的玉米種子胚乳以生產乙醇。穗軸可以指向第二條流，在那里其可以進行或不進行預處理，然后進行發(fā)酵以生成有利的商業(yè)產品(例如乙醇、丁醇)。另一種方法可以是在單一批次中發(fā)酵加有仁的全穗軸。以下發(fā)明的實施方案可以是在上文所提及的任何方法中使用具有增加的淀粉的穗軸。另一個實施方案可以是使加有仁的全穗軸能夠經由單一批次方法而轉化成商業(yè)產品(例如乙醇)，其中研磨具有升高水平的淀粉和仁的全穗軸，并將其在生物轉化中進一步糖化并發(fā)酵。另一個實施方案可以是加工要在動物飼料中使用的具有水平升高的淀粉和仁的全穗軸。另一個實施方案可以是收獲要在生物質轉化法中進一步利用的含有水平升高的淀粉的整個地上植物部分、含有水平升高的淀粉的穗軸和玉米種子。 在一個實施方案中，可以期望在多穗玉米品種中實施本發(fā)明。在又一個實施方案中，可以使用具有增加的淀粉含量的穗軸作為表達大量酶的組織以生成商業(yè)酶。例如，可以在含有提高量的淀粉的穗軸中以高水平表達纖維素酶或淀粉酶，接著進行加工以從所述穗軸提取供商業(yè)銷售的酶。另外，淀粉可以在生物質轉化應用中添加額外的價值。預處理。常規(guī)的方法包括物理、化學、和/或生物預處理。例如，物理預處理技術可以包括多種類型的碾磨、碾碎、照射、蒸/蒸汽爆發(fā)、和水熱解之一種或多種?；瘜W預處理技術可以包括酸、堿、有機溶劑、氨水、二氧化硫、二氧化碳、和PH受控的水熱解。生物預處理技術可以涉及應用木質素溶解性微生物(T.-A. Hsu，“Handbook on Bioethanol. Production and Utilization，，，C. Ε. Wyman (編),1996, Taylor 禾口 Francis !Washington, D.C. ，179-212 ；P.Ghosh 禾口 k. Singh, Α. ，Adv.Appl.Microbiol. ，1993,39 :295-333 ； J. D. McMillan, 于"Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production，，， M. Himmel 等，(編)，1994,第 15 章，ACS Symposium Series 566, American Chemical Society :B.Hahn-Hagerdal, Enz. Microb.Tech. ，1996，18 :312-331 ；及 L. Vallander 禾口 K. Ε. L. Eriksson, Adv. Biochem. Eng. /Biotechnol.，1990,42 :63-95)。預處理步驟的目的是分解木質素和碳水化合物結構以使纖維素級分接近纖維素分解酶。本申請的一個實施方案可以是通過使用具有升高的淀粉水平的穗軸來縮短或擺脫穗軸預處理步驟。另一個實施方案可以是在穗軸或種子中表達加工酶，其會將復雜的分子進一步加工成要在生物質轉化法中使用的單糖。另一個實施方案可以是在穗軸或種子中表達加工酶，其預處理復雜的分子以更快地轉化成要在生物質轉化法中使用的可發(fā)酵糖。例如，可以工程化改造轉基因玉米植物，其中轉基因玉米植物的穗軸具有通過下調淀粉水解酶實現(xiàn)的水平升高的淀粉，將轉基因植物進一步工程化改造成在穗軸或玉米種子中表達加工酶(例如alpha-淀粉酶、纖維素酶)，其中基本上如上文所描述的那樣發(fā)酵加有種子的全穗軸或自穗軸分離的種子?？梢栽谀肽ズ图庸l件后活化加工酶。另一個實施方案可以是如U. S. 2006/(^60011(通過提及而將其收入本文)中所描述的那樣工程化改造低木質素穗軸以具有水平升高的淀粉。具有提高量的淀粉的低木質素穗軸在青貯飼料、生物質轉化法中及在動物飼料中可以是有用的。糖化。在糖化(或酶促水解)中，通過存在于預處理材料中或外源添加的木質纖維素分解酶來將木質纖維素轉化成可發(fā)酵糖。糖化一般在攪拌罐反應器或發(fā)酵罐中在受控的PH、溫度、和混合條件下進行。糖化步驟可以持續(xù)多達200小時。糖化可以于約30°C至約65°C，特別是50°C左右的溫度，以及在范圍為約4和約5之間，特別是pH 4. 5左右的pH 實施。可以對全部預處理材料進行糖化。本申請的實施方案可以是進一步工程化改造具有增加的淀粉的穗軸以表達一種或多種加工酶，從而加速糖化或使該方法更有效。另一個實施方案可以是在方法中使用加有完整的仁的具有增加的淀粉含量的全穗軸以在玉米種子中表達一種或多種加工酶，并進行加有仁的全穗軸的糖化。可以在碾磨和加工條件后活化加工酶。發(fā)酵。在發(fā)酵步驟中，通過發(fā)酵微生物諸如酵母和/或細菌將由于預處理和酶促水解步驟而自木質纖維素釋放的糖發(fā)酵成一種或多種有機物質，例如乙醇。也可以在相同容器中，再次在受控的pH、溫度和混合條件下與酶促水解同時實施發(fā)酵。在相同容器中同時實施糖化和發(fā)酵時，方法一般稱作同時糖化和發(fā)酵或SSF?？梢越M合C6糖的SSF、C5和C6 糖的SSCF或同時糖化和共發(fā)酵。
發(fā)酵微生物及其在乙醇生產中的使用方法是本領域中已知的(Sheehan，“The road to Bioethanol :A strategic Perspective of the US Department of Energy' s National Ethanol Program，，于"Glucosyl Hydrolases For Biomass Conversion，，，ACS 研討會系列769，2001，美國化學學會Washington，D. C.)。利用玉米粒作為生物質的現(xiàn)有乙醇生產方法通常涉及使用酵母，特別是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株。可以在本發(fā)明的方法中利用此類菌株。雖然此類菌株對于從源自降解纖維素和/或淀粉的葡萄糖生成乙醇可以是優(yōu)選的，但是本發(fā)明的方法不依賴于特定微生物或其菌株，或所述微生物和所述菌株的任何特定組合的使用。通常將酵母或其它微生物添加至水解產物，并讓發(fā)酵進行M-96小時，諸如35-60 小時。發(fā)酵溫度通常在之間，諸如32°C，并在3和6之間的pH，諸如約pH 4_5?？梢允褂冒l(fā)酵刺激物來進一步改善發(fā)酵方法，特別是發(fā)酵微生物的性能，諸如速率增強和乙醇產率。供生長用的發(fā)酵刺激物包括維生素和礦物質。維生素的例子包括多種維生素、生物素、泛酸鹽、煙酸、內消旋肌醇、硫胺、吡哆醇、對氨苯甲酸、葉酸、核黃素、和維生素 A、B、C、D、禾口 E(Alfenore 等，“Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process”，2002，Springer-Verlag)。礦物質的例子包括礦物質和礦物鹽，其可以供應包含磷酸鹽、鉀、錳、硫、鈣、鐵、鋅、鎂和銅的營養(yǎng)物。回收。在發(fā)酵(或SSF)后，將醪液蒸餾以提取乙醇?？梢垣@得具有大于96體積％ 的純度的乙醇。組合的淀粉水解和纖維素分解材料水解?？梢栽谏婕敖M合的淀粉和纖維素材料水解的方法中使用本文中所公開的轉基因植物和植物部分以實現(xiàn)增加的乙醇產率。在提供提高的乙醇產率外，可以在現(xiàn)有的基于淀粉的乙醇加工廠中進行這些方法。淀粉是一種容易被水解成供發(fā)酵用的個別葡萄糖分子的葡萄糖聚合物。淀粉水解可以在存在淀粉分解微生物或酶諸如淀粉酶的情況中進行。在本發(fā)明的某些實施方案中， 淀粉水解在存在至少一種淀粉酶的情況中進行。合適的淀粉酶的例子包括alpha-淀粉酶 (其隨機切割直鏈淀粉的alpha(1-4)糖苷連接以產生糊精、麥芽糖或葡萄糖分子)和葡糖淀粉酶(其切割直鏈淀粉和支鏈淀粉的.alpha. (1-4)和.alpha. (1-6)糖苷連接以產生葡萄糖)。在發(fā)明方法中，淀粉的水解和纖維素材料的水解可以在相同條件下(例如在淀粉水解常用的條件下)同時地(即在同時)進行?；蛘撸夥磻梢孕蜇炦M行(例如木質纖維素的水解可以在淀粉水解前進行)。在同時水解淀粉和纖維素材料時，條件優(yōu)選地選擇為促進淀粉降解，并活化木質纖維素分解酶以降解木質纖維素。可以改變以優(yōu)化此類條件的因素包括對植物或植物部分的物理加工，和淀粉水解的反應條件諸如PH、溫度、粘度、加工次數(shù)、和淀粉酶的添加。該方法可以使用單獨的轉基因植物(或植物部分)或者非轉基因植物(或植物部分)和依照本發(fā)明轉化的植物(或植物部分)的混合物。合適的植物包括可以在基于淀粉的乙醇生產中采用的任何植物(例如玉米)。例如，可以使用本發(fā)明方法來提高來自玉米穗
軸的乙醇產率。本發(fā)明的植物在從植物生物質生成糖或生物燃料的生物質轉化法中得到應用。在本文中，術語“生物燃料”指源自收獲的植物部分的任何燃料。生物燃料包含但不限于生物柴油、植物油、生物醇(即乙醇、甲醇、丙醇、丁醇，等等)和沼氣(即甲烷)。工程化改造本發(fā)明的植物以在其穗軸組織中積累更高濃度的淀粉，如此提供碳水化合物的豐富來源，然后可以將所述碳水化合物轉化成生物燃料。在本文中，術語“游離糖”定義為源自植物生物質的任何碳水化合物，其可以進一步加工以生成可發(fā)酵糖、化學品、生物燃料、塑料、飼料添加劑或任何其它商業(yè)上重要的產品。本申請的一個實施方案提供了一種改善來自植物穗軸生物質的游離糖的產率的方法，包括操作植物以下調穗軸中的一種或多種淀粉降解酶的活性。所得的植物穗軸會含有水平升高的淀粉，然后可以在常規(guī)的生物質轉化法中將其轉化成游離糖。在本文中，術語“生物質轉化法”定義為將植物部分轉化成可發(fā)酵糖、生物燃料、 化學品、塑料、飼料添加劑、或任何其它商業(yè)上重要的產品的任何方法。生物質轉化法還可以包括本文中稱為“非動物飼料生物質轉化法”的亞種類。非動物飼料生物質轉化法定義為將植物部分轉化成不是以動物消耗為目的的可發(fā)酵糖、生物燃料、化學品和塑料的任何方法。本發(fā)明的組合物和方法可用于為果糖漿、特制糖生產右旋糖，及可用于通過淀粉發(fā)酵生成醇和其它終產物(例如有機酸、抗壞血酸、和氨基酸)(G.M. A van Beynum等編 (1985) Starch Conversion Technology,Marcel Dekker Inc. NY)。通過源自本發(fā)明植物的穗軸組織的淀粉的發(fā)酵實現(xiàn)的醇生成可以包括生成燃料醇或飲用醇。在某些優(yōu)選的實施方案中，醇會是乙醇。具體地，醇發(fā)酵生產方法以濕磨或干磨方法表征。在一些實施方案中，植物進行濕磨發(fā)酵方法，而在其它實施方案中，使用干磨方法。在某些實施方案中，可以使用粗淀粉水解方法來生成乙醇。另一個實施方案可以是在粗淀粉水解中利用的具有增加的淀粉含量且加有仁的全穗軸。另一個實施方案可以是在粗淀粉水解中添加一種或多種加工酶，所述粗淀粉水解含有具有增加的淀粉含量和仁的全穗軸。在其它實施方案中，可以將具有增加的淀粉含量且表達感興趣的加工酶的經研磨穗軸研磨，并以供動物飼料用或在生物質轉化法中使用的添加劑出售。谷粒干磨涉及許多基礎步驟，其通常包括研磨、煮、液化、糖化、發(fā)酵及液體和固體的分離以生成醇和其它共產物。研磨植物材料且特別是全谷物顆粒，諸如玉米、高粱、 小麥或黑麥。在一些情況中，可以首先將谷粒分級成組分部分?？梢阅肽ソ浹心サ闹参锊牧弦垣@得粗的或細的顆粒。將經研磨的植物材料與漿罐中的液體混合。將漿體與液化酶(例如alpha淀粉酶)一起在噴射式蒸煮鍋中進行高溫以將谷物中的淀粉溶解并水解成糊精。將混合物冷卻，并用糖化酶進一步處理以生成葡萄糖。然后，在存在發(fā)酵微生物諸如乙醇生成微生物且特別是酵母(酵母屬的種)的情況中將含有葡萄糖的醪液發(fā)酵約 M至120小時。從液相分離醪液中的固體，并獲得醇諸如乙醇和有用的共產物諸如酒糟 (distillers'grains)。在一個實施方案中，對干磨廠添加具有增加的淀粉的穗軸可以在動物飼料和可用的營養(yǎng)物方面提高DDGS的質量。在一些實施方案中，組合糖化步驟和發(fā)酵步驟，并且該方法稱為同時糖化和發(fā)酵或同時糖化、酵母增殖和發(fā)酵。在其它實施方案中，可以消除煮步驟或將含有穗軸淀粉的底物暴露于在底物中的淀粉的凝膠化溫度上的溫度。在一些實施方案中的這些發(fā)酵方法包括碾磨谷物顆?；蚍旨壍墓攘?，并組合經研磨的谷物顆粒與液體以形成漿體，然后將其在單一容器中與淀粉酶、葡糖淀粉酶、和/或具有顆粒狀淀粉水解活性的其它酶和酵母混合以生成乙醇和其它共產物(美國專利No. 4，514，496、WO 04/081193和WO 04/08092 。在一些實施方案中， 可用于發(fā)酵方法的酶包括alpha淀粉酶、蛋白酶、支鏈淀粉酶、異淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、環(huán)糊精糖基轉移酶、脂肪酶、肌醇六磷酸酶、漆酶、氧化酶、酯酶、角質酶 (cutinase)、顆粒狀淀粉水解酶和其它葡糖淀粉酶。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及經轉化的植物，其基因組用與啟動子序列可操作連接的編碼至少一種加工酶的重組多核苷酸提升(argument)，該多核苷酸的序列為了在植物中表達而進行優(yōu)化。創(chuàng)建具有增加的穗軸淀粉的植物可以是有益的，所述植物已經進行過進一步的修飾以表達加工酶，其在活化時會能夠自我加工其起作用的底物以獲得期望的結果，如記載于US20030135885和US7102057的，通過提及而將其收入本文。在本文中， 具有增加的淀粉并用加工酶進一步修飾的穗軸稱為“具有增加的淀粉含量的自我加工的穗軸”。提供了生成具有增加的淀粉含量的自我加工穗軸的方法，其中植物或植物部分表達加工酶(例如alpha-淀粉酶、葡糖淀粉酶、纖維素酶、CBHI，等等)，其中在加工酶(嗜溫性、 嗜熱性、或超嗜熱性)的活化(例如碾磨、加水、PH)后，植物或植物部分能夠自我加工其起作用的底物以獲得期望的結果。在一些實施方案中，可以在具有增加的穗軸淀粉的玉米植物的其它植物部分(例如種子或綠色組織)中表達加工酶，其中與具有增加的淀粉的穗軸一起加工所述其它植物部分，如此使酶在加工后與穗軸淀粉接觸。在另一個實施方案中，可以期望在一種作物植物中表達一種或多種加工酶，并在玉米植物中下調淀粉降解酶以生成具有增加的淀粉含量的穗軸。然后，可以將這些給料在生物質轉化法中混合，其中加工酶會與其各自的底物接觸，并在將兩種給料加工(例如碾磨和混合)成單一液化后活化。依照本發(fā)明，“自我加工”植物或植物部分已經將分離的多核苷酸摻入其中，所述分離的多核苷酸編碼能夠加工，例如修飾植物中的淀粉、多糖、脂質、蛋白質等的加工酶，其中加工酶可以是嗜溫性、嗜熱性或超嗜熱性的，而且可以通過研磨、加水、加熱、或在其它情況中提供對于酶功能有利的條件來活化。將編碼加工酶的分離的多核苷酸整合入植物或植物部分中以在其中表達。在表達并活化加工酶后，本發(fā)明的植物或植物部分加工加工酶起作用的底物。因此，本發(fā)明的植物或植物部分能夠在沒有或具有減少的加工這些底物通常所需要的外部來源的情況中在活化其中含有的加工酶后自我加工酶的底物。因此，經轉化的植物、經轉化的植物細胞、和經轉化的植物部分具有經由依照本發(fā)明摻入其中的酶來加工期望的底物的“嵌入的”加工性能。優(yōu)選地，編碼加工酶的多核苷酸是“遺傳穩(wěn)定的”，即多核苷酸在本發(fā)明的經轉化的植物或植物部分中得到穩(wěn)定維持，并經由連續(xù)世代被后代穩(wěn)定繼承。依照本發(fā)明，采用此類植物和植物部分的方法可以消除在回收淀粉來源的產物前對碾磨或以其它方式物理破壞植物部分的完整性的需要。例如，本發(fā)明提供了用于加工穗軸以回收淀粉來源的產物的改良的方法。本發(fā)明還提供了一種容許回收淀粉顆粒的方法， 所述淀粉顆粒在顆粒中或上含有足以在不需要添加外源生成的淀粉水解酶的情況中水解淀粉內的特定鍵的淀粉降解酶水平。本發(fā)明還提供了來自通過本發(fā)明的方法獲得的自我加工植物或植物部分的改善的產物。另外，“自我加工的”經轉化的植物部分(例如穗軸)和經轉化的植物避免關于現(xiàn)有技術的主要問題，即加工酶通常是通過微生物發(fā)酵生成的，這需要花錢自培養(yǎng)物上清液分離酶；分離的酶需要針對特定應用進行配制，并且必須開發(fā)添加酶、使酶與其底物混合和起反應的方法和儀器。本發(fā)明的經轉化的植物或其部分也是加工酶自身及所述酶的底物和產物諸如糖、氨基酸、脂肪酸和淀粉和非淀粉多糖的來源。也可以采用本發(fā)明的植物來制備后代植物諸如雜種和近交物。植物可以是單子葉植物，諸如玉米。優(yōu)選地，植物是能源作物或商業(yè)上種植的植物。在本文中，術語“加工酶”選自下組α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖異構酶、葡聚糖酶、β-淀粉酶、α-葡糖苷酶、異淀粉酶、支鏈淀粉酶、新支鏈淀粉酶(neo-pul Iulanase)、 異支鏈淀粉酶、淀粉支鏈淀粉酶(amylopullulanase)、纖維素酶、外_1，4_β -纖維素生物水解酶、外-I，3_i3-D-葡聚糖酶、β-糖苷酶、內切葡聚糖酶、L-阿拉伯糖酶、α-阿拉伯糖苷酶、半乳聚糖酶、半乳糖苷酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、木糖苷酶、蛋白酶、 葡聚糖酶、酯酶、肌醇六磷酸酶、和脂肪酶。優(yōu)選地，加工酶是一種選自下組的淀粉加工酶 α -淀粉酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖異構酶、β -淀粉酶、α -葡糖苷酶、異淀粉酶、支鏈淀粉酶、 新支鏈淀粉酶、異支鏈淀粉酶、和淀粉支鏈淀粉酶。更優(yōu)選地，該酶選自α-淀粉酶、纖維素酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖異構酶、葡萄糖異構酶、α-葡糖苷酶、和支鏈淀粉酶。加工酶進一步優(yōu)選地是超嗜熱的。依照本發(fā)明的此方面，酶可以是選自下組的非淀粉降解酶蛋白酶、 葡聚糖酶、木聚糖酶、酯酶、肌醇六磷酸酶、和脂肪酶。此類酶可以進一步是超嗜熱的。在一個優(yōu)選的實施方案中，酶在植物的液泡、內質網、質外體、蛋白質貯存液泡、線粒體、葉綠體、淀粉粒、種子或細胞壁中積累。此外，在另一個實施方案中，可以用包含非超嗜熱酶的第二重組多核苷酸來進一步提升植物的基因組。在另一個實施方案中，可以期望使用諸如WO 2005/097999中提及的那些方法通過下調淀粉合酶IV和/或淀粉磷酸化酶來提高具有增加的淀粉的穗軸中的淀粉粒大小。在另一個實施方案中，可以期望修飾穗軸淀粉以生成獨特的糖譜。說明書中提及的所有出版物和專利申請指明本發(fā)明所屬領域中的技術人員的技術水平。通過提及而將所有出版物和專利申請收入本文，其程度就像明確且個別指明通過提及而收入每篇個別的出版物或專利申請一樣。雖然為了理解清楚，已經通過例示和例子相當詳細地描述了前述發(fā)明，但是應當明顯的是，可以在所附權利要求書的范圍內實施某些變化和修飾。
實施例本發(fā)明會通過以下實施例來進一步描述，所述實施例并不意圖以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實施例1 轉基因玉米植物的生成構建8種RNAi盒來進行植物表達。這些盒設計為在玉米穗軸組織中下調酶α -淀粉酶、β-淀粉酶、葡聚糖水雙激酶(Rl)、磷酸葡聚糖水雙激酶(PWD)、和葉綠體α-淀粉酶(ΑΜΥ3)。α -淀粉酶(Genbank 登錄號 L25805)、β -淀粉酶(Genbank 登錄號 Ζ25871) 和α-葡聚糖水雙激酶(R1 ,Genbank登錄號CD973834)的玉蜀黍cDNA序列獲自NCBI。基于針對玉米基因組序列的序列同源性來生成擬南芥葉綠體磷酸葡聚糖水雙激酶(GenBank 登錄號AJ63M27)的玉米直向同系物。同樣地，基于針對玉米基因組序列的序列同源性來生成擬南芥Amy3 (GenBank登錄號匪105651)的玉米直向同系物。來自各基因的編碼區(qū)的 3，端的 RNAi 片段 G95bp 的 α -淀粉酶，SEQ ID NO 1 ；500bp 的 β -淀粉酶，SEQ ID NO 2 ；330bp 的 Rl，SEQ ID NO 3 ；320bp 的 PWD，SEQ ID NO :4 ；禾口 320bp 的 AMY3，SEQ ID NO 5)是由Geneart (Geneart AG)合成的。在合成過程中，分別將attBl和attB2位點添加至這8種RNAi序列的5’和3’端。另外，在相對于RNAi序列的相應鏈上合成來自稻蔗糖合酶-I(Rkl)基因的內含子以在通過與相應的RNAi片段配對形成的發(fā)夾環(huán)中充當間隔物， 如此為酶切丁酶(dicer)提供結合區(qū)。使用來自Gateway 克隆技術(Invitrogen Life Science)的BP反應將所有8種RNAi表達盒重組入pD0NR221中。目的載體15910是一種含有磷酸甘露糖異構酶(PMI)基因的二元載體，所述磷酸甘露糖異構酶(PMI)基因容許用甘露糖選擇轉基因細胞。載體15910還提供了使用 Gateway 克隆技術(Invitrogen Life Science)來生成RNAi盒的方法。另夕卜，目的載體 15910含有雙轉錄增強子(玄參花葉病毒(FMV)增強子)及花椰菜花葉病毒3 增強子。 載體15910容許改變多種驅動RNAi盒在玉米穗軸組織中表達的啟動子的手段。用于此研究的啟動子是稻MADS-框13 (OsMADS 13)啟動子、玉米色氨酸合酶alpha亞基(TrpA)啟動子、MADS-框14(OsMADS 14)啟動子和玉米Zm015970啟動子。已經顯示了進一步記載于公開文本US 2007/0006；34并在SEQ ID NO :6中描述的稻MADS-框13 (OsMADS 13)啟動子優(yōu)選地在玉米穗軸組織中表達基因。預期如記載于Plant Mol Bio (1995) 27 :1183-1188的并如SEQ ID NO :7中所描述的玉米色氨酸合酶alpha亞基(TrpA)啟動子優(yōu)選在玉米植物的木髓和幼葉中驅動表達。如公開文本U. S. 2007/0006344中所描述的并在SEQ I. D. NO 9中所描述的0sMADS14啟動子優(yōu)選地驅動轉基因在玉米穗軸組織中的表達?；谟衩孜㈥嚵袛?shù)據將如SEQ ID N0:8中所描述的玉米啟動子Zm015970鑒定為穗軸優(yōu)選性強啟動子。與非穗軸組織相比由玉米穗軸中的ZmO 15970驅動的基因表達水平的比率是約7. 9。ZmO 15970 的啟動子序列由Zm015970基因組克隆的2009bp 5，UTR、510bp的基因第一外顯子、132bp 的第一內顯子、和19bp的第二外顯子組成。使用LR 反應(Gateway LR Clonase 酶混合物，Invitrogen)來將由 Geneart 創(chuàng)建的(Gateway進入RNAi盒(SEQ ID#s 10-17)重組入載體15910中，創(chuàng)建二元載體。通過限制性消化和測序來證實二元載體。進行未成熟玉米胚的轉化，基本上如記載于Negrotto等，Plant Cell Reports 19:798-803(2000)的?？梢蕴鎿Q其中所描述的多種培養(yǎng)基組分。于將含有植物轉化質粒的土壤桿菌菌株LBA4404 (Invitrogen)在YEP (酵母提取物(5g/L)、胨(10g/L) ,NaCl (5g/L)、15g/l瓊脂，pH 6. 8)固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2至4天。 將約0. 8X 109 (0. 8X IO9)個土壤桿菌在補充有IOOmM乙酰丁香酮(As)的LS_inf培養(yǎng)基 (LSAs 培養(yǎng)基)(Negrotto 等，Plant Cell Rep 19 :798-803(2000))中懸浮。將細菌在此培養(yǎng)基中預誘導30-60分鐘。從8-12天齡穗切出來自玉米系A188或其它合適的玉米基因型的未成熟胚，進入液體LS-inf+lOOmMAs (LSAs)。將胚渦旋振蕩5秒，并用新鮮的感染培養(yǎng)基漂洗一次。除去感染培養(yǎng)基，然后添加土壤桿菌溶液，并將胚渦旋振蕩30秒，并容許其與細菌一起沉降5分鐘。然后，將胚在盾片側向上的情況中轉移到LSAs培養(yǎng)基，并在黑暗中培養(yǎng)2-3天。隨后， 將每塊培養(yǎng)板20- 個胚轉移至補充有頭孢噻肟(250mg/l)和硝酸銀(1. 6mg/l)的LSDc培養(yǎng)基(Negrotto 等，Plant Cell Rep 19 :798-803 Q000))，并于在黑暗中培養(yǎng) 10 天。將生成胚發(fā)生愈傷組織的未成熟胚轉移至LSD1M0. 5S培養(yǎng)基(具有替換麥草畏(Dicamba)的0. 5mg/l 2，4_D、10g/l甘露糖、5g/l蔗糖而無硝酸銀的LSDc)。在此培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)物達6周，其中在3周時進行傳代培養(yǎng)步驟。將存活的愈傷組織轉移至要擴大的LSD1M0.5S培養(yǎng)基或Regl培養(yǎng)基(如記載于Negrotto等，Plant Cell Rep 19 :798-803(2000)的)。在光(16小時光/8小時黑暗方案)中培養(yǎng)后，然后將綠色組織轉移至沒有生長調節(jié)劑的Reg2培養(yǎng)基(如記載于Negrotto等，Plant Cell Rep 19: 798-803 (2000)的)，并溫育1_2周。將小植物轉移至含有Reg3培養(yǎng)基(如記載于Negrotto 等 Q000)的)的 Magenta GA-7 盒(Magenta Corp, Chicago 111.)，并在光中培養(yǎng)。將在 PMI和iOsSHlil-Ol (環(huán))方面呈PCR陽性和在大觀霉素方面呈陰性的植物轉移至土壤，并在溫室中培養(yǎng)。將總共267個T°植物種植至成熟(表幻。收集選定事件的植物樣品以進行Lugol氏染色、淀粉分析和發(fā)酵分析。表1 在玉米穗軸組織中表達RNAi盒的構建體
構建體表達盒(啟動子和基因)17303OsMADS 13+alpha-淀粉酶17304OsMADS 13+beta-淀粉酶173050sMADS13+Rl18278OsMADS13+PWD18222OsMADS13+AMY318286TrpA+Rl183640sMADS14+Rl18288Zm015970+Rl表2 帶到溫室至成熟的Τ°事件的數(shù)目。
構建體轉移至溫室的T°的數(shù)目1730340(38L+2M)1730439(38L+1M)1730537(26L+11M)1827829(4N+10L+7M+8H)
權利要求
1.一種用于增加玉米植物的穗軸組織中的淀粉含量的方法，包括a)將表達盒插入玉米植物細胞中，所述玉米植物細胞包含與確保在玉米穗軸組織中轉錄的調節(jié)元件可操作連接的多核苷酸，其中所述多核苷酸的表達降低玉米穗軸組織中的一種或多種內源淀粉降解酶的活性；b)自a)的玉米植物細胞再生轉基因玉米植物；并c)生成具有增加的淀粉含量的所述穗軸組織。
2.權利要求1的方法，其中所述內源淀粉降解酶選自下組alpha-淀粉酶、葡聚糖水雙激酶、磷酸葡聚糖水雙激酶、極限糊精酶、異淀粉酶、beta-淀粉酶、葉綠體葡聚糖磷酸化酶、 歧化酶、葉綠體麥芽糖轉運蛋白(Mexl)、葉綠體葡萄糖轉運蛋白和葉綠體丙糖磷酸轉運蛋白。
3.權利要求1的方法，其中所述內源淀粉降解酶選自下組alpha-淀粉酶、葡聚糖水雙激酶、PWD、AMY3和beta-淀粉酶。
4.權利要求1的方法，其中所述內源淀粉降解酶是葡聚糖水雙激酶。
5.權利要求1的方法，其中所述內源淀粉降解酶是alpha-淀粉酶。
6.權利要求1的方法，其中所述降低一種或多種淀粉降解酶活性的多核苷酸是RNAi。
7.權利要求1的方法，其中所述多核苷酸與穗軸組織優(yōu)選性啟動子可操作連接。
8.權利要求7的方法，其中所述多核苷酸與OsMADS啟動子可操作連接。
9.權利要求8的方法，其中所述多核苷酸與選自下組的啟動子之任一種可操作連接 OsMADS 13啟動子、0sMADS14啟動子、TrpA啟動子或Zm015970啟動子。
10.權利要求7的方法，其中在動物飼料中使用所述具有增加的淀粉含量的穗軸。
11.一種改善來自供生物質轉化法用的植物生物質的游離糖的產率的方法，所述方法包括a)將表達盒插入玉米植物細胞中，所述玉米植物細胞包含與確保在玉米穗軸組織中轉錄的調節(jié)元件可操作連接的多核苷酸，其中所述多核苷酸的表達降低玉米穗軸組織中的一種或多種內源淀粉降解酶的活性；b)自a)的玉米植物細胞再生轉基因玉米植物；并c)在所述多核苷酸得到表達的條件下種植所述轉基因玉米植物，其中所述多核苷酸的表達導致所述植物的穗軸組織中的淀粉含量增加，并d)在生物質轉化法中使用所述轉基因玉米植物。
12.權利要求11的方法，其中所述內源淀粉降解酶選自下組alpha-淀粉酶、葡聚糖水雙激酶、磷酸葡聚糖水雙激酶、極限糊精酶、異淀粉酶、beta-淀粉酶、葉綠體葡聚糖磷酸化酶、歧化酶、葉綠體麥芽糖轉運蛋白(Mexl)、葉綠體葡萄糖轉運蛋白和葉綠體丙糖磷酸轉運蛋白。
13.權利要求11的方法，其中所述內源淀粉降解酶選自下組alpha淀粉酶、葡聚糖水雙激酶、PWD、AMY3和beta-淀粉酶。
14.權利要求11的方法，其中所述內源淀粉降解酶是葡聚糖水雙激酶。
15.權利要求11的方法，其中所述內源淀粉降解酶是alpha-淀粉酶。
16.權利要求11的方法，其中所述多核苷酸與穗軸組織優(yōu)選性啟動子可操作連接。
17.權利要求16的方法，其中所述多核苷酸與OsMADS啟動子可操作連接。
18.權利要求17的方法，其中所述多核苷酸與選自下組的啟動子之任一種可操作連接0sMADS13啟動子、0sMADS14啟動子、TrpA啟動子或Zm015970啟動子。
19.權利要求11的方法，其中所述植物細胞進一步包含與確保在植物細胞中轉錄的調節(jié)元件可操作連接的第二多核苷酸，其中所述第二多核苷酸的表達編碼加工酶，并且表達所述加工酶，使得它不與其底物接觸。
20.權利要求11的方法，其中所述植物進一步包含與確保在植物細胞中轉錄的調節(jié)元件可操作連接的多核苷酸，其中所述多核苷酸的表達降低植物綠色組織中的一種或多種內源淀粉降解酶的活性，其中所述綠色組織具有增加的淀粉含量。
21.權利要求11的方法，其中所述生物質轉化法是非動物飼料生物質轉化法。
22.權利要求20的方法，其中所述非動物飼料生物質轉化法將碳水化合物轉化成一種或多種生物燃料。
23.一種生成具有增加的淀粉的自我加工穗軸的方法，包括a)將第一多核苷酸插入玉米植物細胞中，所述玉米植物細胞包含與確保在玉米穗軸組織中轉錄的調節(jié)元件可操作連接的第一多核苷酸，其中所述第一多核苷酸的表達降低穗軸組織中的一種或多種內源淀粉降解酶的活性；b)將第二多核苷酸插入所述玉米植物細胞中，所述玉米植物細胞包含與確保在植物細胞中轉錄的調節(jié)元件可操作連接的第二多核苷酸，其中所述多核苷酸的表達編碼加工酶；c)自b)的植物細胞再生轉基因植物；并d)生成所述具有增加的淀粉的自我加工穗軸。
24.權利要求23的方法，其中所述內源淀粉降解酶選自下組alpha-淀粉酶、葡聚糖水雙激酶、磷酸葡聚糖水雙激酶、極限糊精酶、異淀粉酶、beta-淀粉酶、葉綠體葡聚糖磷酸化酶、歧化酶、葉綠體麥芽糖轉運蛋白(Mexl)、葉綠體葡萄糖轉運蛋白和葉綠體丙糖磷酸轉運蛋白。
25.權利要求23的方法，其中所述內源淀粉降解酶選自下組alpha-淀粉酶、葡聚糖水雙激酶、PWD、AMY3和beta-淀粉酶。
26.權利要求23的方法，其中所述內源淀粉降解酶是葡聚糖水雙激酶。
27.權利要求23的方法，其中所述內源淀粉降解酶是α-淀粉酶。
28.權利要求23的方法，其中所述加工酶選自下組alpha-淀粉酶和纖維素酶。
29.權利要求23的方法，其中在生物質轉化法中使用所述穗軸組織。
30.權利要求23的方法，其中所述加工酶與穗軸優(yōu)選性啟動子可操作連接。
31.權利要求23的方法，其中所述加工酶與種子優(yōu)選性啟動子可操作連接。
32.權利要求23的方法，其中所述加工酶與綠色組織優(yōu)選性啟動子可操作連接。
33.權利要求23的方法，其中所述第一和第二多核苷酸位于同一表達盒上。
34.權利要求23的方法，其中所述第一和第二多核苷酸位于分開的表達盒上。
35.一種用于生成青貯飼料的方法，包括a)將表達盒插入植物細胞中，所述植物細胞包含與確保在植物細胞中轉錄的調節(jié)元件可操作連接的多核苷酸，其中所述多核苷酸的表達降低穗軸組織中的一種或多種內源淀粉降解酶的活性；b)自b)的植物細胞再生轉基因植物；并c)生成具有增加的淀粉含量的穗軸組織；d)青貯所述具有增加的淀粉含量的穗軸組織以制成青貯飼料。
36.權利要求35的方法，其中所述青貯飼料作為動物飼料使用。
37.權利要求35的方法，其中所述青貯飼料在生物質轉化法中使用。
38.權利要求35的方法，其中所述植物進一步包含與確保在植物細胞中轉錄的調節(jié)元件可操作連接的多核苷酸，其中所述多核苷酸的表達降低植物綠色組織中的一種或多種內源淀粉降解酶的活性，其中所述綠色組織具有增加的淀粉含量。
39.權利要求35的方法，其中所述穗軸進一步包含加工酶。
40.權利要求35的方法，其中所述穗軸進一步包含肌醇六磷酸酶。
41.一種穗軸優(yōu)選性啟動子，其與SEQ ID而14具有至少70%、80%、85%、90%、 95%、99%或100%序列同一性。
42.一種分離的玉米(Zm015970)啟動子序列，其由SEQ ID N0:14組成。
43.一種用于指導靶基因在玉米穗軸組織中表達的方法，該方法包括使玉米植物與靶基因接觸，所述靶基因與包含SEQ ID NO 8, SEQ ID N0:14或其活性片段的Zm015970啟動子序列可操作連接；并將靶基因導入所述植物中，所述靶基因與包含 SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 14或其活性片段的Zm015970啟動子序列可操作連接，其中所述 Zm015970啟動子指導所述靶基因在玉米穗軸組織中的表達。
全文摘要
提供了用于增加植物的穗軸組織中的淀粉含量的方法和組合物。該方法包括下調植物中的淀粉降解酶的活性。本發(fā)明的所得的轉基因植物在穗軸組織中具有增加的淀粉含量。在一個實施方案中，該方法牽涉在穗軸組織中操作單子葉植物以下調淀粉降解酶的活性。該植物可用于改善來自植物生物質的游離糖的產率。
文檔編號A01H5/00GK102405291SQ201080017226
公開日2012年4月4日 申請日期2010年2月24日 優(yōu)先權日2009年2月25日
發(fā)明者J.斯蒂芬斯 申請人:先正達參股股份有限公司