專利名稱：胚乳中有效的植物啟動(dòng)子及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含植物有效的啟動(dòng)子序列及其衍生的調(diào)節(jié)序列的物質(zhì)組合物，并涉及此類組合物，特別地在發(fā)育的胚乳中賦予基因表達(dá)的用途。
背景技術(shù)：
相關(guān)領(lǐng)域的描述到目前為止，已經(jīng)因?yàn)槎喾N原因基因修飾了植物，包括例如通過表達(dá)抗真菌或抗細(xì)菌蛋白質(zhì)賦予蟲害抗性，或者例如通過調(diào)節(jié)果實(shí)成熟改良農(nóng)藝性狀，或者在雜交植物中誘導(dǎo)不育，或用于大規(guī)族生產(chǎn)用于工業(yè)、藥物、獸醫(yī)和農(nóng)業(yè)用途的蛋白質(zhì)。在這方面，生物技術(shù)研究的進(jìn)展已經(jīng)產(chǎn)生了涉及大量經(jīng)鑒定的核酸信息的爆炸，所述核酸，如果合適地表達(dá)， 對產(chǎn)生改良的植物是有用的，例如，抗收獲前發(fā)芽植物、具有改良的營養(yǎng)特性的植物、具有藥物特性的植物、控制了繁殖發(fā)育的植物、具有改變的形狀或大小特征的植物、收獲后能快速再生的植物、或者具有對病原體改良的抗性的植物等等。然而，與農(nóng)業(yè)上重要的植物如農(nóng)作物的基因改良有關(guān)的問題是，基因表達(dá)的操縱產(chǎn)生了顯示出新特征的植物。在這方面，通常期望的是在植物的一個(gè)或多個(gè)特定的細(xì)胞類型、組織或器官中，或者在特定的環(huán)境或發(fā)育條件下優(yōu)先性或選擇性表達(dá)，或者特異性表達(dá)，而不是組成型地表達(dá)在植物中待表達(dá)的核酸。此外，隨著更多有希望的農(nóng)藝學(xué)或藥物價(jià)值的基因變得可用，對于具有多基因轉(zhuǎn)化植物的需求將會(huì)呈指數(shù)增長。這些多外源基因一般必須受分別的調(diào)節(jié)序列控制，以提供合適的表達(dá)水平和模式，其對于待表達(dá)的每一結(jié)構(gòu)基因或其他轉(zhuǎn)基因可以是不相同的。例如，在轉(zhuǎn)基因生物中，一些基因可能需要組成型地表達(dá)，而其他基因需要在某些發(fā)育階段或部位表達(dá)。因此，需要多種具有不同作用的調(diào)節(jié)序列。如在說明書和權(quán)利要求中所用，“優(yōu)先地(preferentially) ”意為啟動(dòng)子在植物的一種或多種特定的細(xì)胞類型、組織或器官中或者在特定的環(huán)境或發(fā)育條件下比其在一種或多種其他細(xì)胞、組織或器官中或者在另一條件下賦予與其有效連接的核酸更大程度或更高水平的表達(dá)。然而，術(shù)語“優(yōu)先地”并不將核酸的表達(dá)限于植物的一種或多種特定的細(xì)胞類型、組織或器官或者在特定的環(huán)境或發(fā)育條件下。相反地，僅需要將表達(dá)水平增加到更高的水平，和優(yōu)選地顯著地增加?！斑x擇性地”意為啟動(dòng)子在植物的一個(gè)或多個(gè)特定細(xì)胞類型、組織或器官中，或者在特定的環(huán)境或發(fā)育條件下賦予與其有效連接的核酸的表達(dá)?！疤禺愋缘亍币鉃閷ｉT地。如本說明書中和隨后的權(quán)利要求中所用，并且除非文中另外說明，詞語“賦予”和其變化形式如“賦予的”應(yīng)當(dāng)意為啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物，例如在其他因子如DNA構(gòu)象和/或順式作用DNA序列和/或反式作用因子和/或信號通路和/或轉(zhuǎn)錄物結(jié)構(gòu)和/ 或轉(zhuǎn)錄物加工的情況下，在應(yīng)答一個(gè)或多個(gè)發(fā)育和/或環(huán)境和/或激素和/或其他刺激時(shí)產(chǎn)生與該啟動(dòng)子或活性片段或衍生物有效連接的核酸的表達(dá)或者表達(dá)模式的能力，所述一個(gè)或多個(gè)發(fā)育和/或環(huán)境和/或激素和/或其他刺激可以正常誘導(dǎo)與在其天然情況下的該啟動(dòng)子有效連接的核酸的表達(dá)或表達(dá)模式。如本說明書中和隨后的權(quán)利要求中所用，術(shù)語“啟動(dòng)子”應(yīng)取其廣義并包括典型基因組基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，包括含有TATA框的基礎(chǔ)啟動(dòng)子調(diào)節(jié)區(qū)和任選的其他調(diào)節(jié)元件 (例如，上游激活序列、增強(qiáng)子和沉默子)，所述TATA框?qū)τ谛枰虿恍枰狢CAAT框序列的轉(zhuǎn)錄起始是必須的，所述其他調(diào)節(jié)元件在應(yīng)答發(fā)育和/或激素和/或環(huán)境刺激時(shí)，或者以組織特異性或細(xì)胞類型特異性方式改變基因表達(dá)。啟動(dòng)子通常但并非必須位于結(jié)構(gòu)基因的上游或5’，在所述結(jié)構(gòu)基因上其賦予表達(dá)。此外，包含啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)元件通常位于植物基因轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)的21Λ內(nèi)。如本說明書中和隨后的權(quán)利要求中所用，并且除非文中另外指明，詞語“包含”或其變化形式如“含有”或“包含的”應(yīng)理解為指包括指定的步驟或元件或整體或者步驟或元件或整體的組群，但并不排除任一其他步驟或元件或整體或者元件或整體的組群。如本說明書中和隨后的權(quán)利要求中所用，術(shù)語“活性片段”，在涉及啟動(dòng)子的情況下應(yīng)指啟動(dòng)子的片段或區(qū)域或部分，其保留了其來源的啟動(dòng)子起始轉(zhuǎn)錄的能力。此類活性片段不需要以與其來源的啟動(dòng)子相同的方式，賦予與其有效連接的核酸表達(dá)和表達(dá)模式。 例如，啟動(dòng)子的活性片段比其來源的啟動(dòng)子誘導(dǎo)更高或更低程度的核酸表達(dá)水平。備選地或另外地，啟動(dòng)子的活性片段在與其來源的啟動(dòng)子賦予表達(dá)的細(xì)胞、組織或器官不同的細(xì)胞、組織或器官中，或者在更少的組織中或其他的細(xì)胞、組織或器官中賦予表達(dá)。鑒定此種活性片段的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員和/或本文中所述是顯而易見的。如本說明書中和隨后的權(quán)利要求中所用，術(shù)語“衍生物”，在涉及啟動(dòng)子的情況下， 應(yīng)當(dāng)指來源于如本文中所述根據(jù)任一實(shí)施方案的啟動(dòng)子的啟動(dòng)子，例如，包含一個(gè)或多個(gè)其他調(diào)節(jié)元件的啟動(dòng)子，以例如增加或降低或者另外地控制與其有效連接的核酸的表達(dá)。 本發(fā)明也包括包含與另一啟動(dòng)子連接的如本文所述根據(jù)任一實(shí)施方案的啟動(dòng)子的衍生物， 例如，雙向啟動(dòng)子。在這方面，其他啟動(dòng)子也可以是如本文所述根據(jù)任一實(shí)施方案的啟動(dòng)子。術(shù)語“衍生物”也包括包含其序列與如本文所述根據(jù)任一實(shí)施方案的啟動(dòng)子有關(guān)的變體的啟動(dòng)子。例如，此種衍生物的序列可以包括一個(gè)或多個(gè)以下變異在特定限制酶位點(diǎn)的刪除、插入、單點(diǎn)或多點(diǎn)突變或者改變，只要衍生的啟動(dòng)子保留了起始和/或抑制與其連接的核酸的轉(zhuǎn)錄的能力。如本說明書中和隨后的權(quán)利要求中所用，術(shù)語“表達(dá)(expression) ”或類似的術(shù)語如“表達(dá)(express) ”應(yīng)當(dāng)至少(de minimis)指核酸的轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生RNA，并任選地包括該轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄RNA的后續(xù)翻譯以產(chǎn)生肽、多肽或蛋白質(zhì)。該定義并不限于任一特定的細(xì)胞背景， 并包含例如使用體外表達(dá)系統(tǒng)或者在分離的細(xì)胞、組織或器官中獲得的此種表達(dá)。類似地，“表達(dá)模式”指如上文所定義的表達(dá)的時(shí)間、水平、細(xì)胞定位、亞細(xì)胞定位、 組織選擇性或器官選擇性中的一個(gè)或多個(gè)，包括在一種細(xì)胞、組織或器官中與另一細(xì)胞、組織或器官比較的相對表達(dá)，并包括如在不同的發(fā)育階段或?qū)Σ煌沫h(huán)境或激素刺激應(yīng)答時(shí)，表達(dá)的相對水平或相對時(shí)間。
如本說明書中和隨后的權(quán)利要求中所用，術(shù)語“有效的”應(yīng)當(dāng)理解為指規(guī)定的完整事物(stated integer)在特定的情況下發(fā)揮作用的能力，雖然并非必需在該規(guī)定的情況下。如本說明書中和隨后的權(quán)利要求中所用，術(shù)語“有效連接”和“與......有效連
接”意為本發(fā)明的啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物的位置與另一核酸(例如，轉(zhuǎn)基因包括結(jié)構(gòu)基因、開放閱讀框、報(bào)告基因、或編碼核酶、小核酶、RNAi分子或其他RNA的核酸)在空間上相關(guān)，從而通過該啟動(dòng)子、活性片段或衍生物賦予所述其他核酸的表達(dá)。因此，啟動(dòng)子、活性片段或衍生物與其他核酸的相對位置產(chǎn)生了賦予其他核酸功能性表達(dá)模式的結(jié)構(gòu)。啟動(dòng)子一般位于其控制表達(dá)的核酸的5’(上游)。為了構(gòu)建異源的啟動(dòng)子/核酸組合(例如， 啟動(dòng)子/轉(zhuǎn)基因和/或啟動(dòng)子/選擇標(biāo)記基因組合)，一般優(yōu)選地，啟動(dòng)子的位置與基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)之間的距離與該啟動(dòng)子與在其天然情況下控制的核酸(即啟動(dòng)子源自的基因) 之間的距離大約相同。如本領(lǐng)域已知，在不丟失啟動(dòng)子功能的情況下，可以對該距離進(jìn)行一些改變。如本說明書中和隨后的權(quán)利要求中所用，術(shù)語“天然情況(native context) ”在本文中應(yīng)當(dāng)意為在植物基因組中，啟動(dòng)子天然存在的基因組基因，即，該啟動(dòng)子分離自的基因組基因。使用從例如在 National Institutes of Health of the Government of the United States of America Bethesda,MD, 20894,National Library of Medicine 的 National Center for Biotechnology Information (NCBI)可得至Ij的序列分析軟件，可以鑒定和/或序列比對啟動(dòng)子天然定位的基因組基因。在被子植物中，種子胚乳形成了胚的營養(yǎng)組織。例如，谷物的胚乳來源于細(xì)胞化 (cellularisation)前的一系列游離核分裂，并隨后形成一系列的功能性細(xì)胞區(qū)域。該組織在結(jié)構(gòu)和發(fā)育方面是復(fù)雜的，特別是在谷物中。通過生長胚乳攝取同化物，在種子發(fā)育中是關(guān)鍵的過程。胚乳的中心區(qū)域由大量的空泡細(xì)胞組成，其儲(chǔ)存淀粉儲(chǔ)備物和高度豐富的貯藏蛋白。期望將在胚乳中表達(dá)重組核酸的能力用于產(chǎn)生例如用于藥物或工業(yè)目的的異源蛋白質(zhì)。例如，胚乳已經(jīng)進(jìn)化以允許在小體積并穩(wěn)定的環(huán)境中積累大量的貯藏蛋白。此外， 胚乳的小尺寸允許重組蛋白質(zhì)在小生物量中達(dá)到相對較高的濃度，這對于提取和下游加工是有利的。由于已知會(huì)干擾下游加工步驟的化合物(例如在煙葉中存在的酚醛塑料和生物堿，以及在苜蓿中存在的草酸)的低水平，所以也簡化了該下游加工。此外，因?yàn)榉N子一般適合于人類和動(dòng)物消耗，所以在發(fā)育的種子中積累蛋白質(zhì)，對于產(chǎn)生口服遞送給人類或動(dòng)物的重組蛋白質(zhì)是很有吸引力的方式，例如，用于產(chǎn)生具有藥物特性的食物，如口服疫苗或者用于產(chǎn)生具有改良的營養(yǎng)特性的食物。在植物的種子中積累蛋白質(zhì)也是特別有用的，因?yàn)槭斋@種子已經(jīng)是基于農(nóng)作物的農(nóng)業(yè)的主要特征，并且使用現(xiàn)存的技術(shù)可以相對容易的實(shí)施。與植物中組成型表達(dá)不同，胚乳中蛋白質(zhì)的選擇性表達(dá)降低了干擾營養(yǎng)植物生長的風(fēng)險(xiǎn)。此外，此種限制性表達(dá)限制了與非目標(biāo)生物(例如生物圈中的微生物和食葉草食動(dòng)物)的接觸Gtoger等人，Current Opinion in Biotechnology，16 167-173，2005)。例如，因?yàn)榈侥壳盀橹狗蛛x的大多數(shù)序列都是滲漏性或非選擇性的，使得它們更通常在營養(yǎng)或花組織或者繁殖器官、成熟種子或胚組織中賦予表達(dá)和/或因?yàn)樗鼈儾豢梢栽诓煌锓N中有效或者不可以有效賦予跨物種
9的不同表達(dá)模式，所以對于能賦予在胚乳中選擇性地或特異性地表達(dá)的調(diào)節(jié)序列仍存在需求。本領(lǐng)域僅已知幾個(gè)胚乳啟動(dòng)子，并且大多數(shù)都來源于幾個(gè)大量表達(dá)的貯藏蛋白基因。由于在植物中從相同的啟動(dòng)子表達(dá)多個(gè)基因存在困難，所以少量的可用啟動(dòng)子使得很難通過基因堆積即表達(dá)多個(gè)轉(zhuǎn)基因來修飾或改良植物胚乳。例如，用于調(diào)節(jié)DNA結(jié)合蛋白質(zhì)的順式作用元件之間的競爭可以降低啟動(dòng)子的效率，使得當(dāng)與應(yīng)用不同的啟動(dòng)子比較時(shí)，在相同的細(xì)胞中，在相同的啟動(dòng)子控制下的多個(gè)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)可能是降低的。如前所述，對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，種子胚乳的基因操縱對于農(nóng)業(yè)是有利的，其允許產(chǎn)生用于人類或獸醫(yī)用途的藥物和/或允許改良或改變產(chǎn)生自植物的食物營養(yǎng)特性。因此，為了提供這些益處，在發(fā)育的胚乳中賦予表達(dá)的啟動(dòng)子是明顯需要的。例如，在以下教科書中描述了分子生物學(xué)、重組DNA技術(shù)的常規(guī)技術(shù)⑴Sambrook,Fritsch & Maniatis,Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories，紐約，第二版(1989)，全部 I、II 和 III 卷；(ii)DNA Cloning :A Practical Approach, I 禾Π II 卷(D. N. Glover 編輯，1985)， IRL Press, Oxford，全部文本；(iii)Oligonucleotide Synthesis :A Practical Approach(M. J. Gait 編輯， 1984) IRL Press, Oxford，全部文本，并且特別是其中Gait，第1-22頁，Atkinson等人，第 35-81頁；Sproat等人，第83-115頁；和Wu等人，第135-151頁的文本；(iv) Nucleic Acid Hybridization :A Practical Approach (B. D. Hames& S. J. Higgins 編輯，1985) IRL Press, Oxford,全部文本；(ν) Perbal, B.,A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)；發(fā)明_既述在產(chǎn)生本發(fā)明的工作中，本發(fā)明人試圖通過應(yīng)用微陣列技術(shù)提供該分離的啟動(dòng)子，并隨后分離了在發(fā)育的胚乳細(xì)胞中賦予表達(dá)的啟動(dòng)子序列。如在本文中所示例，本發(fā)明人鑒定了以組織選擇性和發(fā)育選擇性方式在發(fā)育的胚乳中表達(dá)的兩個(gè)小麥轉(zhuǎn)錄物。本發(fā)明人也使用小麥轉(zhuǎn)錄物序列通過同源檢索，鑒定了在稻、大麥、玉米和高粱中具有類似表達(dá)譜的轉(zhuǎn)錄物。為了分離調(diào)節(jié)小麥和玉米轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)的啟動(dòng)子，本發(fā)明人分別在小麥和玉米基因組DNA中，使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的引物擴(kuò)增了編碼區(qū)上游的核酸。 如在本文中示例，從稻和玉米基因組中獲得了小麥啟動(dòng)子的變體。本發(fā)明人也顯示，本發(fā)明的示例性小麥啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因小麥和玉米的發(fā)育胚乳中例如，從授粉后約5-10天至授粉后至少約25天期間，賦予與其有效連接的報(bào)告基因選擇性地和可能的特異性地表達(dá)。因此，如本文中所述的示例性啟動(dòng)子及其分離的方法代表了一類啟動(dòng)子，它們在天然情況下，賦予與其有效連接的基因選擇性地/特異性地胚乳表達(dá)。因此，本發(fā)明提供了能在發(fā)育的植物種子的胚乳中賦予與其有效連接的基因選擇性地表達(dá)的分離啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物，其中所述啟動(dòng)子在其天然情況下賦予基因組基因胚乳選擇性地表達(dá)或優(yōu)先地胚乳表達(dá)，所述基因組基因包括選自以下的序列(i) SEQ ID NO :1或2中所述的序列；(ii)編碼與由SEQ ID NO :1或2編碼的多肽具有至少約50%同一性的多肽的序列，其中所述多肽選擇性地表達(dá)于發(fā)育種子的胚乳中；(iii)在至少中等嚴(yán)格條件下，與(i)或(ii)項(xiàng)的序列或者它們的互補(bǔ)序列雜交的序列，其中所述雜交的序列選擇性地表達(dá)于發(fā)育種子的胚乳中；和(iv)如通過使用BLASTN算法例如用至少_1的核苷酸錯(cuò)配罰分(_q)的同源檢索測定的具有與(i)或(ii)項(xiàng)序列同源的序列，其中所述同源序列選擇性地表達(dá)于發(fā)育種子的胚乳中。分離的啟動(dòng)子、活性片段或衍生物至少能在單子葉植物例如，小麥、玉米、稻、大麥或高粱的發(fā)育種子中賦予與其有效連接的基因胚乳選擇性地表達(dá)或優(yōu)先地胚乳表達(dá)。并不排除除在本文中特定列舉的那些啟動(dòng)子之外的其他來源的本發(fā)明啟動(dòng)子?？梢詮膯巫尤~植物例如，小麥、玉米、稻、大麥或高粱中分離啟動(dòng)子、活性片段或衍生物也是顯而易見的。在一個(gè)實(shí)例中，分離的啟動(dòng)子、活性片段或衍生物能在從授粉后 (DAP)約5天至授粉后至少約25天期間，賦予與其有效連接的基因胚乳選擇性地表達(dá)或優(yōu)先地胚乳表達(dá)。應(yīng)當(dāng)理解，這種選擇性地表達(dá)意為，在一個(gè)或多個(gè)營養(yǎng)組織或器官和/或一個(gè)或多個(gè)繁殖組織或器官和/或一個(gè)或多個(gè)花組織或器官中，例如，如通過轉(zhuǎn)錄物譜或 Northern雜交或PR-PCR的常規(guī)方法或者通過免疫學(xué)方法例如ELISA或者通過測定酶活性測定，與啟動(dòng)子、片段或衍生物連接的基因并不以可檢測水平的轉(zhuǎn)錄物和/或蛋白質(zhì)表達(dá)。 例如，在葉和/或根和/或結(jié)節(jié)和/或莖節(jié)間體和/或穎片和/或花藥和/或子房和/或花粉和/或外殼和/或穗絲和/或胚和/或成熟的種子胚乳中，如通過此類方法所測定的， 本發(fā)明的啟動(dòng)子并不賦予可檢測的表達(dá)。在另一實(shí)例中，本發(fā)明分離的啟動(dòng)子、活性片段或衍生物賦予、誘導(dǎo)或活化與其有效連接的基因胚乳特異性地表達(dá)，即表達(dá)嚴(yán)格定位于發(fā)育的胚乳中。序列分析表明，盡管不同啟動(dòng)子之間通常具有低序列同一性，但根據(jù)本發(fā)明所提供的分離啟動(dòng)子、其活性片段和衍生物擁有結(jié)構(gòu)性保守特點(diǎn)，其允許將它們表征并鑒定為胚乳選擇性地或胚乳特異性地調(diào)節(jié)序列的種類或亞類。在一個(gè)實(shí)例中，例如，如通過調(diào)節(jié)序列的PLACE分析鑒定其中的順式作用元件所測定，本發(fā)明的啟動(dòng)子包含在表4和/或表5和 /或表6和/或表7和/或表8中所述的一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列。在另一實(shí)例中，本發(fā)明的分離啟動(dòng)子包含如在表1中所述的一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列，即，對應(yīng)于在5個(gè)示例性胚乳調(diào)節(jié)序列之間保守的順式作用元件。又在另一實(shí)例中，本發(fā)明的分離啟動(dòng)子包含多個(gè)在其來源的相應(yīng)基因組基因的翻譯起始位點(diǎn)上游近端750bp中的各個(gè)元件，元件選自ARRlAT元件、ACGTATERD1 元件、CAATB0X1 元件、CACFTPPCA1 元件、CUREC0RECR 元件、D0FC0REZM 元件、 EB0XBNNAPA 元件、GATAB0X 元件、GTlCONSENSUS 元件、GTGANTG10 元件和 MYCCONSENSUSAT 元件。根據(jù)該實(shí)例，每一此種元件可以在其來源的相應(yīng)基因組基因的翻譯起始位點(diǎn)上游近端 750bp中出現(xiàn)至少2或3或4或5或6次。備選地或另外地，CACFTPPCA1元件、D0FC0REZM 元件和GT1C0NSENSUS元件也都在所述啟動(dòng)子來源的相應(yīng)基因組基因的翻譯起始位點(diǎn)上游近端750bp中出現(xiàn)至少4次。備選地或另外地，ARRlAT元件、CUREC0RECR元件、D0FC0REZM 元件、EB0XBNNAPA元件、GTGANTG10元件和MYCCONSENSUSAT元件都在所述啟動(dòng)子來源的相應(yīng)基因組基因的翻譯起始位點(diǎn)上游近端750bp中出現(xiàn)至少4次。備選地或另外地，分離的啟動(dòng)子、活性片段或衍生物另外包含在啟動(dòng)子的天然情況下與所述啟動(dòng)子有效連接的基因的翻譯起始位點(diǎn)上游近端750bp中的至少一個(gè)元件，所述元件包括IB0XC0RE元件、MYB2C0NSENSUS 元件、MYBC0RE 元件和 WRKY710S 元件。選自 MYBSTl 元件、MYBC0REATCYCB1 元件和PREC0NSCRHSP70A元件的至少一個(gè)元件也可以在啟動(dòng)子的天然情況下與所述啟動(dòng)子有效連接的基因的翻譯起始位點(diǎn)上游近端750bp中出現(xiàn)。因此，本發(fā)明的啟動(dòng)子可以包含表1或4-8中所述的一個(gè)或多個(gè)拷貝的序列，例如，在具有或不具有間插序列(如串聯(lián)重復(fù)序列)的啟動(dòng)子序列中重復(fù)，和/或以相反的方向例如在不同的物種或等位基因中重復(fù)。本發(fā)明的啟動(dòng)子也可以包括下文表1或4-8中所述的例如，在不同物種或等位基因中的任一序列的反向互補(bǔ)序列。表1中顯示的在物種間或者在物種內(nèi)不同的部分同源染色體或等位基因之間保守的序列可以單獨(dú)地或者共同地促進(jìn)由本發(fā)明啟動(dòng)子所賦予的表達(dá)模式的表達(dá)，從而解釋在不同的或相同的物種中觀察到的與該啟動(dòng)子有效連接的轉(zhuǎn)錄物的一種或多種保守表達(dá)模式。因此，本發(fā)明啟動(dòng)子的典型實(shí)例(而不是那些通過基因復(fù)制引起的實(shí)例)具有整體的低序列同一性，盡管都能在特定的時(shí)間或空間模式中和/或在應(yīng)答一個(gè)或多個(gè)信號例如環(huán)境、激素等時(shí)具有賦予表達(dá)的保守能力。本領(lǐng)域技術(shù)人員也應(yīng)意識到，此類短序列對于賦予與其有效連接的異源核酸表達(dá)或表達(dá)模式是有用的，例如激活、沉默、增強(qiáng)、抑制或另外地調(diào)節(jié)與其有效連接的核酸表達(dá)和/或細(xì)胞類型特異性地和/或發(fā)育特異性地表達(dá)。又在另外的實(shí)例中，本發(fā)明的分離啟動(dòng)子、活性片段或衍生物包含選自以下的核苷酸序列⑴選自 SEQ ID NOs :3、4、5、6、7 和 8 的序列；(ii)與(i)項(xiàng)的序列互補(bǔ)的序列；(iii)與(i)或(ii)項(xiàng)的序列具有至少約70%序列同一性的序列；和(iv)使用一個(gè)或多個(gè)擴(kuò)增引物可從基因組DNA中擴(kuò)增的序列，其中每一所述引物包含衍生自SEQ ID NO :1或2或者其互補(bǔ)序列的至少約12個(gè)連續(xù)核苷酸長度的序列。對于命名的目的，在SEQ ID NO 3中所述的序列包含來自小麥的命名為“WP05”的啟動(dòng)子，在其天然情況下，所述啟動(dòng)子調(diào)節(jié)等同于SEQ ID NO :1中所述的轉(zhuǎn)錄物或其同源物的基因組基因的胚乳表達(dá)。SEQ ID NO :4中所述的序列包含來自小麥的命名為“WP07”的啟動(dòng)子的MOObp變體，在其天然情況下，所述啟動(dòng)子MOObp變體調(diào)節(jié)等同于SEQ ID NO 2中所述的轉(zhuǎn)錄物或其同源物的基因組基因的胚乳表達(dá)。SEQ ID NO :5中所述的序列包含來自小麥命名為“WP07”的啟動(dòng)子的2066bp變體，在其天然情況下，所述啟動(dòng)子2066bp變體調(diào)節(jié)等同于SEQ ID NO :2中所述的轉(zhuǎn)錄物和其同源物的基因組基因的胚乳表達(dá)。SEQ ID NO 6中所述的序列包含命名為“L0C_0s01g0U90. 1 ”的稻基因基因座的在其天然情況下的 330bp 5’上游調(diào)節(jié)序列，其中所述稻基因在發(fā)育的種子中表達(dá)并通過如在本文實(shí)施例中所述的同源檢索鑒定。SEQ ID NO :7中所述的序列包含命名為“ZmGSStucl 1-12-04. 64626. 1” 的玉米基因基因座的在其天然情況下的5’上游調(diào)節(jié)序列，其中所述玉米基因在發(fā)育的種子中表達(dá)并通過如在本文實(shí)施例中所述的同源檢索鑒定。SEQ ID NO :8中所述的序列包含命名為“ZmGSStucll-12-04. 16895. 1”的玉米基因基因座的在其天然情況下的5，上游調(diào)節(jié)序列，其中所述玉米基因在發(fā)育的種子中表達(dá)并通過如在本文實(shí)施例中所述的同源檢索鑒定。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明明確包括分離的啟動(dòng)子、活性片段或衍生物，所述分離的啟動(dòng)子、活性片段或衍生物包含的核苷酸序列分別地或共同地選自
⑴選自 SEQ ID NO :3、4、5、6、7 和 8 的序列；和(ii)與(i)項(xiàng)序列的任意一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)的序列。也應(yīng)當(dāng)理解，加以必要的更改，本發(fā)明涉及包含核苷酸序列的分離啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物，在其天然情況下賦予核酸的胚乳表達(dá)，所述核酸編碼由SEQ ID N0:1或 2 或 L0C_0s0IgO1290. 1 或 ZmGSStucl1-12-04. 64626. 1 或 ZmGSStucl1-12-04. 16895. 1 或者所述核酸的任意一個(gè)或多個(gè)同源物編碼的多肽。備選地或另外地，本發(fā)明的啟動(dòng)子包含在其天然情況下賦予核酸胚乳選擇性地或胚乳特異性地表達(dá)的序列，所述核酸在至少中等嚴(yán)格條件和優(yōu)選地高度嚴(yán)格條件下，與編碼由SEQ ID NO :1或2或L0C_0s01g0U90. 1或 ZmGSStucl 1-12-04. 64626. 1 或 ZmGSStucl 1-12-04. 16895. 1 編碼的多肽的核酸雜交。備選地或另外地，本發(fā)明的啟動(dòng)子包含在其天然情況下賦予核酸胚乳選擇性地或胚乳特異性地表達(dá)的序列，所述核酸在至少中等嚴(yán)格條件和優(yōu)選地高度嚴(yán)格條件下， 與編碼由 SEQ ID NO :1 或 2 或 L0C_0s0IgO 12690. 1 或 ZmGSStucl 1-12-04· 64626. 1 或 ZmGSStucl 1-12-04. 16895. 1編碼的多肽的核酸的互補(bǔ)物雜交。雜交條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的或者在本文中所述。由于在功能性相關(guān)的啟動(dòng)子之間識別的低整體序列同一性，低嚴(yán)格性雜交條件是優(yōu)選的，但可以應(yīng)用中等或高度嚴(yán)格性。更優(yōu)選地，本發(fā)明的啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物包含使用一個(gè)或多個(gè)擴(kuò)增引物從基因組DNA中擴(kuò)增的核苷酸序列，其中每一所述引物包含來源于SEQ ID NO :1或2或者 L0C_0s0IgO 1290. 1 或者 ZmGSStucl 1-12-04. 64626. 1 或者 ZmGSStucl 1-12-04. 16895. 1 或者它們的互補(bǔ)序列中所述序列的至少約12個(gè)連續(xù)核苷酸長度的序列。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的啟動(dòng)子包含選自SEQ ID NO :3、4、5、6、7 和8或它們的互補(bǔ)序列或者所述序列或互補(bǔ)序列的活性片段或衍生物的序列。本發(fā)明也提供了如在本文中所述的根據(jù)任一實(shí)施方案的啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物在產(chǎn)生表達(dá)構(gòu)建體中的用途。例如，本發(fā)明的啟動(dòng)子在發(fā)育的胚乳中對于用于表達(dá)與其有效連接的核酸的表達(dá)構(gòu)建體的產(chǎn)生是特別有用的，并且優(yōu)選地其在胚乳和其細(xì)胞和組織中優(yōu)先地或選擇性地表達(dá)。術(shù)語“表達(dá)構(gòu)建體”取其廣義，并包括置于與轉(zhuǎn)基因有效連接的分離啟動(dòng)子或者活性片段或衍生物。如本文中所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”用于指除在其天然情況下，本發(fā)明的啟動(dòng)子賦予與其連接的核酸表達(dá)或表達(dá)模式之外的核酸，即“異源核酸?！北景l(fā)明的一般應(yīng)用并不限于轉(zhuǎn)基因的性質(zhì)?；诒疚闹兴觯线m的轉(zhuǎn)基因?qū)Ρ绢I(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，并且包括在發(fā)育的胚乳或者其細(xì)胞或組織中編碼待表達(dá)的多肽的核酸或者能在發(fā)育的胚乳或者其細(xì)胞或組織中減低核酸的表達(dá)的核酸，例如siRNA或RNAi或反義RNA或miRNA。優(yōu)選地，核酸能調(diào)節(jié)涉及胚乳發(fā)育、淀粉或貯藏蛋白積累或生物合成或者涉及賦予種子疾病抗性或營養(yǎng)價(jià)值的多肽的表達(dá)。從前所述，應(yīng)當(dāng)理解，優(yōu)選的是待通過啟動(dòng)子進(jìn)行調(diào)節(jié)的此種表達(dá)， 所述啟動(dòng)子在發(fā)生表達(dá)、阻抑、抑制或降低所需的一個(gè)或多個(gè)因子的情況下賦予表達(dá)。優(yōu)選地，在這些條件下，表達(dá)是優(yōu)先性或選擇性地調(diào)節(jié)的?；诒疚闹兴觯渌线m的轉(zhuǎn)基因?qū)τ诒绢I(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，并且明確包括編碼賦予發(fā)育胚乳的營養(yǎng)或藥物特性的多肽或者編碼用于生產(chǎn)有用的下游產(chǎn)物或副產(chǎn)物的多肽的轉(zhuǎn)基因，所述有用的下游產(chǎn)物或副產(chǎn)物例如，淀粉、釀造或發(fā)酵飲料或食物、面粉、含面粉的產(chǎn)品例如面包、餅干、面團(tuán)或面條、淀粉類食物、脂肪酸、食用油、紙張、紡織品、乙醇、聚合物或其它エ業(yè)應(yīng)用。本發(fā)明也提供用于產(chǎn)生表達(dá)構(gòu)建體的方法，所述方法包括將如本文中所述根據(jù)任一實(shí)施方案的本發(fā)明啟動(dòng)子或者活性片段或衍生物與轉(zhuǎn)基因連接，以使啟動(dòng)子能在發(fā)育的胚乳或者其細(xì)胞或組織中賦予所述轉(zhuǎn)基因表達(dá)或表達(dá)模式。用于實(shí)施該實(shí)驗(yàn)方案的優(yōu)選細(xì)胞組織或器官是植物細(xì)胞、組織或器官，例如，如來自小麥、大麥、玉米、稻、高粱、黒麥、栗(例如珍珠栗(pearl millet)或散穗黍(proso millet))、蕎麥(例如，蓼科(Polygonaceae)的蕎麥)、燕麥(例如，燕麥(Avena sativa)) 的單子葉植物細(xì)胞、組織或器官或者來自選自禾本科(Graminaceae、Gramineae或 Poaceae)的任一其他植物的細(xì)胞、組織或器官。這包括具有如在本文以前所定義的在其天然情況下賦予與所述啟動(dòng)子有效連接的核酸表達(dá)之能力的任一植物細(xì)胞、組織或器官。啟動(dòng)子、活性片段或衍生物與轉(zhuǎn)基因之間優(yōu)選的連接是共價(jià)連接。應(yīng)當(dāng)理解，因?yàn)閱?dòng)子、活性片段或衍生物可以在與其有效連接的轉(zhuǎn)基因具有一定距離的情況下賦予表達(dá)，因此轉(zhuǎn)基因并不需要與啟動(dòng)子、活性片段或衍生物緊鄰，即，可以存在多達(dá)約21Λ長度， 優(yōu)選地多達(dá)約11Λ長度，更常見地約200-500bp長度的間插序列。也可以應(yīng)用更短的間插序列如至多約100或200bp長度的內(nèi)含子序列。用于連接核酸的合適方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員和/或本文中所述是顯而易見的， 并包括酶連接，例如T4 DNA連接酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶介導(dǎo)的連接，例如使用Vaccinia DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I、順式或反式重組，例如使用重組酶或者通過隨機(jī)整合、從ー個(gè)或多個(gè)引物序列的擴(kuò)增包括引物延伸方法、從載體擴(kuò)增或者化學(xué)連接，例如溴化氰介導(dǎo)的核酸凝集。在另ー實(shí)例中，本發(fā)明也提供包含與轉(zhuǎn)基因有效連接的如在本文中所述根據(jù)任一實(shí)施方案的本發(fā)明啟動(dòng)子的表達(dá)構(gòu)建體。本發(fā)明也提供如本文中所述根據(jù)任一實(shí)施方案的啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物在產(chǎn)生表達(dá)載體中的用途。優(yōu)選地，將所使用的啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)基因有效連接。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，表達(dá)載體包含足夠的基因信息以允許從啟動(dòng)子、活性片段或衍生物起始表達(dá)，例如通過存在的啟動(dòng)子、活性片段或衍生物，和與其有效連接的ー個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄終止序列和/ 或增強(qiáng)子元件序列和/或內(nèi)含子序列和/或內(nèi)含子剪接界序列。表達(dá)載體通常也包括ー個(gè)或多個(gè)序列以允許其在細(xì)胞中維持，例如一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記，例如以賦予包含該表達(dá)構(gòu)建體的細(xì)胞抗生素或除草劑抗性，和ー個(gè)或多個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，所述ー個(gè)或多個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)例如用于在細(xì)菌細(xì)胞或酵母中復(fù)制。表達(dá)載體也可以包括一個(gè)或多個(gè)重組酶位點(diǎn)序列，以允許切除細(xì)胞中其DNA的一部分和/或以有助于整合到宿主細(xì)胞DNA中。本發(fā)明也提供用于產(chǎn)生表達(dá)載體的方法，所述方法包含與空載體連接的如在本文中所述根據(jù)任一實(shí)施方案的本發(fā)明啟動(dòng)子或者活性片段或衍生物，從而產(chǎn)生表達(dá)載體。如本文中所用，術(shù)語“空載體”應(yīng)用于指不具有本發(fā)明的啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物的載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道，示例性載體包括質(zhì)粒、噬菌粒、粘粒、病毒基因組或亞基因組片段、噬菌體人工染色體例如，Pl人工染色體、細(xì)菌人工染色體、酵母人工染色體或能染色體或染色體外維持和/或在細(xì)胞中復(fù)制的其他核酸。在一個(gè)實(shí)例中，該方法另外包括將轉(zhuǎn)基因與表達(dá)載體連接，以使啟動(dòng)子、活性片段或衍生物與轉(zhuǎn)基因有效連接。在另外的備選中，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生表達(dá)載體的方法，所述方法包括如本文中所述根據(jù)任一實(shí)施方案的空載體而連接表達(dá)構(gòu)建體，從而產(chǎn)生表達(dá)載體。在本文中，應(yīng)當(dāng)理解，表達(dá)載體的多個(gè)組分之間的連接和用于實(shí)現(xiàn)此種連接的方法與用于產(chǎn)生本發(fā)明表達(dá)構(gòu)建體的連接和方法相同。在一個(gè)實(shí)例中，該方法另外包括產(chǎn)生或獲得本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體。在另ー實(shí)例中，該方法包括獲得本發(fā)明的啟動(dòng)子、活性片段或衍生物和/或轉(zhuǎn)基因和/或空載體，用于產(chǎn)生本發(fā)明的表達(dá)載體。在另外的實(shí)例中，本發(fā)明也提供包含本發(fā)明的啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物的表達(dá)載體。優(yōu)選的表達(dá)載體包含本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體，即包括與轉(zhuǎn)基因有效連接的本發(fā)明的啟動(dòng)子。例如，本發(fā)明人產(chǎn)生了用于生物射彈或者農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥轉(zhuǎn)化的載體，例如包含 SEQ ID NO:所述序列轉(zhuǎn)化的小麥，例如，包含SEQ ID NO :10-17中所述序列，或者用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米的轉(zhuǎn)化，例如，包含SEQ ID NO 18或19中所述序列。如本文中所述根據(jù)任一實(shí)施方案的啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物對于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物或植物部分也是有用的，例如，包含與轉(zhuǎn)基因有效連接的或者與內(nèi)源核酸有效連接的本發(fā)明啟動(dòng)子、活性片段或衍生物?！皟?nèi)源核酸”指通過引入啟動(dòng)子、活性片段或衍生物，轉(zhuǎn)基因制備的植物、植物細(xì)胞或植物部分中核或細(xì)胞器來源的核酸。例如，通過引入本發(fā)明的啟動(dòng)子、活性片段或衍生物，轉(zhuǎn)基因制備在植物或植物部分中天然存在的此種“內(nèi)源核酸”。因此，本發(fā)明提供了本發(fā)明的啟動(dòng)子、活性片段或衍生物在產(chǎn)生植物細(xì)胞、植物組織、植物器官或整個(gè)植物中的用途，例如，用于調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因的胚乳表達(dá)(即，賦予內(nèi)源或異源轉(zhuǎn)基因在發(fā)育的胚乳中優(yōu)先地或者選擇性地表達(dá))和/或用于阻抑或降低內(nèi)源轉(zhuǎn)基因在發(fā)育的胚乳中的表達(dá)。術(shù)語“植物部分”應(yīng)當(dāng)理解為植物的細(xì)胞、組織或器官，或者植物的多個(gè)細(xì)胞、組織或器官，包括任一繁殖材料，例如種子、發(fā)育的胚乳，備選地包括盾片和/或糊粉，并優(yōu)選發(fā)育的胚乳。本發(fā)明優(yōu)選的植物部分包含本發(fā)明的啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物。備選地，本發(fā)明提供了本發(fā)明的啟動(dòng)子、活性片段或衍生物在制備表達(dá)載體或表達(dá)構(gòu)建體中的用途，用于產(chǎn)生植物細(xì)胞、組織或器官或者整個(gè)植物，例如，用于賦予在發(fā)育的胚乳(任選地包括盾片和/或糊粉)中優(yōu)先地或選擇性地表達(dá)和/或用于阻抑或降低在發(fā)育的胚乳(任選地包括盾片和/或糊粉)中的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)例中，將本發(fā)明的啟動(dòng)子、活性片段或衍生物用于產(chǎn)生其中改變了內(nèi)源核酸的表達(dá)(即，將啟動(dòng)子、活性片段或衍生物與內(nèi)源核酸有效連接)的植物或植物部分。 例如，產(chǎn)生的此種植物部分或植物允許增強(qiáng)或降低內(nèi)源核酸的表達(dá)。此種調(diào)節(jié)性表達(dá)對于例如，誘導(dǎo)產(chǎn)生目的表達(dá)產(chǎn)物例如，目的蛋白質(zhì)或者用于控制目的表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)時(shí)間和/ 或定位、或者用于減低不想要的表達(dá)產(chǎn)物的水平或者推遲它們的表達(dá)是有用的。備選地，將啟動(dòng)子、活性片段或衍生物用于鑒定和/或分離誘導(dǎo)目的表型的核酸。 例如，將該啟動(dòng)子、活性片段或衍生物引入到植物或植物部分的基因組中，以使其與基因組核酸有效連接，從而在所述植物或植物部分中產(chǎn)生與其他等基因材料或近等基因材料
15(near isogenic material)的表型不同的表型，所述其他等基因材料或近等基因材料在該基因組位置處缺少所述啟動(dòng)子、活性片段或衍生物。使用標(biāo)準(zhǔn)技木，例如cDNA末端的5’快速擴(kuò)增(RACE)或3’RACE，可以任選地鑒定和/或分離在植物的基因組中與該啟動(dòng)子、活性片段或衍生物有效連接的核酸。在另ー實(shí)例中，將本發(fā)明的啟動(dòng)子、活性片段或衍生物用于在植物部分中賦予轉(zhuǎn)基因如上文中所定義的表達(dá)。應(yīng)當(dāng)理解，可以將本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體用于產(chǎn)生植物細(xì)胞、植物部分或整個(gè)植物，用于賦予植物部分如上文中所定義的表達(dá)的目的。在包含表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物部分的情況下，該表達(dá)構(gòu)建體可以整合到植物、植物細(xì)胞或植物部分的基因組中或者可以在附加體中或者在染色體外。優(yōu)選地，可以將本發(fā)明的啟動(dòng)子、活性片段、衍生物、表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體用于產(chǎn)生與不具有該啟動(dòng)子、活性片段、衍生物、表達(dá)載體或表達(dá)構(gòu)建體的另外的等基因植物部分或植物比較，具有改變的表型的植物或植物部分。例如，轉(zhuǎn)基因植物或植物部分包含本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體，所述表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體包含有效放置在本發(fā)明的啟動(dòng)子控制下的轉(zhuǎn)基因或結(jié)構(gòu)基因。在一個(gè)實(shí)例中，在本發(fā)明啟動(dòng)子控制下待表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因的開放閱讀框賦予植物增強(qiáng)的疾病或害蟲耐受性(例如，來自昆蟲抗性基因、細(xì)菌疾病抗性基因、真菌疾病抗性基因、病毒疾病抗性基因、線蟲疾病抗性基因的開放閱讀框)。在另ー實(shí)例中，在本發(fā)明啟動(dòng)子的控制下待表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因的開放閱讀框賦予植物增強(qiáng)的除草劑耐受性(例如，草甘膦抗性基因或膦四菌素抗性基因)。在另ー實(shí)例中，在本發(fā)明啟動(dòng)子的控制下待表達(dá)結(jié)構(gòu)基因的開放閱讀框修飾谷物組成(composition)或品質(zhì)，例如胚乳大小、胚乳細(xì)胞數(shù)量、種子大小或其它產(chǎn)量特性。又在另外的實(shí)例中，在本發(fā)明啟動(dòng)子控制下待表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因的開放閱讀框修飾營養(yǎng)利用率、改良對真菌毒素的耐受性、改良或增強(qiáng)環(huán)境或其他脅迫耐性抗性 (例如，干旱耐性基因、熱耐性基因、冷耐性基因、霜凍耐性基因、澇耐性基因、鹽耐性基因或氧化脅迫耐性基因)、油數(shù)量和/或質(zhì)量、氨基酸或蛋白質(zhì)組成，以及用于表達(dá)來自植物、 其他真核生物或原核生物的外源性產(chǎn)物如酶、輔因子和激素的基因。通過修飾改變淀粉或蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)也可以產(chǎn)生植物中的商業(yè)性狀，用于產(chǎn)生具有エ業(yè)用途的紙、紡織品、 醇、聚合物或其他物質(zhì)。在另ー實(shí)例中，使用本發(fā)明的啟動(dòng)子，例如通過在本發(fā)明啟動(dòng)子的有效控制下在胚乳中表達(dá)ー個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因，降低內(nèi)源胚乳基因的表達(dá)，所述ー個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因包括一個(gè)或多個(gè)反義分子、核酶(Haseloff 等人 Nature334，585-591，1988 ；Steinecke 等人 EMBO J. 11,1525(1992) ；Perriman 等人 Antisense Res. Dev. 3，253 (199 )、共抑制分子、RNAi 分子(Napoli 等人 Plant Cell 2，279-289,1990 ；美國專利號 5，034，323 ；Sharp 等人，Genes Dev. 13，139-141，1999 ；Zamore 等人，Cell 101，25-33，2000 ；和 Montgomery 等人，PNAS USA 95，15502-15507，1998)、發(fā)夾結(jié)構(gòu)(Smith 等人 Nature 407,319-320,2000 ；WO 99/53050 ； 和 WO 98/53083)、微 RNA (Aukerman 等人，Plant Cell 15，2730-2741，2003)、轉(zhuǎn)錄因子靴向基因(例如WO 01/52620 ；WO 03/048345和WO 00/42219)、阻抑物編碼基因、轉(zhuǎn)座子或顯性失活突變。本發(fā)明明確包括使用其他方法或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的上述方法的任意ー個(gè)或多個(gè)的組合。通過表達(dá)結(jié)構(gòu)基因例如(開放閱讀框)或者分子，以有效降低與本發(fā)明的啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物有效連接的內(nèi)源胚乳基因的轉(zhuǎn)錄，可以將本發(fā)明的啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物特別地用于修飾ー個(gè)或多個(gè)谷物性狀。優(yōu)選的谷物性狀包括例如，脂肪酸含量和/或組成、氨基酸含量和/或組成包括含賴氨酸或含硫蛋白質(zhì)的含量，以及種子貯藏蛋白的含量和/或組成、淀粉含量和/或組成、生長調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)包括細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、凋亡或核仁敗育(kernel abortion)和環(huán)境脅迫基因。在另ー實(shí)例中，轉(zhuǎn)基因編碼抑制多肽在發(fā)育的胚乳中表達(dá)的siRNA或反義RNA或RNAi或miRNA。備選地，該核酸編碼能結(jié)合并抑制在發(fā)育的胚乳中的多肽活性的抗體片段。在另外的實(shí)例中，將本發(fā)明的啟動(dòng)子、活性片段或衍生物或表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體用于賦予植物部分或整個(gè)植物對疾病或害蟲的抗性。例如，當(dāng)表達(dá)例如來自小麥的殼多糖酶或奇甜蛋白樣蛋白質(zhì)、或者來自害蟲的外被蛋白(例如，大麥條紋花葉病毒外被蛋白) 吋，包含轉(zhuǎn)基因的表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體賦予對植物疾病或植物害蟲的抗性。又在另外的實(shí)例中，轉(zhuǎn)基因在其表達(dá)的植物或植物部分中賦予植物或植物部分藥物特性。例如，該轉(zhuǎn)基因編碼免疫原性蛋白質(zhì)，例如，如乙型肝炎表面抗原。本發(fā)明也包括本發(fā)明的啟動(dòng)子、活性片段、衍生物、表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體的用途，以賦予植物或植物部分營養(yǎng)特性。例如，表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體包含編碼種子貯藏蛋白、脂肪酸途徑酶、生育酚生物合成酶、氨基酸生物合成酶或淀粉分支酶的轉(zhuǎn)基因。在ー個(gè)實(shí)例中，轉(zhuǎn)基因編碼巴西堅(jiān)果蛋白質(zhì)、鈣結(jié)合蛋白質(zhì)或鐵結(jié)合蛋白質(zhì)。本發(fā)明也包括本發(fā)明的啟動(dòng)子、活性片段、衍生物、表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體修飾植物或植物部分的形態(tài)的用途。例如，表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體包含編碼參與生長素合成或代謝或者細(xì)胞分裂素合成或代謝(例如，細(xì)胞分裂素氧化酶)的多肽的轉(zhuǎn)基因。通過改變植物或植物部分中生長素和/或細(xì)胞分裂素的水平，修飾植物或植物部分的形態(tài)。應(yīng)當(dāng)理解，可以將本發(fā)明的啟動(dòng)子特別地用于基因堆積目的，例如當(dāng)與不同的啟動(dòng)子一起使用以在植物的胚乳中表達(dá)多個(gè)結(jié)構(gòu)基因或轉(zhuǎn)基因吋。在另外的實(shí)例中，將本發(fā)明的啟動(dòng)子與ー個(gè)或多個(gè)其他啟動(dòng)子聯(lián)合使用，以在相同或不同的植物細(xì)胞中表達(dá)多個(gè)結(jié)構(gòu)基因或轉(zhuǎn)基因，例如，其中此種表達(dá)是同時(shí)發(fā)生的、同時(shí)存在的或者同步發(fā)生的。例如，可以將本發(fā)明的啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物用于表達(dá)不同的結(jié)構(gòu)基因或轉(zhuǎn)基因，其中當(dāng)所述不同的結(jié)構(gòu)基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)時(shí)，修飾植物種子中相同的生物化學(xué)途徑。備選地，可以將本發(fā)明的啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物在植物種子中用于表達(dá)與在其他啟動(dòng)子控制下表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因或轉(zhuǎn)基因功能性不同的或不相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因或轉(zhuǎn)基因。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，基因堆積可以通過涉及將待表達(dá)基因構(gòu)建體引入的同時(shí)或依次轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行。在基因堆積的一個(gè)實(shí)例中，將包含與轉(zhuǎn)基因或結(jié)構(gòu)基因有效連接的本發(fā)明啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物的構(gòu)建體引入到已經(jīng)表達(dá)在另ー啟動(dòng)子控制下的轉(zhuǎn)基因或結(jié)構(gòu)基因的植物胚乳中，所述另ー啟動(dòng)子在許多不同的植物器官、組織或細(xì)胞(例如包括胚乳) 中賦予或調(diào)節(jié)表達(dá)。在另ー實(shí)例中，應(yīng)用雙組分系統(tǒng)，其中產(chǎn)生兩種親本系，兩個(gè)親本系各自在啟動(dòng)子的控制下表達(dá)想要的轉(zhuǎn)基因，以使ー種植物株系包含根據(jù)本發(fā)明的啟動(dòng)子、其活性片段或衍生物，而另ー個(gè)植物株系包含其他啟動(dòng)子，并且其中將兩種轉(zhuǎn)基因植物系雜交以產(chǎn)生表達(dá)兩種轉(zhuǎn)基因的子代植物。在另ー實(shí)例中，將包含與轉(zhuǎn)基因或結(jié)構(gòu)基因有效連接的本發(fā)明啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物的第一構(gòu)建體與包含與不同的啟動(dòng)子有效連接的轉(zhuǎn)基因或結(jié)構(gòu)基因的第二構(gòu)建體一起引入到植物胚乳中，所述不同的啟動(dòng)子在許多不同的植物器官、組織或細(xì)胞(例如包括胚乳)中賦予或調(diào)節(jié)表達(dá)。在許多不同的植物器官、組織或細(xì)胞(例如包括胚乳)中賦予或調(diào)節(jié)表達(dá)的示例性啟動(dòng)子是本領(lǐng)域已知的，例如 P326啟動(dòng)子，YPO144啟動(dòng)子、YPO190啟動(dòng)子、pl3879啟動(dòng)子、YP0050啟動(dòng)子、p32449啟動(dòng)子、21876啟動(dòng)子、YP0158啟動(dòng)子、YP0214啟動(dòng)子、YP0380啟動(dòng)子、PT0848啟動(dòng)子、PT0633啟動(dòng)子、CaMV 35S啟動(dòng)子、甘露氨酸合成酶(MAS)啟動(dòng)子、來源于根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的T-DNA的1’或2’啟動(dòng)子、玄參花葉病毒34S啟動(dòng)子、例如來自稻的肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和例如來自玉米的泛素啟動(dòng)子⑴bi-1)。在基因堆積的另ー實(shí)例中，將包含與轉(zhuǎn)基因或結(jié)構(gòu)基因有效連接的本發(fā)明啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物的構(gòu)建體引入到已經(jīng)表達(dá)在成熟胚乳啟動(dòng)子控制下的轉(zhuǎn)基因或結(jié)構(gòu)基因的植物胚乳中，所述成熟胚乳啟動(dòng)子在成熟胚乳中賦予或調(diào)節(jié)表達(dá)，盡管并不必需專門或主要在成熟的胚乳中。在另ー實(shí)例中，應(yīng)用雙組分系統(tǒng)，其中產(chǎn)生兩種親本系，其各自在啟動(dòng)子的控制下表達(dá)想要的轉(zhuǎn)基因，以使ー種植物系包含根據(jù)本發(fā)明的啟動(dòng)子、其活性片段或衍生物，而另ー植物系包含在成熟的胚乳中有活性的其他啟動(dòng)子，并且其中將兩種轉(zhuǎn)基因植物系雜交以產(chǎn)生在胚乳中表達(dá)兩種轉(zhuǎn)基因的子代植物。也在另ー實(shí)例中，將包含與轉(zhuǎn)基因或結(jié)構(gòu)基因有效連接的本發(fā)明啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物的第一構(gòu)建體與包含與不同的啟動(dòng)子有效連接的轉(zhuǎn)基因或結(jié)構(gòu)基因的第二構(gòu)建體一起引入到植物胚乳中，所述不同的啟動(dòng)子在成熟胚乳中賦予或調(diào)節(jié)表達(dá)，盡管并不必需專門或主要在成熟的胚乳中。在基因堆積的另ー實(shí)例中，將包含與轉(zhuǎn)基因或結(jié)構(gòu)基因有效連接的本發(fā)明啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物的構(gòu)建體引入到已經(jīng)表達(dá)在成熟胚乳啟動(dòng)子控制下的轉(zhuǎn)基因或結(jié)構(gòu)基因的植物胚乳中，所述成熟胚乳啟動(dòng)子在胚囊或早期胚乳中賦予或調(diào)節(jié)表達(dá)，盡管其并不必需專門或主要在胚囊/早期胚中。又在另ー實(shí)例中，將包含與轉(zhuǎn)基因或結(jié)構(gòu)基因有效連接的本發(fā)明啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物的第一構(gòu)建體與包含與不同的啟動(dòng)子有效連接的轉(zhuǎn)基因或結(jié)構(gòu)基因的第二構(gòu)建體一起引入到植物胚乳中，所述不同啟動(dòng)子在胚囊或早期胚乳中賦予或調(diào)節(jié)表達(dá)，盡管其并不必需專門或主要在胚囊/早期胚中?！芭吣摇被颉霸缙谂呷椤敝笜O核和/或中央細(xì)胞，或者是極核的前體和細(xì)胞化前的前體(or in precursors to polar nuclei ana preceding cellularization)。在 1$囊或早 31$學(xué)し 中有活性的示例性啟動(dòng)子包括例如，擬南芥屬viviparous-Ι基因啟動(dòng)子(見，GenBank號 U93215)；擬南芥屬 Atmycl 基因啟動(dòng)子(Urao 等人，Plant Mol. Biol. ,32 :571-57,1996 ； Conceicao Plant，5，493-505，1994)；擬南芥屬 FIE 基因啟動(dòng)子(見 GenBank 號 AF129516)； 擬南芥屬M(fèi)EA基因啟動(dòng)子；擬南芥屬FIS2基因啟動(dòng)子(見GenBank號AF096096)；擬南芥屬FIE 1. 1基因啟動(dòng)子(美國專利號6，906，244)；玉米MACl基因啟動(dòng)子(Sieridan等人， Genetics, 142，1009-1020，1996 ；和玉米 Cat3 基因啟動(dòng)子(見 GenBank 號 L05934 ；Abler 等人，Plant Mol. Biol.，22，10131-1038)，1993。本發(fā)明也提供用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法，所述方法包括將本發(fā)明的啟動(dòng)子、活性片段或衍生物或者表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體引入到植物細(xì)胞中。用于將核酸引入到植物細(xì)胞中的合適方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，例如，使用CaCl2的轉(zhuǎn)化和其變體、PEG-介導(dǎo)的原生質(zhì)體攝入、微粒轟擊、電穿孔、顯微注射、組織的真空滲入或農(nóng)桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。例如，通過進(jìn)行如在國際專利申請?zhí)朠CT/AU2007/000021中所述的農(nóng)桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。優(yōu)選地，該方法另外包括產(chǎn)生、提供或獲得啟動(dòng)子、活性片段、衍生物、表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體。在一個(gè)實(shí)例中，用于產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法另外包括，在一段時(shí)間和在足夠產(chǎn)生愈傷組織和/或去分化細(xì)胞和/或未分化細(xì)胞的條件下，將產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞與化合物接觸，所述化合物誘導(dǎo)愈傷組織形成和/或誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞(或其衍生的細(xì)胞)的去分化和/或誘導(dǎo)來自所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的未分化細(xì)胞的產(chǎn)生。合適的化合物對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，例如合成的或天然的植物生長素如，例如，選自2，4_ ニ氯苯氧乙酸、3，6_ ニ氯-鄰-甲氧基苯甲酸(3,6-dichloro-o-anisic acid)、4_ 氨基-3，5， 6-三氯吡啶羧酸和它們的混合物的化合物。“愈傷組織”指在不存在再生的情況下，由細(xì)胞分裂產(chǎn)生的一群或一組未分化細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道，在沒有過多的實(shí)驗(yàn)的情況下，例如，通過再生，可以將轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物?！霸偕敝笍霓D(zhuǎn)基因植物細(xì)胞產(chǎn)生植物或植物部分， 特別是小植株的方法，例如，通過器官發(fā)生或者胚發(fā)生的方法。如本文中所用，術(shù)語“器官發(fā)生”應(yīng)當(dāng)用于指從分生組織中心依次發(fā)育成苗和根的過程。如本文中所用，術(shù)語“胚發(fā)生”應(yīng)當(dāng)用于指從體細(xì)胞或者配子，以協(xié)同的方式(非依次地)一起發(fā)育成苗和根的過程。如本文中所用，術(shù)語“小植株”應(yīng)當(dāng)用于指已經(jīng)從植物細(xì)胞發(fā)育成的苗或根，例如， 使用體外技木。例如，小植株是使用化合物從愈傷組織誘導(dǎo)生長的苗或根，所述化合物例如，吲哚-3-乙酸、芐基腺嘌呤、噴哚丁酸、玉米素、α-萘乙酸、6-芐氨基嘌呤、賽ニ唑素或激動(dòng)素、2iP?；谇笆?，對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的啟動(dòng)子、 活性片段、衍生物、表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物或小植株的用途。本發(fā)明也提供用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物或小植株的方法，所述方法包括(i)提供、產(chǎn)生或獲得包含本發(fā)明的啟動(dòng)子、活性片段、衍生物、表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或愈傷組織；和(ii)從(i)項(xiàng)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或愈傷組織再生轉(zhuǎn)基因植物或小植株，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物或小植株。在一個(gè)實(shí)例中，該方法可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物或小植株，其中本發(fā)明的啟動(dòng)子、活性片段或衍生物賦予核酸(例如轉(zhuǎn)基因)優(yōu)先地或選擇性地在發(fā)育的胚乳(任選地包括糊粉和/或盾片)中如上文所定義的表達(dá)，和/或阻抑或降低核酸優(yōu)先地或選擇性地在發(fā)育的胚乳中的表達(dá)。用于從植物細(xì)胞或愈傷組織再生植物或小植株的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員和/或本文中所述是顯而易見的。例如，在一段時(shí)間和在足夠產(chǎn)生愈傷組織和/或去分化細(xì)胞和/ 或未分化細(xì)胞的條件下，將轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞與化合物接觸，例如前述化合物，所述化合物誘導(dǎo)愈傷組織形成和/或誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞(或其衍生的細(xì)胞)的去分化和/或誘導(dǎo)來自所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的未分化細(xì)胞的產(chǎn)生。通常在一段時(shí)間和在用于小植株形成的條件下，將愈傷
19組織與誘導(dǎo)苗和/或根形成的化合物，例如前述用于產(chǎn)生小植株的化合物接觸。為了產(chǎn)生整個(gè)植物，在一段時(shí)間和在用于其發(fā)育成整個(gè)植物(例如，生長到成熟)的條件下，培養(yǎng)小植株。在一個(gè)實(shí)例中，用于產(chǎn)生如本文中所述的根據(jù)任ー實(shí)施方案的轉(zhuǎn)基因植物或小植株的方法另外包括，從轉(zhuǎn)基因植物或小植株提供或獲得子代植物和/或種子和/或繁殖物質(zhì)和/或繁殖材料和/或種質(zhì)，其中所述子代植物、種子、繁殖物質(zhì)或繁殖材料包含本發(fā)明的啟動(dòng)子、活性片段、衍生物、表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體。本發(fā)明另外提供了用于從植物中產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因種子的方法，所述方法包括提供、產(chǎn)生或獲得如本文中所述根據(jù)任意實(shí)施方案的轉(zhuǎn)基因植物或小植株，并在一段時(shí)間和在足夠產(chǎn)生種子的條件下，培養(yǎng)或維持轉(zhuǎn)基因植物或小植株。任選地，該方法另外包括獲得包含引入的本發(fā)明啟動(dòng)子、活性片段或衍生物或者本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體的種子。本發(fā)明也提供了包含本發(fā)明的啟動(dòng)子、活性片段、衍生物、表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植物或小植株或植物部分或子代植物或種子或繁殖物質(zhì)或繁殖材料或種質(zhì)。在一個(gè)實(shí)例中，該植物或小植株或植物部分或子代植物或種子或繁殖物質(zhì)或繁殖材料或種質(zhì)包含與所述植物或小植株或植物部分或子代植物或種子或繁殖物質(zhì)或繁殖材料或種質(zhì)的內(nèi)源核酸有效連接的啟動(dòng)子、活性片段或衍生物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含與本發(fā)明的啟動(dòng)子、活性片段或衍生物有效連接的核酸的轉(zhuǎn)基因植物或小植株或植物部分或子代植物或種子或繁殖物質(zhì)或繁殖材料或種質(zhì)，例如包含本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體。優(yōu)選地，該啟動(dòng)子、活性片段或衍生物賦予核酸優(yōu)先地或選擇性地在發(fā)育的胚乳中表達(dá)和/或阻抑或降低核酸優(yōu)先地或選擇性地在發(fā)育的胚乳中的表達(dá)。本發(fā)明另外提供了轉(zhuǎn)基因植物、小植株或植物部分用于產(chǎn)生合子和/或子代小植株和/或子代植物的用途。另外地，本發(fā)明提供了用于育種轉(zhuǎn)基因植物的方法。術(shù)語“育種”廣義上用于指從親代植物或其部分或者其細(xì)胞中或者使用親代植物或其部分或者其細(xì)胞產(chǎn)生合子和/或子代小植株或植物的任一方法。例如，術(shù)語“育種”包括有性繁殖例如，雜交育種或異花授粉，從而將繁殖材料(例如，來自ー個(gè)植物的花粉)用于受精繁殖材料(例如，來自另ー植物的胚珠內(nèi)的卵細(xì)胞)。術(shù)語“育種，，也包括有性繁殖如自交或自體受精，從而將來自植物的繁殖材料(例如，花粉)用于受精繁殖材料(例如，來自相同植物的胚珠內(nèi)的卵細(xì)胞)。 術(shù)語“育種”也包括繁殖的營養(yǎng)體繁殖形式，例如，從匍匐莖或根莖或鱗莖或塊莖或球莖或插條或移植物或芽產(chǎn)生植物。術(shù)語“育種”也包括體外方法，例如體外受精和合子培養(yǎng)。在有性繁殖的情況下，本發(fā)明提供了用于育種轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括(i)提供、產(chǎn)生或獲得包含本發(fā)明的啟動(dòng)子、活性片段、衍生物、表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植物；和(ii)育種⑴項(xiàng)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物，從而產(chǎn)生包含本發(fā)明的啟動(dòng)子、活性片段、衍生物、表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體的合子。備選地，該方法包括(i)提供、產(chǎn)生或獲得包含本發(fā)明的啟動(dòng)子、活性片段、衍生物、表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體的植物繁殖材料；和(ii)將植物的繁殖材料與(i)項(xiàng)繁殖材料結(jié)合，使得產(chǎn)生包含本發(fā)明的啟動(dòng)子、 活性片段、衍生物、表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體的合子。優(yōu)選地，該方法另外地包括培養(yǎng)合子以形成轉(zhuǎn)基因發(fā)育的胚乳和/或轉(zhuǎn)基因小植株和/或轉(zhuǎn)基因植物和/或轉(zhuǎn)基因植物部分，例如，發(fā)育的胚乳。在一個(gè)實(shí)例中，獲得上述轉(zhuǎn)基因植物的步驟包括，獲得包含本發(fā)明的啟動(dòng)子、活性片段、衍生物、表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體的種子或小植株或植物部分，并培養(yǎng)所述種子、小植株或植物或植物部分，從而獲得轉(zhuǎn)基因植物。在雜交育種的情況下，將轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因繁殖材料與轉(zhuǎn)基因植物一起育種或者與轉(zhuǎn)基因繁殖材料結(jié)合，以產(chǎn)生對于本發(fā)明的啟動(dòng)子、活性片段、衍生物、表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體純合的或者雜合的合子、植物、小植株或植物部分。備選地，將野生型植物或野生型繁殖材料與轉(zhuǎn)基因植物一起育種或者與轉(zhuǎn)基因繁殖材料結(jié)合，以產(chǎn)生對于本發(fā)明的啟動(dòng)子、活性片段、衍生物、表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體雜合的合子、植物、小植株或植物部分。優(yōu)選地，本發(fā)明的育種方法另外包括，選擇或鑒定包含本發(fā)明的啟動(dòng)子、活性片段、衍生物、表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體的合子、小植株、植物部分或整個(gè)植物。在一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明的育種另外包括，檢測在小植株、植物部分或整個(gè)植物中與本發(fā)明的啟動(dòng)子、活性片段或衍生物有效連接的核酸的表達(dá)或表達(dá)模式。在無性繁殖的情況下，本發(fā)明提供的方法包括(i)提供、產(chǎn)生或獲得包含本發(fā)明的啟動(dòng)子、活性片段、衍生物、表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植物、小植株或植物部分；和(ii)在一段時(shí)間和在足夠植物無性繁殖的條件下，維持轉(zhuǎn)基因植物。合適的條件取決于無性繁殖的形式，并且這對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。例如，通過掩埋苗，可以誘導(dǎo)來自植物的側(cè)枝形成不定根，并在不定根形成后，將該枝從親本植物中分離，并種植新植物。備選地或另外地，例如通過切割植物、植物部分或小植株的一部分或者使用上述方法，可以誘導(dǎo)植物或小植株或植物部分形成愈傷組織，并在足夠變成小植株或植物的條件下維持該愈傷組織。如本文中所示例，如本文中所述根據(jù)任一實(shí)施方案的啟動(dòng)子對于在植物或植物細(xì)胞或植物部分中，例如在發(fā)育的胚乳或者其細(xì)胞或組織中表達(dá)核酸是有用的。因此，本發(fā)明提供了本發(fā)明的啟動(dòng)子、活性片段、衍生物、表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體的用途，用于賦予核酸， 例如轉(zhuǎn)基因在植物細(xì)胞或植物部分中的表達(dá)，例如，用于賦予核酸優(yōu)先地或選擇性地在發(fā)育的胚乳中表達(dá)，任選地包括和/或用于阻抑或降低核酸優(yōu)先地或選擇性地在發(fā)育的胚乳中的表達(dá)。本發(fā)明也提供了用于在植物或植物細(xì)胞或植物部分中表達(dá)核酸的方法，所述方法包括(i)提供、產(chǎn)生或獲得包含與核酸有效連接的如本文中所述根據(jù)任一實(shí)施方案的啟動(dòng)子、活性片段、衍生物的轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物部分；和(ii)在一段時(shí)間和在足夠所述核酸表達(dá)的條件下，維持所述轉(zhuǎn)基因植物或子代。在一個(gè)實(shí)例中，該啟動(dòng)子、活性片段或衍生物與植物細(xì)胞、植物部分或植物的內(nèi)源核酸有效連接。備選地，該啟動(dòng)子、活性片段或衍生物與轉(zhuǎn)基因有效連接，例如包含本發(fā)明的表達(dá)載體或表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物部分。在本文中描述了合適的轉(zhuǎn)基因，并加以必要的變更將其應(yīng)用于本發(fā)明的實(shí)施方案。在一個(gè)實(shí)例中，將表達(dá)本發(fā)明的核酸的方法用于賦予核酸優(yōu)先地或選擇性地在發(fā)育的胚乳中表達(dá)，和/或阻抑或降低核酸在發(fā)育的胚乳中優(yōu)先地或選擇性地表達(dá)。優(yōu)選地，該方法另外包括測定核酸在植物、植物細(xì)胞或植物部分中的表達(dá)或表達(dá)牛臭式?；谇笆?，對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，通過調(diào)節(jié)核酸在植物細(xì)胞或植物部分中的表達(dá)，也可以調(diào)節(jié)植物細(xì)胞、植物部分、小植株或整個(gè)植物的表型或性狀，或者可以將表型或性狀賦予植物細(xì)胞、植物部分、小植株或整個(gè)植物。因此，本發(fā)明提供了啟動(dòng)子、活性片段、衍生物、表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體的用途，用于在植物細(xì)胞、植物部分、小植株或整個(gè)植物中修飾表型或性狀，或者用于將表型或性狀賦予植物細(xì)胞、植物部分、小植株或整個(gè)植物。例如，該植物細(xì)胞、植物部分、小植株或整個(gè)植物具有改良的營養(yǎng)特性或具有藥物特性。 備選地或另外地，該植物部分、小植株或整個(gè)植物具有修飾的形態(tài)。在本文中描述了用于調(diào)節(jié)或賦予本文中上述的ー個(gè)或多個(gè)性狀的合適核酸，例如轉(zhuǎn)基因，并加以必要的變更將其應(yīng)用于本發(fā)明的實(shí)施方案。本發(fā)明也提供了用于在植物細(xì)胞、植物部分、小植株或植物中調(diào)節(jié)表型或性狀，或者用于將表型或性狀賦予植物細(xì)胞、植物部分、小植株或植物的方法，所述方法包括(i)提供、產(chǎn)生或獲得包含與核酸有效連接的本發(fā)明啟動(dòng)子、活性片段或衍生物的植物細(xì)胞、植物部分、小植株或植物，所述核酸當(dāng)表達(dá)時(shí)，在植物細(xì)胞、植物部分、小植株或植物中調(diào)節(jié)表型或性狀，或者當(dāng)表達(dá)時(shí)，將表型或性狀賦予植物細(xì)胞、植物部分、小植株或整個(gè)植物；和(ii)在一段時(shí)間和在足夠表達(dá)核酸和修飾或賦予表型或性狀的條件下，維持(i) 項(xiàng)的植物細(xì)胞、植物部分、小植株或植物。在上文中描述了示例性性狀、表型和核酸，并加以必要的變更將其應(yīng)用于本發(fā)明的實(shí)施方案。本發(fā)明也提供了具有修飾的表型或性狀或者新表型或性狀的植物細(xì)胞、植物部分、小植株或植物，所述植物細(xì)胞、植物部分、小植株或植物包含與核酸有效連接的本發(fā)明啟動(dòng)子、活性片段或衍生物，所述核酸當(dāng)表達(dá)時(shí)，在植物細(xì)胞、植物部分、小植株或植物中調(diào)節(jié)表型或性狀，或者當(dāng)表達(dá)時(shí)，將表型或性狀賦予植物細(xì)胞、植物部分、小植株或整個(gè)植物。在上文中描述了示例性性狀、表型和核酸，并加以必要的變更將其應(yīng)用于本發(fā)明的實(shí)施方案。本發(fā)明也提供了用于分離新啟動(dòng)子的方法，例如能在發(fā)育的胚乳或者其細(xì)胞或組織中賦予核酸表達(dá)的啟動(dòng)子。例如，本發(fā)明提供了用于分離胚乳選擇性啟動(dòng)子的方法，所述方法包括(i)鑒定基因的表達(dá)產(chǎn)物，與在吸漲種子或吸漲胚中表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平比較，所述基因的表達(dá)產(chǎn)物在休眠胚中的表達(dá)具有増加的水平；和(ii)分離與所述基因有效連接的啟動(dòng)子，其中所述啟動(dòng)子賦予在胚乳中的選擇性表込。優(yōu)選地，用于分離如本文中所述根據(jù)任一實(shí)施方案的啟動(dòng)子的方法包括
(i)在休眠胚中測定多個(gè)表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平；(ii)在吸漲種子或吸漲胚中測定多個(gè)表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平；(iii)將⑴項(xiàng)與(ii)項(xiàng)比較，鑒定以增加的水平表達(dá)的ー個(gè)或多個(gè)表達(dá)產(chǎn)物； 和(iv)分離賦予(iii)項(xiàng)的ー個(gè)或多個(gè)表達(dá)產(chǎn)物表達(dá)的啟動(dòng)子。優(yōu)選地，檢測的表達(dá)產(chǎn)物是由基因編碼的轉(zhuǎn)錄物或mRNA。例如，使用微陣列檢測轉(zhuǎn)錄物或mRNA。本說明書包括使用本文中權(quán)利要求后給出的f^atenth Version 3. 5制作的核苷酸和氨基酸序列信息。每ー核苷酸序列以數(shù)字指示符<210>列出的順序鑒定，之后是序列標(biāo)識符(例如<210>1、<210>2、<210>3等)。對于每一核苷酸序列，序列的長度和類型(DNA、 蛋白質(zhì)(PRT)等)，以及來源生物都分別通過在數(shù)字指示符區(qū)<211>、<212>和<213>提供的信息表明。通過術(shù)語“SEQ ID NO :”，然后通過序列標(biāo)識符定義在說明書中提及的核苷酸序列(例如SEQ ID NO 1指在序列列表中指定為<400>1的序列)。在本文中所提及的核苷酸殘基的命名為由IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì) (IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推薦的那些核苷酸殘基命名，其中A 表示腺嘌呤、C表示胞嘧啶、G表示鳥嘌呤、T表示胸腺嘧啶、Y表示嘧啶殘基、R表示嘌呤殘基、M表示腺嘌呤或胞嘧啶、K表示鳥嘌呤或胸腺嘧啶、S表示鳥嘌呤或胞嘧啶、W表示腺嘌呤或胸腺嘧啶、H表示除鳥嘌呤以外的核苷酸、B表示除腺嘌呤以外的核苷酸、V表示除胸腺嘧啶以外的核苷酸、D表示除胞嘧啶以外的核苷酸和N表示任一核苷酸殘基。在該說明書中，除非另外特別說明或者上下文另外要求，提及的単一步驟、物質(zhì)的組合物、步驟組合或者物質(zhì)組合物的組合應(yīng)當(dāng)包括這些步驟、物質(zhì)的組合物、步驟組合或物質(zhì)組合物的組合的ー個(gè)和多個(gè)(即ー個(gè)或多個(gè))。除非另外特別說明，加以必要的變更，可以將本文中所述的每一實(shí)施方案應(yīng)用于每ー個(gè)其他實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本文中所述的發(fā)明容許除那些特定描述之外的改變和修改。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明包括全部此類變化和修改。本發(fā)明也単獨(dú)地或共同地包括在該說明書中提及的或者指出的全部步驟、特征、組合物和化合物，和所述步驟或特征的任一和/ 或全部組合或者任意兩個(gè)或多個(gè)。本發(fā)明并不受本文中所述的特定實(shí)施方案的范圍限制，所述特定實(shí)施方案僅用于示例性目的。如本文中所述，功能性等同的產(chǎn)物、組合物和方法都明確包括于本發(fā)明的范圍內(nèi)。如本文中所用，術(shù)語“衍生自”應(yīng)當(dāng)用于指獲自特定來源的具體的完整事物 (integer)，盡管并不需要直接來自該來源。附圖簡述圖Ia提供了顯示用于Affymetrix GeneChip 小麥基因組陣列的未成熟胚總 RNA、標(biāo)記的cRNA和片段化cRNA樣品的質(zhì)量的圖示。圖Ib提供了顯示用于Affymetrix GeneChip 小麥基因組陣列的M小時(shí)吸漲種子總RNA、標(biāo)記的cRNA和片段化cRNA樣品的質(zhì)量的圖示。圖Ic提供了顯示用于Affymetrix GeneChip 小麥基因組陣列的48小時(shí)吸漲種子總RNA、標(biāo)記的cRNA和片段化cRNA樣品的質(zhì)量的圖示。圖加是顯示用于分離WP05啟動(dòng)子序列的瓊脂糖凝膠圖示的副本，其中已經(jīng)分離了在GenomeWalker 測定法中擴(kuò)增的來自小麥的核酸片段。在泳道6中分離了分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖2b是顯示用于分離WP07啟動(dòng)子序列的瓊脂糖凝膠的圖示的副本，其中已經(jīng)分離了在GenomeWalker 測定法中擴(kuò)增的來自小麥的核酸片段。在泳道5中分離了分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖3是命名為pBSubi: :bar-nos_R4R3(SEQ ID NO :10)的載體的示意圖，其是用于克隆啟動(dòng)子和/或報(bào)告基因的基礎(chǔ)載體。該載體包含Ubi :bar-nos選擇盒和用于啟動(dòng)子、 報(bào)告基因和終止序列Entry Clone的R4R3多點(diǎn)(Gateway 進(jìn)入點(diǎn)。該基礎(chǔ)載體用于產(chǎn)生每一啟動(dòng)子的生物射彈轉(zhuǎn)化載體。圖 4 是載體 pPZP200 35S hph 35S R4R3 (SEQ ID NO: 11)的示意圖，其含有 35S::hph-35M選擇盒和用于啟動(dòng)子、報(bào)告基因和終止序列Entry Clone的R4R3多點(diǎn) Gateway 進(jìn)入點(diǎn)。該基礎(chǔ)載體用于產(chǎn)生每ー啟動(dòng)子的雙元轉(zhuǎn)化載體。圖5是載體pMPB0098 (SEQ ID NO 12)的示意圖，其是用于使用農(nóng)桿菌將WP05小麥啟動(dòng)子(SEQ ID NO 3)引入到細(xì)胞中的雙元載體。該載體衍生自pPZP200 35S hph 35S R4R3，其中已經(jīng)將小麥啟動(dòng)子、合成的綠色熒光蛋白(sGFP)和NOS終止子插入到了 R4R3多點(diǎn) Gateway iaA好、中。圖6是顯示載體pMPB0099(SEQ ID NO 13)的示意圖，其是用于使用粒子轟擊的方法將WP05小麥啟動(dòng)子(SEQ ID NOd)引入到細(xì)胞中的載體。該載體衍生自 pBSubi: :bar-nos_R4R3，其中已經(jīng)將小麥啟動(dòng)子、合成的綠色熒光蛋白(sGFP)和NOS終止子插入到了 R4R3多點(diǎn)Gateway 進(jìn)入點(diǎn)中。圖7是載體pMPB0084(SEQ ID NO :14)的示意圖，其是用于使用農(nóng)桿菌的方法將來自小麥的2066bp小麥啟動(dòng)子引入到細(xì)胞中的雙元載體。該載體衍生自pPZP20035S hph 35S R4R3，其中已經(jīng)將2066bp小麥啟動(dòng)子、合成的綠色熒光蛋白(sGFP)和NOS終止子插入到了 R4R3多點(diǎn)(Gateway 進(jìn)入點(diǎn)中。圖8是顯示載體pMPB0085 (SEQ ID NO :15)的示意圖，其是用于使用粒子轟擊的方法將來自小麥的2066bp小麥啟動(dòng)子引入到細(xì)胞中的載體。該載體衍生自 pBSubi: :bar-nos_R4R3，其中已經(jīng)將2066bp小麥啟動(dòng)子、合成的綠色熒光蛋白(sGFP)和 NOS終止子插入到了 R4R3多點(diǎn)Gateway 進(jìn)入點(diǎn)中。圖9是顯示載體pMPB0086(SEQ ID NO :16)的示意圖，其是用于使用農(nóng)桿菌的方法將來自小麥的2400bp小麥啟動(dòng)子引入到細(xì)胞中的雙元載體。該載體衍生自pPZP200 35S hph 35S R4R3，其中已經(jīng)將MOObp小麥啟動(dòng)子、合成的綠色熒光蛋白(sGFP)和NOS終止子插入到了 R4R3多點(diǎn)Gateway 進(jìn)入點(diǎn)中。


圖10是顯示載體pMPB0087(SEQ ID NO :17)的示意圖，其是用于使用粒子轟擊的方法將來自小麥的MOObp小麥啟動(dòng)子引入到細(xì)胞中的載體。該載體衍生自 pBSubi: :bar-nos_R4R3，其中已經(jīng)將MOObp小麥啟動(dòng)子、合成的綠色熒光蛋白(sGFP)和 NOS終止子插入到了 R4R3多點(diǎn)Gateway 進(jìn)入點(diǎn)中。
圖11是顯示用于在轉(zhuǎn)基因玉米中表達(dá)WP05:⑶S-nos表達(dá)盒的載體RHFl 12qc (SEQ ID NO :18)的示意圖。其包含與內(nèi)含子和⑶S報(bào)告基因有效連接的玉米pZMNP-20啟動(dòng)子。
圖12是顯示用于在轉(zhuǎn)基因玉米中表達(dá)表達(dá)盒WP07::⑶S-nos (含有MOObp WP07 啟動(dòng)子)的載體RHF121(SEQ ID NO :19)的示意圖。
圖13是顯示用于使用生物射彈轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化小麥的方法示意流程圖。
圖14提供了顯示小麥(MPB Bobwhite 26)的生物射彈轉(zhuǎn)化物的多個(gè)階段的圖示。 圖A顯示供體植物產(chǎn)生；圖B-D顯示合子胚分離和轟擊；圖E-H顯示愈傷組織誘導(dǎo)和在草銨膦選擇下的再生；圖I顯示選擇下的根形成；圖J顯示用于轉(zhuǎn)基因子代回收的在控制的溫室條件下的TO植物培養(yǎng)。
圖15提供了顯示使用真空滲透的擬南芥(Arabidopsis thaliana)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的多個(gè)階段圖示。圖A顯示小麥(MPB Bobwhite 26) 0圖A顯示在小簍中萌發(fā)的擬南芥Columbia種子；圖B和C顯示在真空下用于在農(nóng)桿菌懸浮液中進(jìn)行花浸染的大約4周齡幼苗；圖D顯示分離并培養(yǎng)成熟的擬南芥屬植物；圖E和F顯示種子表面消毒和種植在選擇培養(yǎng)基上，將推定的轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)移到具有ARAC0N 基料的土壌和管中，用于T2種子收條。
圖16提供了顯示在授粉后第10-14天，定位于轉(zhuǎn)基因種子的胚乳而不是定位在胚或定位在非轉(zhuǎn)基因種子中的由小麥WP05啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GFP表達(dá)的圖示。
圖17提供了顯示在授粉后第25-30天，定位于轉(zhuǎn)基因種子的胚乳而不是定位在胚或定位在非轉(zhuǎn)基因種子中的由小麥WP05啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GFP表達(dá)的圖示。
圖18提供了顯示在授粉后第10-14天，定位于轉(zhuǎn)基因種子的胚乳而不是定位在胚或定位在非轉(zhuǎn)基因種子中的由小麥WP07啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GFP表達(dá)的圖示。
圖19提供了顯示在授粉后第25-30天，定位于轉(zhuǎn)基因種子的胚乳而不是定位在胚或定位在非轉(zhuǎn)基因種子中的由小麥WP07啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GFP表達(dá)的圖示。圖20提供了顯示在轉(zhuǎn)基因玉米種子的胚乳中由小麥WP05啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS報(bào)告基因的強(qiáng)空間表達(dá)的圖示。在授粉后第5天在轉(zhuǎn)基因種子的胚乳中可見表達(dá)。圖21提供了顯示在轉(zhuǎn)基因玉米種子的胚乳中由小麥WP07啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS報(bào)告子基因的強(qiáng)空間表達(dá)的圖示。在授粉后第10天在轉(zhuǎn)基因種子的胚乳中可見表達(dá)。圖 22 提供了 L0C_0s0IgO 1290. 1 和 ZmGSStucl 1-12-04. 64626. 1 之間序列比對的示意圖，使用-1的核苷酸錯(cuò)配罰分，將L0C_0s01g0U90. 1用作為查詢序列，通過BLASTn檢索從玉米基因組集合(Maize Genomic Assemblies)獲得 ZmGSStucl 1-12-04· 64626. 1。圖23提供了在非重疊玉米基因集群ZmGSStucl 1-12-04. 16895. 1和 ZmGSStucl 1-12-04. 7167. 1之間序列比對的示意圖，將DQ244863. 1用作為查詢序列，通過 BLASTn檢索從玉米基因組集合獲得ZmGSStucl 1-12-04. 7167. 1。圖M提供了 DQ244863. 1和高粱基因集合SbGSStucl 1-12-04. 1189. 1之間序列比對的示意圖，將DQM4863. 1用作為查詢序列，通過BLASTn檢索從高粱基因組集合(Sorghum Genomic Assemblies)獲得 SbGSStucl 1-12-04· 1189. 1。優(yōu)選實(shí)施方案的詳述用于測定本發(fā)明啟動(dòng)子的序列分析參數(shù)a)序列鑒定限制
25
在測定兩個(gè)氨基酸序列是否都屬于本文所定義的百分比同一性限制范圍內(nèi)吋，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道，可以進(jìn)行氨基酸序列的逐一對比。在此類對比或比對中，取決于進(jìn)行比對所使用的算法，會(huì)在不相同的殘基處產(chǎn)生差異。在本文中，提及的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸序列的百分比同一性或相似性應(yīng)當(dāng)用于指，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)算法測定的所述序列之間，分別的相同和相似殘基數(shù)目。具體而言，使用美國Computer Genetics Group, Inc. , University Research ParK, Maddison, Wisconsin 的軟件，例如使用 Devereaux Φ 人的 GAP 程序，Nucl. Acids Res. 12，387-395，1984 (其應(yīng)用 Needleman 和 Wunsch 的算法， J. Mol. Biol. 48,443-453,1970)計(jì)算氨基酸同一性和類似性。備選地，將Thompson等人的 CLUSTAL W算法，Nucl. Acids Res. 22，4673_4680，1994用于獲得多個(gè)序列的比對，其中在比對中必需或期望最大化相同/類似殘基的數(shù)目并最小化序列缺ロ的數(shù)目和/或長度。ι iik， National Center for Biotechnology Information (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)(Altschul 等人 J. Mol. Biol. 215 :403-410,1990) 提供了ー套通常使用的并且免費(fèi)的序列對比算法，其可從幾個(gè)來源得到，包括NCBI， Bethesda, Md.。BLAST軟件套件包括多種序列分析程序，包括用于將已知核苷酸序列與來自多個(gè)數(shù)據(jù)庫的其他多核苷酸序列比對的“blastn”和用于將已知氨基酸序列與來自ー個(gè)或多個(gè)數(shù)據(jù)庫的ー個(gè)或多個(gè)序列比對的“blastp”。還可以得到的是用于兩個(gè)核苷酸序列的直接兩兩對比的稱為“BLAST 2 kquences”的工具。在測定兩個(gè)核苷酸序列是否都屬于本文中所列出的特定百分比同一性限制內(nèi)吋， 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道，可以進(jìn)行序列的逐一對比或多重比對。在此類對比或比對中，取決于進(jìn)行比對所使用的算法，會(huì)在不相同的殘基處產(chǎn)生差異。在本文中，提及的兩個(gè)或多個(gè)核苷酸序列的百分比同一性應(yīng)當(dāng)用于指，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)算法測定的所述序列之間相同殘基的數(shù)目。例如，使用BESTFIT程序或其他Computer Genetics Group, Inc. ,University Research Park,Madison, Wisconsin,美國(Devereaux‘人，Nucl. Acids Res. 12，387-395，1984)合適的程序可以比對核苷酸序列并計(jì)算它們的同一性。如上所討論，對于比對核苷酸序列和測定百分比同一性，BLAST也是有用的。本文中所提及的使用術(shù)語“至少”或“至少約”的序列同一性的特定水平應(yīng)當(dāng)用于包括序列同一性大于所列出的水平的任一水平。因此，本發(fā)明包括與所列出的序列至少約 80%同一性、或者與所列出的序列至少約85%同一性、或者與所列出的序列至少約90%同一性、或者與所列出的序列至少約95%同一性、或者與所列出的序列至少約98%或99%同一性的核苷酸序列或氫基酸序列。b)順式作用元件的分析用于測定啟動(dòng)子是否包含順式作用元件的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。 例如，使用本領(lǐng)域已知的和/或本文中所述的方法分離啟動(dòng)子，并使用本領(lǐng)域已知的和/ 或本文中所述的方法測定啟動(dòng)子的序列，例如在Ausube等人(在Current Protocols in Molecular Biology。Wiley Interscience, ISBN 047 150338，1987 中)禾ロ Sambrook 等人 (在Molecular Cloning :Molecular Cloning :A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratories, New York，第三版2001中)中述及的方法。例如，使用如基于PCR的基因組步移或者例如如在本文中所述通過篩選核酸文庫，分離包含編碼含有至少ー個(gè)最小GILT 結(jié)構(gòu)域的多肽序列的核酸的啟動(dòng)子或其片段，并使用例如，基于雙脫氧核苷酸的測序，測定啟動(dòng)子的序列。然后分析該序列以測定其是否包含上文中所述的順式作用元件的一個(gè)或多個(gè)?？梢允褂煤线m的軟件分析啟動(dòng)子區(qū)的序列，以測定該序列內(nèi)包含的順式作用元件。合適的軟件包括⑴如在Higo 等人，Nucl. Acids Res. 27 :297_300，1999 中所述的并可從National Institute of Agrobiological Sciences，Ibaraki，日本得到的 PLACE (植物順式作用 DNA 元件)；(ii)如在Thijs 等人，J Comput Biol. 9 :447_464，2002 中所述的并可從Flanders Interuniversity Institute for Biotechnology (VIB), Zwi jnaarae,比利時(shí)得至Ij的 Plant CARE(順式作用調(diào)節(jié)元件)；和(iii)如在 Shahmuradov 等人，Nucleic Acids Res. 31 :114-7,2003 中所述的 PlantProm 數(shù)據(jù)庫。如上文中所討論，本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了多個(gè)啟動(dòng)子，并通過分析這些啟動(dòng)子的序列，已經(jīng)鑒定了保守的順式作用元件，例如來自能在休眠胚或者其細(xì)胞或組織中賦予核酸表達(dá)或表達(dá)模式的啟動(dòng)子的保守順式作用元件。在示例性啟動(dòng)子序列中包含的示例性順式作用元件在本文中描述于表4-8中。表1中描述了在5個(gè)示例之間保守的示例性順式作用元件。因此，優(yōu)選的是，如在本文中所述根據(jù)任一實(shí)施方案的啟動(dòng)子包含表1中所述的ー個(gè)或多個(gè)順式作用元件。表權(quán)利要求
1.分離的啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物，所述分離的啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物能賦予與其有效連接的基因在發(fā)育的植物種子的胚乳中選擇性地表達(dá)，其中所述啟動(dòng)子在其天然情況下賦予基因組基因胚乳選擇性地表達(dá)或者優(yōu)先的胚乳表達(dá)，所述基因組基因包含選自如下的序列(i)SEQ ID NO :1或2中所述的序列；( )編碼與由SEQ ID NO :1或2編碼的多肽具有至少約50%同一性的多肽的序列，其中所述多肽在發(fā)育的種子的胚乳中選擇性地表達(dá)；(iii)在至少中等嚴(yán)格條件下與⑴或(ii)項(xiàng)的序列或者其互補(bǔ)序列雜交的序列，其中所述雜交序列在發(fā)育的種子的胚乳中選擇性地表達(dá)；和(iv)如通過用BLASTN算法，例如用至少-1的核苷酸錯(cuò)配罰分(_q)的同源檢索測定的與⑴或(ii)項(xiàng)的序列具有同源性的序列，其中所述同源序列在發(fā)育的種子的胚乳中選擇性地表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的啟動(dòng)子、活性片段或衍生物，其中所述啟動(dòng)子、片段或衍生物能賦予與其有效連接的基因在單子葉植物的發(fā)育的種子中胚乳選擇性地表達(dá)或者優(yōu)先的胚乳表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的啟動(dòng)子、活性片段或衍生物，其來自單子葉植物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的分離的啟動(dòng)子、活性片段或衍生物，其中所述單子葉植物選自小麥、玉米、稻、大麥和高粱，以及它們的組合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的啟動(dòng)子、活性片段或衍生物，其中所述啟動(dòng)子、活性片段或衍生物在從授粉后(DAP)約5天至授粉后至少約25天期間，能賦予與其有效連接的基因胚乳選擇性地表達(dá)或優(yōu)先的胚乳表達(dá)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的啟動(dòng)子、活性片段或衍生物，其中所述啟動(dòng)子、片段或衍生物在營養(yǎng)組織或器官中并不賦予可檢測的表達(dá)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的啟動(dòng)子、活性片段或衍生物，其中所述啟動(dòng)子、片段或衍生物在繁殖組織或器官中并不賦予可檢測的表達(dá)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的啟動(dòng)子、活性片段或衍生物，其中所述啟動(dòng)子、片段或衍生物在花組織或器官中并不賦予可檢測的表達(dá)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的啟動(dòng)子、活性片段或衍生物，其中所述啟動(dòng)子、片段或衍生物在胚中并不賦予可檢測的表達(dá)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的啟動(dòng)子、活性片段或衍生物，其中所述啟動(dòng)子、片段或衍生物在成熟種子的胚乳中并不賦予可檢測的表達(dá)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的啟動(dòng)子、活性片段或衍生物，其中所述啟動(dòng)子、片段或衍生物賦予、誘導(dǎo)或活化與其有效連接的基因胚乳特異性表達(dá)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的啟動(dòng)子、活性片段或衍生物，其中所述啟動(dòng)子包含在表4和/或表5和/或表6和/或表7和/或表8中所述的一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的分離的啟動(dòng)子、活性片段或衍生物，其中所述啟動(dòng)子包含表1中所述的一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的分離的啟動(dòng)子、活性片段或衍生物，其中所述啟動(dòng)子包含多個(gè)在其來源的相應(yīng)基因組基因的翻譯起始位點(diǎn)上游近端750bp中的選自下組的各個(gè)元件ARR1AT 元件、ACGTATERD1 元件、CAATB0X1 元件、CACFTPPCA1 元件、CUREC0RECR 元件、 D0FC0REZM 元件、EB0XBNNAPA 元件、GATAB0X 元件、GTl CONSENSUS 元件、GTGANTG10 元件和 MYCCONSENSUSAT 元件。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的分離的啟動(dòng)子、活性片段或衍生物，其中每一元件在其來源的相應(yīng)基因組基因的翻譯起始位點(diǎn)上游近端750bp中出現(xiàn)至少2或3或4或5或6次。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的分離的啟動(dòng)子、活性片段或衍生物，其中CACFTPPCA1元件、 D0FC0REZM元件和GT1C0NSENSUS元件在其來源的相應(yīng)基因組基因的翻譯起始位點(diǎn)上游近端750bp中各自出現(xiàn)至少4次。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的分離的啟動(dòng)子、活性片段或衍生物，其中ARRlAT元件、 CUREC0RECR 元件、D0FC0REZM 元件、EB0XBNNAPA 元件、GTGANTG10 元件和 MYCCONSENSUSAT 元件在其來源的相應(yīng)基因組基因的翻譯起始位點(diǎn)上游近端750bp中各自出現(xiàn)至少4次。
17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的分離的啟動(dòng)子、活性片段或衍生物，其進(jìn)一步在翻譯起始位點(diǎn)上游近端750bp中包含至少一種元件，所述元件選自IB0XC0RE元件、MYB2C0NSENSUS元件、MYBC0RE元件和WRKY710S元件。
18.根據(jù)權(quán)利要求13所述的分離的啟動(dòng)子、活性片段或衍生物，其進(jìn)一步在翻譯起始位點(diǎn)上游近端750bp中包含至少一種元件，所述元件選自MYBSTl元件、MYBC0REATCYCB1元件和 PREC0NSCRHSP70A 元件。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的啟動(dòng)子、活性片段或衍生物，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列選自⑴選自SEQ ID NO :3、4、5、6、7和8的序列；( )與(i)項(xiàng)的序列互補(bǔ)的序列；(iii)與(i)或(ii)項(xiàng)的序列具有至少約70%序列同一性的序列；和(iv)可以使用一個(gè)或多個(gè)擴(kuò)增引物從基因組DNA中擴(kuò)增的序列，其中每一所述引物包含來源于SEQ ID NO :1或2或者其互補(bǔ)序列的至少約12個(gè)連續(xù)核苷酸長度的序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的啟動(dòng)子、活性片段或衍生物，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列選自⑴選自SEQ ID NO :3、4、5、6、7和8的序列；和( )與(i)項(xiàng)的序列互補(bǔ)的序列。
21.表達(dá)構(gòu)建體，其包含與轉(zhuǎn)基因有效連接的根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物。
22.表達(dá)載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物。
23.權(quán)利要求22的表達(dá)載體，其進(jìn)一步包含轉(zhuǎn)基因，其中所述啟動(dòng)子與所述轉(zhuǎn)基因有效連接。
24.權(quán)利要求21的表達(dá)構(gòu)建體或者權(quán)利要求23的表達(dá)載體，其中所述轉(zhuǎn)基因包含編碼多肽、siRNA、RNAi、反義RNA或微RNA的序列。
25.權(quán)利要求21的表達(dá)構(gòu)建體或者權(quán)利要求22的表達(dá)載體，其用于植物的生物射彈轉(zhuǎn)化。
26.權(quán)利要求21的表達(dá)構(gòu)建體或者權(quán)利要求22的表達(dá)載體，其用于植物的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。
27.用于產(chǎn)生表達(dá)構(gòu)建體的方法，所述方法包括將根據(jù)權(quán)利要求1的分離啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物與轉(zhuǎn)基因連接，以使所述啟動(dòng)子能賦予所述轉(zhuǎn)基因在細(xì)胞中表達(dá)。
28.用于產(chǎn)生表達(dá)載體的方法，所述方法包括將根據(jù)權(quán)利要求1的分離啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物與空載體連接，從而產(chǎn)生表達(dá)載體。
29.用于產(chǎn)生表達(dá)載體的方法，所述方法包括將根據(jù)權(quán)利要求21的表達(dá)構(gòu)建體與空載體連接，從而產(chǎn)生表達(dá)載體。
30.權(quán)利要求1的分離啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物的用途，用于產(chǎn)生表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體。
31.轉(zhuǎn)基因植物部分或植物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1的分離啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的轉(zhuǎn)基因植物部分或植物，其中所述啟動(dòng)子、活性片段或衍生物與所述植物細(xì)胞或植物部分或植物的內(nèi)源核酸有效連接。
33.根據(jù)權(quán)利要求31所述的轉(zhuǎn)基因植物部分或植物，其中所述啟動(dòng)子、活性部分或衍生物與轉(zhuǎn)基因有效連接。
34.轉(zhuǎn)基因植物部分或植物，其包含根據(jù)權(quán)利要求21所述的表達(dá)構(gòu)建體或者權(quán)利要求 22所述的表達(dá)載體。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的轉(zhuǎn)基因植物部分或植物，其中所述表達(dá)構(gòu)建體已經(jīng)整合到植物細(xì)胞、植物部分或植物的核酸中。
36.根據(jù)權(quán)利要求34所述的轉(zhuǎn)基因植物部分或植物，其中所述表達(dá)構(gòu)建體或表達(dá)載體在附加體中或者在染色體外。
37.用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法，所述方法包括將根據(jù)權(quán)利要求1的分離啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物或者根據(jù)權(quán)利要求21的表達(dá)構(gòu)建體或者權(quán)利要求22的表達(dá)載體引入到植物細(xì)胞中。
38.權(quán)利要求37所述的方法另外包括提供或獲得根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物或者根據(jù)權(quán)利要求21的表達(dá)構(gòu)建體或者權(quán)利要求22的表達(dá)載體。
39.用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物或小植株的方法，所述方法包括(i)進(jìn)行權(quán)利要求37所述的方法，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞；和( )從(i)項(xiàng)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中再生轉(zhuǎn)基因植物或小植株或小植株，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物或小植株或植物部分。
40.權(quán)利要求39所述的方法另外包括，在一段時(shí)間和在足夠種子產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物。
41.權(quán)利要求40所述的方法進(jìn)一步包括，獲得包含引入的啟動(dòng)子、活性片段或衍生物的種子。
42.權(quán)利要求41所述的方法進(jìn)一步包括，從包含引入的啟動(dòng)子、活性片段或衍生物的轉(zhuǎn)基因植物或小植株中獲得植物部分。
43.權(quán)利要求39所述的方法另外包括，提供所述植物和/或其子代植物和/或其種子和/或其繁殖物質(zhì)和/或其繁殖材料和/或其種質(zhì)，其中所述植物、子代植物、種子、繁殖物質(zhì)、繁殖材料或種質(zhì)包含引入到轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的啟動(dòng)子、其活性片段或衍生物。
44.根據(jù)權(quán)利要求1的啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物在產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物部分和/或轉(zhuǎn)基因植物中的用途。
45.用于產(chǎn)生來自植物的轉(zhuǎn)基因種子的方法，所述方法包括提供、產(chǎn)生或獲得根據(jù)權(quán)利要求31的轉(zhuǎn)基因植物，并在一段時(shí)間和在足夠種子產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)或者維持所述轉(zhuǎn)基因植物。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法另外包括獲得種子，所述種子包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物或者根據(jù)權(quán)利要求21所述的表達(dá)構(gòu)建體或者根據(jù)權(quán)利要求22所述的表達(dá)載體。
47.用于育種轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括(i)通過進(jìn)行根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物或者根據(jù)權(quán)利要求31獲得轉(zhuǎn)基因植物；和( )育種(i)項(xiàng)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物，從而產(chǎn)生包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物或者權(quán)利要求21所述的表達(dá)構(gòu)建體或者權(quán)利要求22所述的表達(dá)載體的合子。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其另外包括培養(yǎng)合子以形成轉(zhuǎn)基因胚和/或轉(zhuǎn)基因小植株和/或轉(zhuǎn)基因植物。
49.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中獲得的轉(zhuǎn)基因植物包含獲得的包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物或者權(quán)利要求21所述的表達(dá)構(gòu)建體或者權(quán)利要求22所述的表達(dá)載體的種子，并培養(yǎng)所述種子從而獲得轉(zhuǎn)基因植物。
50.用于育種轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括(i)通過進(jìn)行根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物或小植株或植物部分或者獲得根據(jù)權(quán)利要求31的轉(zhuǎn)基因植物；和( )在一段時(shí)間和在足夠所述植物無性繁殖的條件下維持所述轉(zhuǎn)基因植物。
51.用于在發(fā)育的胚乳或者其細(xì)胞或組織中表達(dá)核酸的方法，所述方法包括(i)提供、獲得或產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物部分，所述轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物部分包含與核酸有效連接的根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物；和( )在一段時(shí)間和在足夠所述核酸表達(dá)的條件下維持所述轉(zhuǎn)基因植物或子代。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中所述核酸對于植物、植物細(xì)胞或植物組織是內(nèi)源的。
53.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中所述核酸是轉(zhuǎn)基因。
54.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，包括提供、獲得或產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物部分，所述轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物部分包含根據(jù)權(quán)利要求21所述的表達(dá)構(gòu)建體或者根據(jù)權(quán)利要求22所述的表達(dá)載體。
55.權(quán)利要求M所述的方法進(jìn)一步包括在發(fā)育的胚乳或者其細(xì)胞或組織中測定轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。
56.根據(jù)權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物或者權(quán)利要求21所述的表達(dá)構(gòu)建體或者權(quán)利要求22所述的表達(dá)載體的用途，用于在植物細(xì)胞或植物部分或植物中表達(dá)核酸。
57.根據(jù)權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物或者權(quán)利要求21所述的表達(dá)構(gòu)建體或者權(quán)利要求22所述的表達(dá)載體的用途，用于調(diào)節(jié)與其有效連接的轉(zhuǎn)基因在發(fā)育的胚乳中的表達(dá)。
58.用于在植物部分或植物中調(diào)節(jié)或賦予表型或性狀的方法，所述方法包括(i)提供、獲得或產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物、植物細(xì)胞或植物部分，所述轉(zhuǎn)基因植物、植物細(xì)胞或植物部分包含與核酸有效連接的根據(jù)權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物， 所述核酸的表達(dá)在植物細(xì)胞和/或植物部分和/或植物中調(diào)節(jié)或賦予表型；和( )在一段時(shí)間和在足夠核酸表達(dá)的條件下維持(i)項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因植物、植物細(xì)胞或植物部分。
59.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中所述啟動(dòng)子、活性片段或衍生物與轉(zhuǎn)基因有效連接。
60.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，包括提供、獲得或產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物或植物部分，所述轉(zhuǎn)基因植物或植物部分包含權(quán)利要求21所述的表達(dá)構(gòu)建體或者權(quán)利要求22所述的表達(dá)載體。
61.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，用于改良植物的產(chǎn)量。
62.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，用于賦予植物疾病抗性。
63.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，用于賦予植物或植物部分營養(yǎng)特性。
64.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中所述表型或性狀產(chǎn)生或者增強(qiáng)工業(yè)、藥物、獸醫(yī)或農(nóng)業(yè)產(chǎn)品的產(chǎn)生。
65.根據(jù)權(quán)利要求64所述的方法，用于產(chǎn)生或者增強(qiáng)淀粉、釀造或發(fā)酵飲料或食物、面粉、含面粉的產(chǎn)品、淀粉類食物、脂肪酸、食用油、紙張、紡織品、乙醇或工業(yè)聚合物的產(chǎn)量。
66.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，用于調(diào)節(jié)植物形態(tài)。
67.根據(jù)權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物的用途，用于在植物、植物細(xì)胞或植物部分中調(diào)節(jié)或賦予表型或性狀。
68.根據(jù)權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物的用途，用于賦予植物疾病抗性。
69.根據(jù)權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物的用途，用于賦予植物或植物部分營養(yǎng)特性。
70.根據(jù)權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物的用途，用于賦予植物或植物部分藥物特性。
71.根據(jù)權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物的用途，用于產(chǎn)生工業(yè)、藥物、獸醫(yī)或農(nóng)業(yè)產(chǎn)品。
72.根據(jù)權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物的用途，用于產(chǎn)生淀粉、釀造或發(fā)酵飲料或食物、面粉、含面粉的產(chǎn)品、淀粉類食物、脂肪酸、食用油、紙張、紡織品、乙醇或工業(yè)聚合物。
73.根據(jù)權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子或者其活性片段或衍生物的用途，用于調(diào)節(jié)植物形態(tài)。
全文摘要
本發(fā)明提供包含植物有效的啟動(dòng)子序列的材料的組合物，其賦予與它們有效連接的基因選擇性地/特異性地胚乳表達(dá)，以及此類組合物賦予基因表達(dá)的用途，特別在發(fā)育的胚乳中賦予基因表達(dá)的用途。
文檔編號A01H5/00GK102575249SQ201080026745
公開日2012年7月11日 申請日期2010年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月17日
發(fā)明者C·拉馬熱, G·斯潘根伯格, H·付, H-S·宋, R-G·甄, U·約翰 申請人:巴斯夫植物科學(xué)有限公司