專利名稱：抗vegf抗體和其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗VEGF抗體、包含抗VEGF抗體的醫(yī)藥組合物和這些抗體的治療用途。
背景技術(shù)：
血管生成因牽涉到多種病理學(xué)病狀而成為了有吸引力的治療目標(biāo)，所述病理學(xué)病狀包括腫瘤生長、增生性視網(wǎng)膜病、年齡相關(guān)性黃斑部變性、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)和牛皮癬(弗克曼(Folkman)等人，1992，生物化學(xué)雜志(J. Biol. Chem.) 267 10931-10934) 根據(jù)對移殖腫瘤所誘導(dǎo)的強(qiáng)烈新生血管反應(yīng)的觀察結(jié)果第一次指明了特定分子血管生成因子?，F(xiàn)已知血管生成是大多數(shù)原發(fā)腫瘤生長和其后續(xù)轉(zhuǎn)移所必需的。此后眾多分子已與血管生成的正調(diào)控相關(guān)聯(lián)，所述分子包括轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-Ci ,TGF-β、肝細(xì)胞生長因子 (HGF)、腫瘤壞死因子-α、血管生成素、白細(xì)胞介素(IL)-S和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF，也稱為 VEGFA或血管通透性因子(vascular permeability factor, VPF))(費(fèi)瑞拉(Ferrara) 等人，2003，自然-醫(yī)學(xué)(Nature Medicine) 9 :669-676)。VEGF蛋白質(zhì)是與正常胚胎血小管生成(胚胎循環(huán)系統(tǒng)的重新形成)和異常血管生成(由預(yù)先存在的血管結(jié)構(gòu)生長血管)兩者有關(guān)的重要信號傳導(dǎo)蛋白質(zhì)(費(fèi)瑞拉等人，1996，自然(Nature) 380 :439-442 ；德沃克(Dvorak)等人，1995，美國病理學(xué)雜志(Am. J. Pathol.) 146 =1029-1039)。VEGF與實(shí)體腫瘤和血液科惡性疾病、眼間新生血管綜合癥、 炎癥和腦水腫以及雌性生殖道病變相關(guān)(費(fèi)瑞拉等人，2003，自然-醫(yī)學(xué)，9 :669-676)。VEGF mRNA在許多人類腫瘤中過度表達(dá)，所述人類腫瘤包括肺、乳房、胃腸道、腎、胰臟和卵巢腫瘤 (貝克曼(Berkman)等人，1993，臨床研究雜志(J. Clin. Invest. ),91 =153-159) 眼睛水狀液和玻璃狀液中VEGF的增加已與各種視網(wǎng)膜病相關(guān)聯(lián)(艾俄羅(Aiello)等人，1994， 新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(N.Engl. J.Med. )331 :1480-1487)。年齡相關(guān)性黃斑部變性(AMD)是老年人視力喪失的主要原因，它是由新血管生成和血管滲漏引起。已顯示在受AMD影響的患者的脈絡(luò)膜新生血管膜中VEGF的位置(洛佩茲(Lopez)等人，1996，眼科研究與視力學(xué) (Invest. Ophtalmo. Vis. Sci.) 37 :855-868)。VEGF基因家族包括原型成員VEGFA，以及VEGFB、VEGFC, VEGFD和胎盤生長因子 (PLGF)。人類VEGFA基因被組織成由七個內(nèi)含子隔開的八個外顯子的形式。存在VEGF的至少六種不同的同功異型物VEGF121、VEGF145, VEGF162, VEGF165, VEGF165b, VEGF183、VEGF189 和 VEGF2tl6，其中下標(biāo)是指在信號裂解之后剩余的氨基酸數(shù)目。天然VEGF為45kDa同源二聚肝素結(jié)合糖蛋白(費(fèi)瑞拉等人，2003，自然-醫(yī)學(xué)，9:669-676)。VEGF(尤其VEGFA)結(jié)合于兩種相關(guān)的受體酪氨酸激酶VEGFR-I (也稱為Flt-I)和VEGFR-2 (也稱為Flk-I或激酶域區(qū) (KDR)或⑶309)。各受體都具有七個細(xì)胞外區(qū)域和一個跨膜區(qū)域。VEGF也結(jié)合于神經(jīng)纖毛蛋白NRPl (也稱為血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子165受體(VEGF165R)或⑶304)和NRP2(也稱為血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子165受體2(VEGF165R2))。考慮到VEGF在調(diào)控血管生成方面的重要作用，其為治療性干預(yù)提供了一種有吸引力的目標(biāo)。實(shí)際上，當(dāng)前正在開發(fā)多種旨在阻斷VEGF或其受體信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的治療策略用于治療贅生性疾病?？筕EGF抗體貝伐單抗(bevacizumab)，也稱為rhuMAb VEGF或 Avastin 是一種由基因泰克公司(Genentech)制造和出售的重組人源化抗VEGF單克隆抗體(普雷斯塔(Presta)等人，1997，癌癥研究(Cancer Res. )57 :4593-4599)。為了構(gòu)建貝伐單抗，將鼠類抗VEGF單克隆抗體A. 4. 6. 1的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)接枝到人類框架和IgG 恒定區(qū)上。接著除CDR以外將額外突變引入分子中以改良結(jié)合，得到約93%的氨基酸序列源自人類IgG1且約7%的序列源自鼠類抗體A. 4. 6. 1的抗體。貝伐單抗的分子質(zhì)量為約 149, 000道爾頓且經(jīng)糖基化。蘭尼單抗(Ranibizumab)是一種源自貝伐單抗的親和力成熟的Fab片段。蘭尼單抗對VEGF具有較高親和力且尺寸也較小，從而使其更好地穿透視網(wǎng)膜， 且因此可治療與AMD相關(guān)的眼部新血管生成(李恩(Lien)和羅曼(Lowman)，科納喬瓦斯基(Chernajovsky)，2008，治療性抗體(Therapeutic Antibodies).實(shí)驗(yàn)藥理學(xué)手冊(Handbook of Experimental Pharmacology) 181，施普林格-維拉格出版社 (Springer-Verlag)，柏林海德堡(Berlin Heidelberg) 131-150)。蘭尼單抗是由基因泰克公司開發(fā)且以商標(biāo)名Lucentis 出售。用包括Avastin 的方案治療癌癥患者會導(dǎo)致副作用，包括高血壓、蛋白尿、血栓栓塞事件(thromboembolic event)、出血和心臟毒性(鮑文斯(Blowers)和霍爾(Hall), 2009，英國護(hù)理學(xué)雜志(Br. J. Nurs.) 18 (6) =351-6, 358) 0另外，盡管貝伐單抗是人源化抗體，但其在投予人類時會引起免疫反應(yīng)。此類免疫反應(yīng)可導(dǎo)致在免疫復(fù)合物介導(dǎo)下自循環(huán)中清除抗體或片段，并使得重復(fù)投藥不適用于療法，由此降低對患者的治療益處且限制抗體的再投予。因此，需要提供改良的抗VEGF抗體或片段，其可例如通過產(chǎn)生親和力高于貝伐單抗且可以較低劑量投予的變體或免疫原性和其它副作用比貝伐單抗小的變體來克服一個或一個以上所述問題。
背景技術(shù)：
部分中或本申請案任何其它部分中對任何參考文獻(xiàn)的引用或標(biāo)識不應(yīng)解釋為承認(rèn)此參考文獻(xiàn)可用作本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及與貝伐單抗或蘭尼單抗相比較，免疫原性有所降低和/或?qū)EGF的親和力有所改良的抗VEGF抗體貝伐單抗的變體。貝伐單抗具有三個重鏈CDR，在本文中(按氨基末端到羧基末端的順序)稱為⑶R-H1、⑶R-H2和⑶R-H3 ；以及三個輕鏈⑶R，在本文中(按氨基末端到羧基末端的順序)稱為⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3。貝伐單抗⑶R的序列展示于圖IA和圖IB中，且其編號列于表1 (關(guān)于重鏈CDR)和表2 (關(guān)于輕鏈CDR)中。相關(guān)抗體蘭尼單抗是通過使貝伐單抗親和力成熟而產(chǎn)生。蘭尼單抗具有與貝伐單抗一致的 CDR-L 1、CDR-L2、CDR-L3和CDR-H2序列，但是其CDR-Hl和CDR-H3序列不同于貝伐單抗。蘭尼單抗的重鏈和輕鏈序列展示于圖IC中，且CDR展示于圖ID中。與貝伐單抗和蘭尼單抗相比較，本發(fā)明抗體一般在至少一個重鏈⑶R中具有至少一個氨基酸取代。在某些方面中，與貝伐單抗或蘭尼單抗相比較，抗VEGF抗體包括至少一個選自以下的取代CDR-H1 中的 N31F、CDR-H2 中的 K64S、CDR-H2 中的 K64Q、CDR-H2 中的 Y53F、 CDR-H3 中的 H97E、CDR-H3 中的 H97D、CDR-H3 中的 H97P、CDR-H3 中的 Y98F、CDR-H3 中的 Y99E、CDR-H3 中的 Y99D、CDR_H3 中的 SlOOaG 禾Π CDR-L2 中的 Τ51Α。在其它方面中，抗 VEGF 抗體包括至少一個選自表8和表9的取代?？刹⑷胗H和力改良的變體抗體中的額外突變可為候選脫免疫取代(deimmunizing substitution)，例如表6中所述者；以及其它突變，例如不會破壞抗體結(jié)合于VEGF的能力的取代，包括(但不限于)表10和表11中所述的突變， 或已知突變，例如表12-1到12-9和表13中所述的突變?？珊喜⒌钠渌蛔儼?但不限于)表14到表16中所述的突變。在特定實(shí)施例中，本發(fā)明的抗VEGF抗體包括選自表7的取代和任選存在的一個或一個以上額外突變的組合，所述額外突變?yōu)槔绾蜻x脫免疫取代，例如表6中所述者；以及其它突變，例如不會破壞抗體結(jié)合于VEGF的能力的取代，包括(但不限于)表10和表11 中所述的突變，或已知突變，例如表12-1到12-9和表13中所述的突變?？刹⑷氡景l(fā)明的抗VEGF抗體中的其它突變包括(但不限于)表14到表16中所述的突變。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明的抗VEGF抗體包括一個或一個以上以下⑶R取代:K64S(CDR-H2)、K64Q(CDR-H2)、Y53F 禾口 K64Q(CDR_H2)、H97E 禾口 Y98F(CDR_H3)或 T51A (⑶R-L2)。抗VEGF抗體也可任選包括一個或一個以上額外突變或突變的組合，所述突變選自表6、7、8、9、10、11、12-1到12-9或13到16中的一者或一者以上。其它CDR 取代可包括 N3IF (CDR-Hl) ；H97E (CDR-H3) ；H97D (CDR-H3)； H97P (CDR-H3) ；Y99E (CDR-H3) ；Y99D (CDR-H3) ；SIOOaG (CDR-H3) (Jt^ CDR-H3 ψ ^ 3 ^{ 不為酪氨酸)；D8P、N31F、N31G 和 Ν31Μ (CDR-Hl) ；Η97Α、H97Q、H97S、Η97Τ、SlOOaD, SlOOaE 禾口 SlOOAv (CDR-H3) ；T30W、T30R 或 T30Q (CDR-Hl) ；Y53F、T58F、A61G、A61K、A61R、A61H、A61Y、 K64G、K64E、R65L、R65T、R65A、R65E 和 R65D (CDR-H2)；以及 Y98F 和 YlOOeF (CDR-H3)。CDR 任選含有一個或一個以上額外突變或突變的組合，所述突變選自表6、7、8、9、10、11、12-1 到12-9和13中的一者或一者以上。其它取代可包括重鏈⑶R取代，包括選自以下的取代的組合(a)在⑶R-Hl中的 N31F、在 CDR-H3 中的 H97D、在 CDR-H3 中的 Y99D 和在 CDR-H3 中的 SlOOaG ； (b)在 CDR-Hl 中的 N31F、在 CDR-H3 中的 H97P、在 CDR-H3 中的 Y99D 和在 CDR-H3 中的 SlOOaG ； (c)在 CDR-Hl 中的 N31F、在 CDR-H3 中的 H97P 和在 CDR-H3 中的 Y99E ； (d)在 CDR-Hl 中的 N31F、在 CDR-H3 中的 H97E 和在 CDR-H3 中的 Y99E ； (e)在 CDR-Hl 中的 N31F、在 CDR-H3 中的 H97D 和在 CDR-H3 中的 Y99E ； (f)在 CDR-Hl 中的 N31F、在 CDR-H3 中的 H97E、在 CDR-H3 中的 Y99D 和在 CDR-H3 中的 SlOOaG ； (g)在 CDR-Hl 中的 N31F、在 CDR-H3 中的 Y99D 和在 CDR-H3 中的 SlOOaG ； (h) 在 CDR-Hl 中的 N31F、在 CDR-H3 中的 H97P 和在 CDR-H3 中的 Y99D ； (i)在 CDR-Hl 中的 N31F、 在CDR-H3中的H97D和在CDR-H3中的SlOOaG ； (j)在CDR-Hl中的N31F和在CDR-H3中的SlOOaG ；或(k)在 CDR-Hl 中的 N31F、在 CDR-H3 中的 H97P 和在 CDR-H3 中的 SlOOaG。其它任選存在的取代可包括一個或一個以上額外突變或突變的組合，所述突變選自表6、7、8、9、
10、11、12-1到12-9和13中的一者或一者以上。其它重鏈取代可包括至少一個選自以下的取代在⑶R-H2中的A61F、在⑶R-H2 中的 A61E、在 CDR-H2 中的 A61D、在 CDR-H2 中的 D62L、在 CDR-H2 中的 D62G、在 CDR-H2 中的 D62Q、在 CDR-H2 中的 D62T、在 CDR-H2 中的 D62K、在 CDR-H2 中的 D62R、在 CDR-H2 中的 D62E、 在 CDR-H2 中的 D62H、在 CDR-H2 中的 K64S、在 CDR-H2 中的 K64V、在 CDR-H2 中的 K64Q、在 CDR-H2 中的 R65V、在 CDR-H2 中的 R65F、在 CDR-H2 中的 R65H、在 CDR-H2 中的 R65N、在 CDR-H2 中的 R65S、在 CDR-H2 中的 R65Q、在 CDR-H2 中的 R65K、在 CDR-H2 中的 R65I 和在 CDR-H3 中的Y98H。任選可包括一個或一個以上額外突變或突變的組合，所述突變選自表7、8、9、10、
11、12-1到12-9到13中的一者或一者以上。在某些方面中，本發(fā)明抗體具有與貝伐單抗或蘭尼單抗的VH和VL序列具有至少 80%序列一致性(且在某些實(shí)施例中，具有至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性)的VH和VL序列，且與貝伐單抗或蘭尼單抗相比較在至少一個⑶R 中包括至少一個氨基酸取代。在其它方面中，本發(fā)明抗體具有與貝伐單抗或蘭尼單抗的VH 和VL序列具有至少80%序列一致性(且在某些實(shí)施例中，具有至少85%、至少90%、至少 95 %、至少98 %或至少99 %序列一致性)的VH和VL序列，且與貝伐單抗或蘭尼單抗相比較在至少一個框架區(qū)中包括至少一個氨基酸取代。在特定實(shí)施例中，所述重鏈和所述輕鏈與貝伐單抗或蘭尼單抗的VH和VL序列相比較的序列一致性百分比獨(dú)立地選自至少80%、至少85%、至少90%、至少95%序列一致性或至少99%序列一致性。在某些方面中，本發(fā)明抗體具有與貝伐單抗或蘭尼單抗的VH和/或VL序列具有至少95%、至少98%或至少99% 序列一致性的VH和/或VL序列。在某些方面中，與貝伐單抗或蘭尼單抗相比較，本發(fā)明抗體在其CDR中具有至多 17個氨基酸取代。保持目標(biāo)結(jié)合能力的具有17個氨基酸取代的變體抗體已由博斯托姆 (Bostrom)等人，2009，科學(xué)(Science) 323 1610-14 產(chǎn)生。在特定實(shí)施例中，本發(fā)明的抗VEGF抗體獨(dú)立地具有 與貝伐單抗或蘭尼單抗的相應(yīng)⑶R相比較，至多一個、至多兩個、至多三個、至多四個、至多五個、至多六個、至多七個、至多八個、至多九個或至多十個CDR-Hl取代； 與貝伐單抗或蘭尼單抗的相應(yīng)⑶R相比較，至多一個、至多兩個、至多三個、至多四個、至多五個、至多六個、至多七個、至多八個、至多九個、至多十個、至多十一個、至多十二個、至多十三個、至多十四個、至多十五個、至多十六個或至多十七個CDR-H2取代； 與貝伐單抗或蘭尼單抗的相應(yīng)⑶R相比較，至多一個、至多兩個、至多三個、至多四個、至多五個、至多六個、至多七個、至多八個、至多九個、至多十個、至多十一個、至多十二個、至多十三個或至多十四個⑶R-H3取代； 與貝伐單抗或蘭尼單抗的相應(yīng)⑶R相比較，至多一個、至多兩個、至多三個、 至多四個、至多五個、至多六個、至多七個、至多八個、至多九個、至多十個或至多十一個 CDR-Ll 取代； 與貝伐單抗或蘭尼單抗的相應(yīng)⑶R相比較，至多一個、至多兩個、至多三個、至多四個、至多五個、至多六個或至多七個CDR-L2取代；和
與貝伐單抗或蘭尼單抗的相應(yīng)⑶R相比較，至多一個、至多兩個、至多三個、至多四個、至多五個、至多六個、至多七個、至多八個或至多九個CDR-L3取代。本發(fā)明進(jìn)一步提供包含經(jīng)修飾抗VEGF抗體的醫(yī)藥組合物。在一些方面中，醫(yī)藥組合物具有與貝伐單抗或蘭尼單抗相比較增加的對VEGF的親和力和/或降低的免疫原性。本文提供包含編碼本發(fā)明的抗VEGF抗體的核苷酸序列的核酸以及包含所述核酸的載體。另外，本文提供用包含編碼抗VEGF抗體的核苷酸序列的載體轉(zhuǎn)化的原核和真核宿主細(xì)胞，以及經(jīng)工程改造成表達(dá)所述核苷酸序列的真核(例如哺乳動物)宿主細(xì)胞。也提供通過培養(yǎng)宿主細(xì)胞產(chǎn)生抗VEGF抗體的方法。本發(fā)明的抗VEGF抗體適用于治療癌癥(例如結(jié)腸癌、直腸癌、非小細(xì)胞肺癌和乳癌)、視網(wǎng)膜疾病(例如年齡相關(guān)性黃斑部變性(“AMD”))和免疫病癥(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)。在某些方面中，本發(fā)明的抗VEGF抗體相比貝伐單抗或蘭尼單抗可以減低的劑量使用，例如減低至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少 70 %、至少80 %或至少90 %的劑量。應(yīng)注意，除非上下文另有明確指示，否則本申請案中使用不定冠詞“一個(種)”和定冠詞“所述”與在專利申請案中所常見一般，意謂一個或一個以上(種)。此外，本申請案中使用術(shù)語“或”與在專利申請案中所常見一般，意謂轉(zhuǎn)折詞(disjunctive) “或”或連接詞(conjunctive) “禾口，，。本說明書中提及的所有出版物都以引用的方式并入本文中。有關(guān)本說明書中所包括的文獻(xiàn)、條例、材料、裝置、物品等的任何論述僅出于為本發(fā)明提供背景的目的。不應(yīng)視為承認(rèn)任何或所有這些內(nèi)容構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)的一部分或作為與本發(fā)明相關(guān)的領(lǐng)域中的普通常識，因?yàn)槠湓诒旧暾埌傅膬?yōu)先日期之前已處處存在。根據(jù)以下關(guān)于本發(fā)明實(shí)施例的詳細(xì)描述，本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)將變得更顯而易知。表格及


表1展示貝伐單抗重鏈⑶R中的氨基酸的編號。⑶R 1-3分別被揭示為SEQ ID NOS :3-5。表2展示貝伐單抗輕鏈⑶R中的氨基酸的編號。⑶R 1-3分別被揭示為SEQ ID NOS :6-8。表3展示已測試過免疫原性的貝伐單抗VL肽。表4展示已測試過免疫原性的貝伐單抗VH肽。表5展示貝伐單抗中經(jīng)鑒別的⑶4+T細(xì)胞表位區(qū)。⑶R區(qū)域加有下劃線。表6展示⑶R-H2和⑶R-H3中降低貝伐單抗免疫原性的候選突變。表6中的氨基酸編號對應(yīng)于貝伐單抗重鏈中的卡貝特(Kabat)編號。表7展示通過表面等離子共振分析得知的貝伐單抗中使Kd改良的重鏈CDR氨基酸取代。Δ k。n是指k。n的改良倍數(shù)(突變體/WT)。Δ k。ff是指k。ff的改良倍數(shù)(WT/突變體)。AKd是指突變體相對于野生型的Kd的改良。表7中的氨基酸編號對應(yīng)于貝伐單抗重鏈中的卡貝特編號。表8展示初步結(jié)合研究指示可增加對VEGF的親和力(數(shù)據(jù)未示)的貝伐單抗重鏈CDR中的突變。表8中的氨基酸編號對應(yīng)于貝伐單抗重鏈中的卡貝特編號。表9展示初步研究指示可增加對VEGF的親和力(數(shù)據(jù)未示)的貝伐單抗重鏈CDR 中的突變。表9中的氨基酸編號對應(yīng)于貝伐單抗重鏈中的卡貝特編號。表10展示不影響結(jié)合且可并入本發(fā)明抗體中的貝伐單抗重鏈⑶R中的突變。表 10中的氨基酸編號對應(yīng)于貝伐單抗重鏈中的卡貝特編號。表11展示不影響結(jié)合且可并入本發(fā)明抗體中的貝伐單抗輕鏈CDR中的突變。表 11中的氨基酸編號對應(yīng)于貝伐單抗輕鏈中的卡貝特編號。表12-1到12-9展示可并入本發(fā)明抗體中的貝伐單抗重鏈⑶R中的已知突變。表 12-1到12-9中的各行包括不同的已知變體。對于各變體，已知⑶R序列用陰影表示。表 12-1到12-9中所標(biāo)識的各變體的序列標(biāo)識符分別列于表20-1到20-9中。⑶R-Hl欄提供⑶R-Hl的部分序列。⑶R-Hl的最終天冬酰胺未展示。所述部分序列對應(yīng)于SEQ ID NO 411。盡管在此部分序列情形下展示了⑶R-Hl中的已知突變，但應(yīng)注意到突變存在于全長 ⑶R的情形下。表13展示可并入本發(fā)明抗體中的貝伐單抗輕鏈⑶R中的已知突變。表13中各行包括不同已知變體。對于各變體，已知CDR序列用陰影表示。表13中所標(biāo)識的各變體的序列標(biāo)識符列于表20-10中。表14展示已測試過免疫原性的貝伐單抗⑶R2VH肽，其中相比SEQ ID NO :62未改變的殘基由空白方框指示。也提供CD4+T細(xì)胞分析結(jié)果。表15展示已測試過免疫原性的貝伐單抗⑶R3VH肽，其中相比SEQ ID NO :74未改變的殘基由空白方框指示。也提供CD4+T細(xì)胞分析結(jié)果。表16展示已測試過免疫原性的貝伐單抗⑶R2VL肽，其中相比SEQ ID NO 25未改變的殘基由空白方框指示。也提供CD4+T細(xì)胞分析結(jié)果。表17展示所選針對貝伐單抗中三個CD4+T細(xì)胞表位的表位修飾。表18展示單一可變區(qū)突變體及其相關(guān)平均熒光強(qiáng)度(MFI)計分。表19展示組合可變區(qū)突變體及其相關(guān)EC5Q。表20-1到20-10展示SEQ ID N0S，其中已知對應(yīng)于貝伐單抗的⑶R的變體分別列于表12-1到12-9和表13中。N/A指示未知CDR序列。圖1A-1D.圖IA展示貝伐單抗重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列，分別為SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2，其中⑶R區(qū)用粗體、加下劃線的文字表示。圖IB展示貝伐單抗的⑶R 序列和相應(yīng)序列標(biāo)識符。圖IC展示蘭尼單抗重鏈和輕鏈的氨基酸序列，分別為SEQ ID NO 9和SEQ ID NO :10，其中⑶R區(qū)用粗體、加下劃線的文字表示。圖ID展示蘭尼單抗的⑶R 序列和相應(yīng)序列標(biāo)識符。圖2A-2B展示貝伐單抗VL肽反應(yīng)。圖2A展示在2. 95或2. 95以上的刺激指數(shù)下對各VL肽起反應(yīng)的供體的百分比。N = 99個供體。圖2B展示各肽對全部99個供體的平均刺激指數(shù)加上或減去標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖3A-;3B展示貝伐單抗VH肽反應(yīng)。圖3A展示在2. 95或2. 95以上的刺激指數(shù)下對各VH肽起反應(yīng)的供體的百分比。N = 99個供體。圖:3B展示各肽對全部99個供體的平均刺激指數(shù)加上或減去標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖4A-4C展示對突變貝伐單抗表位肽的CD4+T細(xì)胞反應(yīng)。對未經(jīng)修飾的親本表位序列的平均反應(yīng)用空心標(biāo)記指示。大圓指示表17中提及的所選變化。圖4A針對VH CDR2 肽；圖4B針對VH CDR3肽；且圖4C針對VL CDR2肽。
具體實(shí)施例方式6. 1 抗 VEGF 抗體本發(fā)明提供抗VEGF抗體。除非另有指示，否則術(shù)語“抗體”(Ab)是指特異性結(jié)合于特定抗原或與特定抗原免疫反應(yīng)的免疫球蛋白分子，且包括多克隆抗體、單克隆抗體、經(jīng)基因工程改造的抗體和以其它方式修飾的形式的抗體，包括(但不限于)嵌合抗體、人源化抗體、異源結(jié)合抗體(例如雙特異性抗體、雙功能抗體、三功能抗體和四功能抗體)，以及抗體的抗原結(jié)合片段，包括例如Fab'、F(ab' )2、Fab、FV、rIgG和scFv片段。此外，除非另有指示，否則術(shù)語“單克隆抗體”(mAb)擬包括完整分子以及能夠特異性結(jié)合蛋白質(zhì)的抗體片段 (例如Fab和F(ab' )2片段)兩者。Fab和F(ab‘ )2片段缺乏完整抗體的Fc片段，從動物循環(huán)中清除的速度較快，并且可具有比完整抗體低的非特異性組織結(jié)合性(瓦爾(Wahl) 等人，1983，核醫(yī)學(xué)雜志(J. Nucl. Med.) 24 :316)。術(shù)語“scFv”是指單鏈Fv抗體，其中來自傳統(tǒng)抗體的重鏈和輕鏈的可變域已經(jīng)接合形成一條鏈。提及的“VH”是指抗體免疫球蛋白重鏈(包括Fv、SCFv或Fab的重鏈)的可變區(qū)。 提及的“VL”是指免疫球蛋白輕鏈(包括Fv、scFv、dsFv或Fab的輕鏈)的可變區(qū)?？贵w (Ab)和免疫球蛋白(Ig)是具有相同結(jié)構(gòu)特征的糖蛋白?？贵w對特定目標(biāo)展現(xiàn)結(jié)合特異性， 而免疫球蛋白包括抗體與其它缺乏目標(biāo)特異性的抗體樣分子兩者。天然抗體和免疫球蛋白通常為約150,000道爾頓的異源四聚糖蛋白，其由兩條相同輕(L)鏈和兩條相同重(H)鏈構(gòu)成。每一重鏈在氨基末端具有可變域(VH)，其后為多個恒定域。每一輕鏈在氨基末端具有可變域(VL)且在羧基末端具有恒定域。本發(fā)明的抗VEGF抗體在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合于人類VEGF并抑制VEGF受體活性。本發(fā)明的抗VEGF抗體含有在序列上與抗體貝伐單抗(也稱為Avastin )和/或蘭尼單抗(也稱為Lucentis )的⑶R相關(guān)的互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)。也已知⑶R為輕鏈和重鏈可變域中的高變區(qū)?？勺冇蛑休^為高度保守的部分被稱為框架(FR)。如此項(xiàng)技術(shù)中所知，描繪抗體高變區(qū)的氨基酸位置/邊界可視此項(xiàng)技術(shù)中已知的情形和各種定義而變化?？勺冇騼?nèi)的一些位置可視為雜合高變位置，因?yàn)檫@些位置依據(jù)一組標(biāo)準(zhǔn)可視為在高變區(qū)內(nèi)，而依據(jù)一組不同的標(biāo)準(zhǔn)則可視為在高變區(qū)外。這些位置中一者或一者以上也可見于擴(kuò)展的高變區(qū)中。本發(fā)明提供在這些雜合高變位置中包含修飾的抗體。天然重鏈和輕鏈的可變域各包含四個主要采用β折疊構(gòu)型經(jīng)由三個⑶R連接的FR區(qū)，所述⑶R形成連接β折疊結(jié)構(gòu)的環(huán)，且在一些情況下形成β折疊結(jié)構(gòu)的一部分。 各鏈中的CDR經(jīng)由FR區(qū)按順序FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4緊密地固持在一起，且與另一鏈的CDR —起促使抗體的目標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)形成(參見卡貝特等人，免疫相關(guān)蛋白質(zhì)序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)(國立衛(wèi)生石if究院(National Institute of Health)，馬里蘭州貝塞斯達(dá)(Bethesda，Md. ) 1987)。除非另有指示，否則如本文所用，對免疫球蛋白氨基酸殘基的編號是根據(jù)卡貝特等人的免疫球蛋白氨基酸殘基編號系統(tǒng)進(jìn)行。
貝伐單抗的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列分別以SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2表示。重鏈和輕鏈可變區(qū)的序列也顯示于圖IA中。貝伐單抗的CDR序列及其相應(yīng)標(biāo)識符呈現(xiàn)于圖 IB中。編碼SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2的任何核苷酸序列都可用于本發(fā)明的組合物和方法中。蘭尼單抗的重鏈和輕鏈序列分別以SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10表示。重鏈和輕鏈的序列也顯示于圖IC中。蘭尼單抗的⑶R序列及其相應(yīng)標(biāo)識符呈現(xiàn)于圖ID中。編碼 SEQ ID NO :9或SEQ ID NO :10的任何核苷酸序列都可用于本發(fā)明的組合物和方法中。本發(fā)明進(jìn)一步提供包含與貝伐單抗和蘭尼單抗的CDR序列相關(guān)的CDR序列的抗 VEGF抗體片段。術(shù)語“抗體片段”是指全長抗體的一部分，一般為目標(biāo)結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的實(shí)例包括Fab、Fab'、F(ab' )2和Fv片段?！癋v”片段是含有完整目標(biāo)識別位點(diǎn)和結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。此區(qū)域由一個重鏈可變域與一個輕鏈可變域緊密、非共價締合的二聚體(VH-VL 二聚體)組成。正是在此構(gòu)型中各可變域的三個⑶R相互作用以界定在VH-VL二聚體表面上目標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)。六個CDR常賦予抗體目標(biāo)結(jié)合特異性。然而，在有些情況下，甚至單一可變域(或僅包含三個對目標(biāo)具有特異性的⑶R的一半Fv)也可具有識別且結(jié)合目標(biāo)的能力?！皢捂淔v”或“scFv”抗體片段包含呈單一多肽鏈的抗體的VH和VL 域。一般說來，F(xiàn)v多肽進(jìn)一步包含介于VH與VL域之間使scFv能夠形成目標(biāo)結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)的多肽連接子?！皢斡蚩贵w”是由對目標(biāo)展現(xiàn)足夠親和力的單一 VH或VL域構(gòu)成。在一個特定實(shí)施例中，單域抗體為駱駝抗體(camelid antibody)(參見例如瑞奇曼(Riechmarm)， 1999，免疫方法雜志(Journal of Immunological Methods) 231 :25-38)。Fab片段含有輕鏈的恒定域和重鏈的第一恒定域(CH1)。Fab'片段因在重鏈CH1 域的羧基末端添加數(shù)個殘基(包括一個或一個以上來自抗體鉸鏈區(qū)的半胱氨酸)而與Fab 片段不同。F(ab')片段是通過裂解F(ab' )2胃蛋白酶消化產(chǎn)物的鉸鏈半胱氨酸處的二硫鍵產(chǎn)生?？贵w片段的其它化學(xué)偶合為所屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員所知。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的抗VEGF抗體為單克隆抗體。本文所用的術(shù)語“單克隆抗體”不限于通過雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的抗體。術(shù)語“單克隆抗體”是指抗體源自單一克隆，包括任何真核、原核或噬菌體克隆，而不是由可產(chǎn)生所述抗體的方法產(chǎn)生。適于結(jié)合本發(fā)明使用的單克隆抗體可使用此項(xiàng)技術(shù)已知的各種技術(shù)來制備，包括使用雜交瘤、重組體和噬菌體呈現(xiàn)技術(shù)或其組合。本發(fā)明的抗VEGF抗體包括嵌合抗體、靈長類化抗體、人源化抗體或人類抗體。本發(fā)明的抗VEGF抗體可為嵌合抗體。本文所用的術(shù)語“嵌合”抗體是指抗體具有源自非人類免疫球蛋白(例如大鼠或小鼠抗體)的可變序列和通常選自人類免疫球蛋白模板的人類免疫球蛋白恒定區(qū)。用于產(chǎn)生嵌合抗體的方法是此項(xiàng)技術(shù)中已知的。參見例如莫里森(Morrison)，1985，科學(xué)，2 0719) :1202-7;敖(Oi)等人，1986，生物技術(shù) (BioiTechniquesH :214-221 ；吉爾利斯(Gillies)等人，1985，免疫法雜志(J. Immunol. Methods) 125 :191-202 ；美國專利第 5，807，715 號、第 4，816，567 號和第 4，816397 號，所述文獻(xiàn)以全文引用的方式并入本文中。本發(fā)明的抗VEGF抗體可被人源化。非人類(例如鼠類)抗體的“人源化”形式是含有源自非人類免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、其免疫球蛋白鏈或片段(例如，F(xiàn)v、Fab、Fab'、F(ab' )2或抗體的其它目標(biāo)結(jié)合子域)。一般說來，人源化抗體將包含至少一個且通常兩個可變域的實(shí)質(zhì)上全部，其中全部或?qū)嵸|(zhì)上全部CDR區(qū)對應(yīng)于非人類免疫球蛋白的CDR區(qū)且全部或?qū)嵸|(zhì)上全部FR區(qū)為人類免疫球蛋白序列的FR區(qū)。人源化抗體也可包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)的至少一部分，通常為人類免疫球蛋白共同序列的至少一部分?？贵w人源化的方法在此項(xiàng)技術(shù)中為已知的。參見例如瑞奇曼等人，1988，自然， 332 323-7 ；奎恩(Queen)等人的美國專利第 5，530，101 號、第 5，585，089 號、第 5，693，761 號、第 5，693，762 號和第 6，180，370 號；EP239400 ；PCT 公開案 WO 91/09967 ；美國專利第 5，225，539 號；EP592106 ；EP519596 ；帕德蘭(Padlan)，1991，分子免疫學(xué)(Mol. Immunol.)， 28 :489-498 ；斯圖妮卡(Studnicka)等人，1994，保護(hù)工程(Prot. Eng.) 7 :805-814 ；羅古斯卡(Roguska)等人，1994，美國國家科學(xué)院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci.)91 :969-973 ；和美國專利第5，565，332號，所有所述文獻(xiàn)都以全文引用的方式并入本文中。本發(fā)明的抗VEGF抗體可為人類抗體。完全“人類”抗VEGF抗體可為治療性治療人類患者所需的。如本文所用，“人類抗體”包括具有人類免疫球蛋白氨基酸序列的抗體且包括自人類免疫球蛋白文庫或自轉(zhuǎn)入一個或一個以上人類免疫球蛋白基因且不表達(dá)內(nèi)源性免疫球蛋白的動物分離的抗體。人類抗體可由此項(xiàng)技術(shù)中已知的各種方法制備， 所述方法包括使用源自人類免疫球蛋白序列的抗體文庫的噬菌體呈現(xiàn)方法。參見美國專利第 4，444，887 號和第 4，716，111 號；以及 PCT 公開案 WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096、WO 96/337 和 WO 91/10741，所述文獻(xiàn)各自以全文引用的方式并入本文中。也可使用不能表達(dá)功能內(nèi)源性免疫球蛋白但可表達(dá)人類免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠來產(chǎn)生人類抗體。參見例如PCT公開案WO 98/24893, WO 92/01047、 WO 96/34096、WO 96/33735 ；美國專利第 5，413，923 號、第 5，625，126 號、第 5，633，425 號、 第 5，569，825 號、第 5，661，016 號、第 5，545，806 號、第 5，814，318 號、第 5，885，793 號、第 5，916，771號和第5，939，598號，所述文獻(xiàn)以全文引用的方式并入本文中。此外，例如麥德雷斯公司(Medarex)(新澤西州普林斯頓(I^rinceton，NJ))、阿斯特拉制藥公司(Astellas Pharma)(伊利諾伊州迪爾菲爾德(Deerfield，IL))、安進(jìn)公司(Amgen)(加利福尼亞州千橡城(Thousand Oaks, CA))和雷杰納榮公司(Regeneron)(紐約州塔里敦(Tarrytown，NY)) 等公司可使用與上文所述類似的技術(shù)來致力于提供針對所選抗原的人類抗體?？墒褂梅Q為 “定向選擇(guided selection)”的技術(shù)來產(chǎn)生識別所選表位的完全人類抗體。在此方法中，使用所選非人類單克隆抗體(例如，小鼠抗體)引導(dǎo)選擇識別相同表位的完全人類抗體 (杰斯普斯(Jespers)等人，1988，生物技術(shù)，12 =899-903)。本發(fā)明的抗VEGF抗體可被靈長類化。術(shù)語“靈長類化抗體”是指包含猴可變區(qū)和人類恒定區(qū)的抗體。用于產(chǎn)生靈長類化抗體的方法在此項(xiàng)技術(shù)中為已知的。參見例如美國專利第5，658，570號、第5，681，722號和第5，693，780號，所述文獻(xiàn)以全文引用的方式并入本文中。本發(fā)明的抗VEGF抗體可為雙特異性抗體。雙特異性抗體是通常為人類或人源化的單克隆抗體，其對至少兩種不同抗原具有結(jié)合特異性。在本發(fā)明中，一種結(jié)合特異性可針對VEGF，另一種可針對任何其它抗原，例如針對細(xì)胞表面蛋白質(zhì)、受體、受體亞基、組織特異性抗原、病毒源性蛋白質(zhì)、病毒編碼的包膜蛋白質(zhì)、細(xì)菌源性蛋白質(zhì)或細(xì)菌表面蛋白質(zhì)等。 在一個特定實(shí)施例中，本發(fā)明抗體是對VEGF和CD3兩者具有結(jié)合特異性的雙特異性抗體。本發(fā)明的抗VEGF抗體包括衍生化抗體。舉例來說(但不作為限制)，衍生化抗體通常通過以下方式來修飾糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、利用已知保護(hù)/ 阻隔基進(jìn)行的衍生化、蛋白水解裂解、鍵聯(lián)到細(xì)胞配體或其它蛋白質(zhì)(參見6. 6節(jié)關(guān)于抗體結(jié)合物的論述)等。眾多化學(xué)修飾中的任一者都可通過已知技術(shù)進(jìn)行，所述技術(shù)包括(但不限于)特異性化學(xué)裂解、乙酰化、甲?；?、衣霉素(timicamycin)的代謝合成等。另外，衍生物可含有一個或一個以上非天然氨基酸，例如使用安布斯(ambrx)技術(shù)(參見例如沃夫森(Wolfson)，2006，化學(xué)與生物學(xué)(Chem. Biol.) 13(10) :1011-2)。在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，抗VEGF抗體或其片段可為序列已經(jīng)修飾成相對于相應(yīng)野生型序列改變至少一種恒定區(qū)介導(dǎo)的生物效應(yīng)功能的抗體或抗體片段。舉例來說，在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的抗VEGF抗體可經(jīng)修飾成相對于未經(jīng)修飾的抗體降低至少一種恒定區(qū)介導(dǎo)的生物效應(yīng)功能，例如降低與Fc受體(FcyR)的結(jié)合。FC YR 結(jié)合可通過使抗體的免疫球蛋白恒定區(qū)區(qū)段在Fc γ R相互作用所必需的特定區(qū)域處發(fā)生突變來降低(參見例如坎菲爾德(Canfield)和莫里森(Morrison)，1991，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志 (J. Exp. Med.) 173 :1483-1491 ；以及路德(Lund)等人，1991，免疫學(xué)雜志(J. Immunol.) 147 2657-2662)。降低抗體的Fc γ R結(jié)合能力也會降低其它依賴于Fc γ R相互作用的效應(yīng)功能， 例如助噬素作用(opsonization)、吞噬作用和抗原依賴性細(xì)胞毒性(“ADCC”)。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明的抗VEGF抗體可經(jīng)修飾成相對于未經(jīng)修飾的抗體獲得或改良至少一種恒定區(qū)介導(dǎo)的生物效應(yīng)功能，例如增強(qiáng)Fc γ R相互作用(參見例如US 2006/0134709)。舉例來說，本發(fā)明的抗VEGF抗體可具有以大于相應(yīng)野生型恒定區(qū)的親和力結(jié)合Fc y RIIA, Fc γ RIIB和/或Fc γ RIIIA的恒定區(qū)。因此，本發(fā)明抗體可具有使助噬素作用、吞噬作用或ADCC增加或減少的生物活性變化。這些變化在此項(xiàng)技術(shù)中為已知的。舉例來說，可降低ADCC活性的抗體修飾描述于美國專利第5，834，597號中。一種例示性降低ADCC的變體對應(yīng)于美國專利第5，834，597號圖4中所示的“突變體3”，其中缺失殘基236且殘基234、235和237 (使用EU編號)經(jīng)丙氨酸取代。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明抗VEGF抗體的巖藻糖含量較低或缺乏巖藻糖。缺乏巖藻糖的抗體與增強(qiáng)的ADCC活性相關(guān)聯(lián)，尤其在低劑量的抗體下。參見謝爾德(fields)等人，2002，生物化學(xué)雜志(J. Biol. Chem. )277 :26733-26740 ；新川(Shinkawa)等人，2003，生物化學(xué)雜志，278 :3466-73。制備巖藻糖較少的抗體的方法包括在大鼠骨髓瘤YB2/0細(xì)胞 (ATCC CRL 1662)中生長。YB2/0細(xì)胞低水平表達(dá)FUT8mRNA，其編碼α-1，6_巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(多肽巖藻糖基化必需的一種酶)。在另一方面中，抗VEGF抗體或其片段可為已經(jīng)例如通過使免疫球蛋白恒定區(qū)區(qū)段在與Fcfoi相互作用有關(guān)的特定區(qū)域處發(fā)生突變來進(jìn)行修飾以增加或降低對胎兒Fc受體 Fcfoi的結(jié)合親和力的抗體或抗體片段(參見例如WO 2005/123780)。在特定實(shí)施例中，IgG 類別的抗VEGF抗體經(jīng)突變以使重鏈恒定區(qū)的氨基酸殘基250、314和428中的至少一者單獨(dú)或其任何組合(例如在位置250和似8處，或在位置250和314處，或在位置314和428 處，或在位置250、314和似8處，其中位置250和似8為特定組合)經(jīng)取代。對于位置250， 取代氨基酸殘基可為除蘇氨酸外的任何氨基酸殘基，包括(但不限于)丙氨酸、半胱氨酸、 天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、絲氨酸、纈氨酸、色氨酸或酪氨酸。對于位置314，取代氨基酸殘基可為除亮氨酸外的任何氨基酸殘基，包括(但不限于)丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、 谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、色氨酸或酪氨酸。對于位置428，取代氨基酸殘基可為除甲硫氨酸外的任何氨基酸殘基，包括(但不限于)丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、 苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、色氨酸或酪氨酸。適合氨基酸取代的特定組合標(biāo)識于美國專利第7，217，797號的表1中，所述表以全文引用的方式并入本文中。所述突變將增加抗體與 FcRn的結(jié)合，由此保護(hù)抗體免于降解且增加其半衰期。在其它方面中，抗VEGF抗體具有一個或一個以上氨基酸插入到其一個或一個以上高變區(qū)中，例如張(Jung)和普魯克坦(PlUCkthun)，1997，蛋白質(zhì)工程(Protein Engineering) 10(9) :959-966 ；矢崎(Yazaki)等人，2004，蛋白質(zhì)工程設(shè)計和選擇(Protein Eng Des. Sel.) 17(5) :481-9.電子版(Epub) 2004 年 8 月 17 日；和 US 2007/0280931 中所述。在各種實(shí)施例中，抗VEGF抗體或其片段可為已經(jīng)修飾以增加在異源宿主中的表達(dá)的抗體或抗體片段。在某些實(shí)施例中，抗VEGF抗體或其片段可為已經(jīng)修飾以增加在異源宿主細(xì)胞中的表達(dá)和/或自異源宿主細(xì)胞分泌的抗體或抗體片段。在一些實(shí)施例中，抗 VEGF抗體或其片段經(jīng)修飾以增加在細(xì)菌(例如大腸桿菌(E. coli))中的表達(dá)。在其它實(shí)施例中，抗VEGF抗體或其片段經(jīng)修飾以增加在酵母中的表達(dá)(凱克(Kieke)等人，1999，美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Nat' 1 Acad. Sci. USA) 96 :5651-5656)。在其它實(shí)施例中，抗VEGF 抗體或其片段經(jīng)修飾以增加在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)。在其它實(shí)施例中，抗VEGF抗體或其片段經(jīng)修飾以增加在哺乳動物細(xì)胞(例如CHO細(xì)胞)中的表達(dá)。在某些實(shí)施例中，抗VEGF抗體或其片段可為已經(jīng)修飾以增加抗體在產(chǎn)生期間的穩(wěn)定性的抗體或抗體片段。在一些實(shí)施例中，抗體或其片段可經(jīng)修飾成用不經(jīng)歷脫酰胺化的氨基酸置換一個或一個以上易發(fā)生非酶促脫酰胺化的氨基酸(例如天冬酰胺或谷氨酰胺)(黃(Huang)等人，2005，分析化學(xué)(Anal. Chem.) 77 1432-1439)。在其它實(shí)施例中， 抗體或其片段可經(jīng)修飾成用不易發(fā)生氧化的氨基酸置換一個或一個以上易發(fā)生氧化的氨基酸(例如甲硫氨酸、半胱氨酸或色氨酸)。在其它實(shí)施例中，抗體或其片段可經(jīng)修飾成用不易發(fā)生環(huán)化的氨基酸置換一個或一個以上易發(fā)生環(huán)化的氨基酸(例如天冬酰胺或谷氨酸)。6. 2核酸和表達(dá)系統(tǒng)本發(fā)明涵蓋編碼本發(fā)明的抗VEGF抗體的核酸分子和宿主細(xì)胞?？赏ㄟ^在宿主細(xì)胞中重組表達(dá)免疫球蛋白輕鏈和重鏈基因來制備本發(fā)明的抗 VEGF抗體。為了以重組方式表達(dá)抗體，使用帶有編碼抗體的免疫球蛋白輕鏈和重鏈的DNA 片段的一個或一個以上重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，以在宿主細(xì)胞中表達(dá)輕鏈和重鏈，且任選分泌到培養(yǎng)宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中，從所述培養(yǎng)基中可回收所述抗體。使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA 方法獲得抗體重鏈和輕鏈基因，將這些基因并入重組表達(dá)載體中，并將載體引入宿主細(xì)胞中，所述方法例如為以下文獻(xiàn)中所描述的方法分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(Molecular Cloning ；A Laboratory Manual)，第二版(薩姆布魯克(Sambrook)，弗雷特奇(Fritsch)和馬尼提斯 (Maniatis)編，紐約州冷泉港(Cold Spring Harbor,N. Y.)，1989)、現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)(Current Protocols in Molecular Biology)(奧斯貝爾 F. M. (Ausubel,F. Μ.)等人編， 格里尼出版協(xié)會(Greene Publishing Associates)，1989)和美國專利第 4，816，397 號。在一個實(shí)施例中，抗VEGF抗體類似于貝伐單抗或蘭尼單抗，但在一個或一個以上 CDR中有變化。在另一實(shí)施例中，抗VEGF抗體類似于貝伐單抗或蘭尼單抗，但在一個或一個以上框架區(qū)中有變化。在又一實(shí)施例中，抗VEGF抗體類似于貝伐單抗或蘭尼單抗，但在一個或一個以上⑶R中和一個或一個以上框架區(qū)中有變化。這些抗體在本文中統(tǒng)稱為具有 “貝伐單抗相關(guān)”或“蘭尼單抗相關(guān)”序列且有時簡單稱為本發(fā)明的抗VEGF抗體。為了產(chǎn)生編碼抗VEGF抗體的核酸，首先獲得編碼輕鏈和重鏈可變區(qū)的DNA片段。這些DNA可通過例如使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增并修飾編碼輕鏈和重鏈可變序列的生殖系DNA或cDNA 來獲得。人類重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的生殖系DNA序列是此項(xiàng)技術(shù)中已知的(參見例如 “VBASE”人類生殖系序列數(shù)據(jù)庫；也參見卡貝特E.A. (Kabat,E. Α.)等人，1991，免疫相關(guān)蛋白質(zhì)序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第五版，美國衛(wèi)生禾口公眾服務(wù)部(U. S. Department of Health and Human Services)，NIH 出版社第 91-3242 號； 湯姆林森(Tomlinson)等人，1992，分子生物學(xué)雜志(J. Mol. Biol.) 22T :116-198 ；和科克斯 (Cox)等人，1994，歐洲免疫學(xué)雜志(Eur. J. Immunol. )24 :827_836，所述文獻(xiàn)的內(nèi)容各自以引用的方式并入本文中)?？梢院铣删幋a貝伐單抗或蘭尼單抗的重鏈或輕鏈可變區(qū)的DNA 片段，并用作誘發(fā)突變的模板，以便使用常規(guī)誘變技術(shù)來產(chǎn)生如本文所述的變體；或者，可直接合成編碼所述變體的DNA片段。一旦獲得編碼抗VEGF VH和VL區(qū)段的DNA片段，就可利用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)進(jìn)一步處理這些DNA片段，例如將可變區(qū)基因轉(zhuǎn)變成全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在這些處理中，編碼VL或VH的DNA片段可操作地連接到編碼另一蛋白質(zhì)(例如抗體恒定區(qū)或柔性連接子)的另一 DNA片段。在此情形中使用的術(shù)語“可操作地連接”擬意謂將兩個DNA片段接合以使得由這兩個DNA片段編碼的氨基酸序列保持同框(in-frame)?？赏ㄟ^將編碼VH區(qū)的經(jīng)分離DNA可操作地連接到編碼重鏈恒定區(qū)(CH1、CH2, CH3 和任選存在的CH4)的另一 DNA分子，將所述編碼VH的DNA轉(zhuǎn)變成全長重鏈基因。人類重鏈恒定區(qū)基因序列在此項(xiàng)技術(shù)中為已知的(參見例如卡貝特E.A.等人，1991，免疫相關(guān)蛋白質(zhì)序列，第五版，美國衛(wèi)生和公眾服務(wù)部，NIH出版社第91-3242號)，且涵蓋這些區(qū)域的DNA 片段可通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增法獲得。重鏈恒定區(qū)可為IgGp IgG2, IgG3、IgG4, IgA、IgE、IgM或 IgD恒定區(qū)，但在某些實(shí)施例中為IgG1或IgG4恒定區(qū)。對于Fab片段重鏈基因，編碼VH的 DNA可以可操作地連接到僅編碼重鏈CH1恒定區(qū)的另一 DNA分子?？赏ㄟ^將編碼VL區(qū)的經(jīng)分離DNA可操作地連接到編碼輕鏈恒定區(qū)CL的另一 DNA 分子，將所述編碼VL的DNA轉(zhuǎn)變成全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人類輕鏈恒定區(qū)基因序列在此項(xiàng)技術(shù)中為已知的(參見例如卡貝特E.A.等人，1991，免疫相關(guān)蛋白質(zhì)序列， 第五版，(美國衛(wèi)生和公眾服務(wù)部，NIH出版社第91-3242號))，且涵蓋這些區(qū)域的DNA片段可通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增法獲得。輕鏈恒定區(qū)可為κ或λ恒定區(qū)，但在某些實(shí)施例中為κ 恒定區(qū)。為了產(chǎn)生scFv基因，將編碼VH和VL的DNA片段可操作地連接到編碼柔性連接子(例如編碼氨基酸序列(Gly4 kr)3)的另一片段，以使得VH和VL序列可表達(dá)為鄰接單鏈蛋白質(zhì)，其中VL與VH區(qū)由柔性連接子接合(參見例如博德(Bird)等人，1988，科學(xué)， 242 =423-426 ；休斯頓(Huston)等人，1988，美國國家科學(xué)院院刊，85 :5879-5883 ；麥克卡福提(McCafferty)等人，1990，自然，348 :552-554)。為了表達(dá)本發(fā)明的抗VEGF抗體，將如上所述獲得的編碼部分或全長輕鏈和重鏈的DNA插入表達(dá)載體中，以使所述基因可操作地連接到轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列。在此情形中， 術(shù)語“可操作地連接”擬意謂將抗體基因連接到載體中以使載體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列發(fā)揮其調(diào)控抗體基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的預(yù)定功能。表達(dá)載體和表達(dá)控制序列經(jīng)選擇應(yīng)與所用表達(dá)宿主細(xì)胞相容?？蓪⒖贵w輕鏈基因和抗體重鏈基因插入單獨(dú)載體中，或更通常將兩種基因插入同一表達(dá)載體中。通過標(biāo)準(zhǔn)方法(例如抗體基因片段和載體上互補(bǔ)限制性位點(diǎn)的連接；或如果不存在限制性位點(diǎn)就為平末端連接(blunt end ligation))將抗體基因插入表達(dá)載體中。在插入本發(fā)明抗VEGF抗體的輕鏈或重鏈序列之前，表達(dá)載體可已帶有抗體恒定區(qū)序列。舉例來說，一種將抗VEGF VH和VL序列轉(zhuǎn)變成全長抗體基因的方法是將其分別插入已編碼重鏈恒定區(qū)與輕鏈恒定區(qū)的表達(dá)載體中，以使VH區(qū)段可操作地連接到載體內(nèi)的CH區(qū)段且VL區(qū)段可操作地連接到載體內(nèi)的CL區(qū)段。另外或或者，重組表達(dá)載體可編碼能促進(jìn)宿主細(xì)胞分泌抗體鏈的信號肽。可將抗體鏈基因克隆到載體中，從而使信號肽與抗體鏈基因的氨基末端同框連接。信號肽可為免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(即，來自非免疫球蛋白蛋白質(zhì)的信號肽)。除抗體鏈基因以外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體還帶有控制抗體鏈基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)的調(diào)控序列。術(shù)語“調(diào)控序列”擬包括啟動子、增強(qiáng)子和控制抗體鏈基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的其它表達(dá)控制元件(例如聚腺苷酸化信號)。這些調(diào)控序列例如描述于喬 il/K (Goeddel), S0 ^: :81'^ ' (Gene Expression Technology =Methods in Enzymology) 185(學(xué)術(shù)出版社(Academic Press)，加利福尼亞州圣地亞哥(San Diego, CA)， 1990)中。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，表達(dá)載體的設(shè)計(包括調(diào)控序列的選擇)可取決于例如待轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、所要蛋白質(zhì)的表達(dá)水平等因素。適用于哺乳動物宿主細(xì)胞表達(dá)的調(diào)控序列包括可引導(dǎo)蛋白質(zhì)在哺乳動物細(xì)胞中高水平表達(dá)的病毒元件，例如源自巨細(xì)胞病毒(CMV)(例如CMV啟動子/增強(qiáng)子)、猿病毒40 (SV40)(例如SV40啟動子/增強(qiáng)子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))和多瘤病毒的啟動子和/或增強(qiáng)子。 有關(guān)病毒調(diào)控元件及其序列的進(jìn)一步描述，參見例如斯汀斯奇(Stinski)的美國專利第 5，168，062號、貝爾(Bell)等人的美國專利第4，510，245號和斯查夫納(Schaffner)等人的美國專利第4，968，615號。除抗體鏈基因和調(diào)控序列以外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體還可帶有其它序列，例如調(diào)控所述載體在宿主細(xì)胞中的復(fù)制的序列(例如復(fù)制起點(diǎn))和可選擇標(biāo)記基因?？蛇x擇標(biāo)記基因有助于選擇引入了載體的宿主細(xì)胞(參見例如美國專利第4，399，216號、第 4，634，665號和第5，179，017號，均屬于艾克西(Axel)等人)。舉例來說，通?？蛇x擇標(biāo)記基因會賦予引入了載體的宿主細(xì)胞對藥物(例如G418、嘌呤霉素(puromycin)、殺稻瘟菌素 (blasticidin)、潮霉素(hygromycin)或甲氨蝶呤)的抗性。適合的可選擇標(biāo)記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用于借助甲氨蝶呤選擇/擴(kuò)增的DHFR_宿主細(xì)胞)和neo基因(用于G418選擇)。對于輕鏈和重鏈的表達(dá)，利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將編碼重鏈和輕鏈的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中。術(shù)語“轉(zhuǎn)染”的各種形式擬涵蓋常用于將外源DNA引入原核或真核宿主細(xì)胞中的各種技術(shù)，例如電穿孔、脂質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染等。
有可能在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的抗體。在某些實(shí)施例中，在真核細(xì)胞(例如哺乳動物宿主細(xì)胞)中進(jìn)行抗體表達(dá)以使經(jīng)適當(dāng)折疊且具有免疫活性的抗體的分泌最佳。用于表達(dá)本發(fā)明的重組抗體的例示性哺乳動物宿主細(xì)胞包括中國倉鼠卵巢 (CHO)細(xì)胞(包括描述于奧拉波⑴rlaub)和查辛(Chasin)，1980，美國國家科學(xué)院院刊， 77 =4216-4220中的DHFRTH0細(xì)胞，其與DHFR可選擇標(biāo)記一起使用，例如考夫曼(Kaufman) 和夏普(Sharp)，1982，分子生物學(xué)(Mol. Biol.) 159 :601-621中所述)、NSO骨髓瘤細(xì)胞、 COS細(xì)胞、293細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞。當(dāng)將編碼抗體基因的重組表達(dá)載體引入哺乳動物宿主細(xì)胞中時，通過培養(yǎng)宿主細(xì)胞一段足以使抗體在宿主細(xì)胞中表達(dá)或使抗體分泌到生長宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中的時間來產(chǎn)生抗體?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化法自培養(yǎng)基中回收抗體。也可使用宿主細(xì)胞產(chǎn)生完整抗體的部分，例如Fab片段或scFv分子。應(yīng)了解，關(guān)于上述程序的變化形式在本發(fā)明的范圍內(nèi)。舉例來說，可能需要用編碼本發(fā)明抗VEGF抗體的輕鏈或重鏈(但并非兩者)的DNA轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。重組DNA技術(shù)也可用于移除編碼非結(jié)合于VEGF所必需的輕鏈和重鏈中任一者或兩者的一部分或全部DNA。本發(fā)明抗體也涵蓋由這些截短的DNA分子表達(dá)的分子。此外，可通過利用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)交聯(lián)方法使本發(fā)明抗體與另一抗體交聯(lián)來產(chǎn)生雙功能抗體，在所述雙功能抗體中一條重鏈和一條輕鏈屬于本發(fā)明抗體且另一條重鏈和輕鏈對除 VEGF以外的抗原具有特異性。雙功能抗體也可通過表達(dá)經(jīng)工程改造成編碼雙功能抗體的核酸來制備。在某些實(shí)施例中，可通過使輕鏈和/或重鏈⑶R中的氨基酸殘基突變來產(chǎn)生雙特異性抗體，即，使用同一結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合VEGF和無關(guān)抗原的抗體。在各種實(shí)施例中，可通過使抗原結(jié)合位點(diǎn)周邊的氨基酸殘基突變來產(chǎn)生可結(jié)合兩種抗原(例如HER2和VEGF)的雙特異性抗體(博斯托姆(Bostrom)等人，2009，科學(xué)，323 1610-1614)?？赏ㄟ^表達(dá)經(jīng)工程改造成編碼雙特異性抗體的核酸來制備雙功能抗體。為了重組表達(dá)本發(fā)明的抗VEGF抗體，可用兩個本發(fā)明的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，第一載體編碼重鏈源性多肽且第二載體編碼輕鏈源性多肽。通常，兩個載體各含有單獨(dú)的可選擇標(biāo)記?；蛘?，可使用編碼重鏈和輕鏈多肽兩者的單一載體。一旦產(chǎn)生了編碼抗VEGF抗體的一個或一個以上部分的核酸，就可將進(jìn)一步的變化或突變引入編碼序列中，例如以產(chǎn)生編碼具有不同CDR序列的抗體、對Fc受體的親和力降低的抗體或?qū)儆诓煌宇惖目贵w的核酸。也可通過化學(xué)合成(例如通過固相肽合成(Solid Phase Peptide Synthesis), 第二版，1984，皮爾斯化學(xué)品公司(The Pierce Chemical Co.)，伊利諾伊州羅克福德 (Rockford,Ill)中描述的方法)產(chǎn)生本發(fā)明的抗VEGF抗體。也可使用無細(xì)胞平臺來產(chǎn)生變體抗體(參見例如朱(Chu)等人，2001，生物化學(xué)(Biochemia)第2期(羅氏分子生物制品公司(Roche Molecular Biologicals)))。一旦通過重組表達(dá)產(chǎn)生了本發(fā)明的抗VEGF抗體，就可通過此項(xiàng)技術(shù)中已知用于純化免疫球蛋白分子的任何方法對其進(jìn)行純化，所述方法例如為色譜法(例如離子交換色譜法、親和色譜法(尤其在蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G選擇之后對VEGF進(jìn)行的親和色譜法，和尺寸篩分柱色譜法(sizing column chromatography))、離心法、差別溶解法或任何其它用于純化蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。此外，本發(fā)明的抗VEGF抗體或其片段可與本文所述或此項(xiàng)技術(shù)中另外已知的異源多肽序列融合以便于純化。一旦分離，可在必要時例如通過高效液相色譜法(參見例如費(fèi)舍爾(Fisher)，生
(Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology),沃克(Work)和波頓(Burdon)編，愛思唯爾社(Elsevier)，1980)或通過在 Superdex 75柱(法瑪西亞生物技術(shù)公司(Pharmacia Biotech AB)，瑞士烏普薩拉 (Uppsala, Sweden))上進(jìn)行的凝膠過濾色譜法來進(jìn)一步純化抗VEGF抗體。6. 3抗VEGF抗體的生物活性在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的抗VEGF抗體具有某些生物活性，例如與貝伐單抗或蘭尼單抗競爭結(jié)合于VEGF或中和VEGF活性。因此，在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的抗VEGF抗體與貝伐單抗或蘭尼單抗競爭結(jié)合于 VEGF?？墒褂酶偁幏治鰷y試競爭結(jié)合于VEGF的能力。在競爭分析的一個實(shí)例中，通過使培養(yǎng)盤與VEGF的溶液(例如于PBS中濃度為1 μ g/mL的溶液，在4°C下過夜)接觸，來使 VEGF粘附于固體表面(例如微孔培養(yǎng)盤(microwell plate))上。洗滌培養(yǎng)盤(例如用含 0. 吐溫20 (Tween 20)的PBS)，并進(jìn)行阻斷(例如在超級阻斷緩沖液(Superblock)中； 賽默科技公司(Thermo kientific)，伊利諾伊州羅克福德(Rockford，IL))。將亞飽和量的生物素化貝伐單抗(80ng/mL)或相當(dāng)量的生物素化蘭尼單抗與未經(jīng)標(biāo)記的貝伐單抗(或視情況可為蘭尼單抗)(“參考”抗體)或連續(xù)稀釋(例如濃度為2.8yg/mL、8.3yg/mL 或25 μ g/mL)的競爭性抗VEGF抗體(“測試”抗體)于ELISA緩沖液(例如含1 % BSA和 0.1%吐溫20的PBS)中的混合物添加到各孔中，并在輕微震蕩下將培養(yǎng)盤培育1小時。洗滌培養(yǎng)盤，將在ELISA緩沖液中稀釋的1 μ g/mL HRP結(jié)合抗生蛋白鏈菌素添加到各孔中，并將培養(yǎng)盤培育1小時。洗滌培養(yǎng)盤并通過添加底物(例如TMB，拜耳夫斯實(shí)驗(yàn)公司(Biofx Laboratories he.)，馬里蘭州奧因斯米爾斯(Owings Mills,MD))來檢測經(jīng)結(jié)合抗體。通過添加終止緩沖液(stop buffer)(例如拜耳FX (Bio FX)終止試劑；拜耳夫斯實(shí)驗(yàn)公司，馬里蘭州奧因斯米爾斯)來中止反應(yīng)，并使用微定量盤式讀取器(例如維薩米斯(VERSAmax)； 分子裝置公司(Molecular Devices)，加利福尼亞州森尼維爾(Sunnyvale，CA))在650nm 下測量吸光度。也可使用此競爭分析的變化形式來測試本發(fā)明抗VEGF抗體與貝伐單抗或蘭尼單抗之間的競爭。舉例來說，在某些方面中，抗VEGF抗體用作參考抗體且貝伐單抗或蘭尼單抗用作測試抗體。另外，可使用在培養(yǎng)的細(xì)胞(例如哺乳動物細(xì)胞)表面上表達(dá)的膜結(jié)合VEGF代替可溶性VEGF。競爭分析的其它形式在此項(xiàng)技術(shù)中為已知的并且可加以使用。在各種實(shí)施例中，當(dāng)所用本發(fā)明抗VEGF抗體的濃度為0. 08 μ g/mL、0. 4 μ g/mL、 2 μ g/mL、10 μ g/mL,50 μ g/mL、100 μ g/mL或濃度范圍介于任何上述值之間(例如濃度范圍為2 μ g/mL到10 μ g/mL)時，所述抗VEGF抗體使經(jīng)標(biāo)記貝伐單抗或蘭尼單抗的結(jié)合降低至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少 99%或范圍介于任何上述值之間的百分比(例如本發(fā)明的抗VEGF抗體使經(jīng)標(biāo)記貝伐單抗或蘭尼單抗的結(jié)合降低50%到70% )。在其它實(shí)施例中，當(dāng)所用貝伐單抗或蘭尼單抗的濃度為0.4yg/mL、2yg/mL、 10 μ g/mL、50 μ g/mL、250 μ g/mL或濃度范圍介于任何上述值之間(例如濃度范圍為2 μ g/ mL到10yg/mL)時，貝伐單抗或蘭尼單抗使本發(fā)明的經(jīng)標(biāo)記抗VEGF抗體的結(jié)合降低至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90 %或范圍介于任何上述值之間的百分比(例如貝伐單抗或蘭尼單抗使本發(fā)明的經(jīng)標(biāo)記抗VEGF抗體的結(jié)合降低50%到 70% )。在其它方面中，本發(fā)明的抗VEGF抗體在多項(xiàng)體外分析(例如細(xì)胞增殖或細(xì)胞遷移)中抑制(或中和)VEGF活性。舉例來說，在一個實(shí)施例中，所分析的VEGF活性為誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞(“EC”)增殖(參見例如秦(Qin)等人的方案，2006，生物化學(xué)雜志，281 32550-32558)。在另一實(shí)施例中，所分析的VEGF活性為誘導(dǎo)EC遷移(參見例如梁(Liang) 等人，2007,自然實(shí)驗(yàn)手冊(Nat. Protoc.) 2 =329-333所述的體外劃痕分析(scratch assay)方案)。在一個特定實(shí)施例中，測試抗VEGF抗體逆轉(zhuǎn)由VEGF刺激的增殖和細(xì)胞遷移以及由永生化牛視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中的VEGF165誘導(dǎo)的緊密連接蛋白的離域的能力(戴斯勒(Deissler)等人，2008，英國眼科雜志(British Journal of Ophthalmology) 92 839-843)。在另一實(shí)施例中，使用報告子分析法(importer assay)來分析VEGF活性的中和情況(參見例如優(yōu)諾(Yohno)等人，2003，生物學(xué)與藥理學(xué)公報(Biological & Pharmaceutical Bulletin) 26 (4) :417-20 ；和美國專利第 6，787，323 號)。VEGF中和分析的其它形式在此項(xiàng)技術(shù)中為已知的并且可加以使用。在各種實(shí)施例中，當(dāng)所用本發(fā)明抗VEGF抗體的濃度為2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、 20ng/mL、0. 1 μ g/mL、0. 2 μ g/mL、l μ g/mL、2 μ g/mL、5 μ g/mL、10 μ g/mL、20 μ g/mL 或濃度范圍介于任何上述值之間(例如濃度范圍為1 μ g/mL到5 μ g/mL)時，所述抗VEGF抗體中和至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或范圍介于任何上述值之間的百分比的VEGF(例如本發(fā)明的抗VEGF抗體中和50%到70%的VEGF活性)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的抗VEGF抗體在中和VEGF方面的效用是貝伐單抗或蘭尼單抗的至少0. 7倍、0. 8倍、至少0. 9倍、至少1倍、至少1. 1倍、至少1. 25倍、至少1. 5倍、 至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少200倍、至少500 倍、至少1000倍，或相對于貝伐單抗或蘭尼單抗，在中和VEGF方面的效用范圍介于任一對上述值之間(例如在中和VEGF方面的效用是貝伐單抗或蘭尼單抗的0. 9倍到5倍，或者效用是貝伐單抗或蘭尼單抗的2倍到50倍)。6. 4抗VEGF抗體的動力學(xué)性質(zhì)在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的抗VEGF抗體對VEGF具有高結(jié)合親和力。在特定實(shí)施例中，本發(fā)明的抗VEGF抗體具有特定締合速率常數(shù)(1^或1^值)、解離速率常數(shù)&。 或、 值)、親和力常數(shù)(&值)、解離常數(shù)(Kd值)和/或IC5tl值。在各種實(shí)施例中，可例如根據(jù)卡爾森(Karlsson)等人，1991，免疫法雜志(J. Immunol. Methods) 145 =229-240 中揭示的方法，使用表面等離子共振測定抗VEGF抗體與VEGF受體相互作用的結(jié)合常數(shù)。在某些方面中，這些值選自以下實(shí)施例。在一個特定實(shí)施例中，本發(fā)明的抗VEGF抗體結(jié)合于VEGF的k。n為至少ΙΟΙΥ1、 至少5ΧΚΛΤ1 s \ 至少 IO5M 1S 入至少5X IO5IT1 s \至少IO6M 1S \至少5 X IO6M 1S \至少 107M—\ 至少 5X107M—\ 至少 108M—\ 至少 5 X IO8M"1 s \至少IO9M 1S \或kon在介于任一對上述值之間的任何范圍內(nèi)(例如5X IO5M-1S.1到5X IO6M-1S-1,或ΙΟΙ、—1到IO8M^1s"1)。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明的抗VEGF抗體結(jié)合于VEGF的k。ff速率為ΙΟ、—1或以下、 5 X ΙΟ、—1或以下、ΙΟ、—1或以下、5 X ΙΟ、—1或以下、ΙΟ、—1或以下、5 X ΙΟ、—1或以下、ΙΟ、—1
24或以下、5X KT7iT1或以下、KT7iT1或以下、5Χ KTiV1或以下、KTiV1或以下，或k。ff速率在介于任一對上述值之間的任何范圍內(nèi)(例如5 X IOV1到IO-fV1,或KT3s-1到5 X KT5s-1)。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明的抗VEGF抗體結(jié)合于VEGFW Ka (k。n/k。ff)為至少ΙΟ 1、 至少 5 X IO9IT1、至少 IOiqIT1、至少 5 X IO10ITi、IO11ITi、至少 5 X IO11ITi、至少 IO12IT1、至少 5 X IO12M-1、至少 IO13M-1、至少 5 X IO13M-1、至少 IO14IT1、至少 5 X IO14IT1、至少 IO15IT1,或 Ka 在介于任一對上述值之間的任何范圍內(nèi)(例如5X IO9M.1到IO11M-1,或IO11M-1到5X IO14M.1)。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明的抗VEGF抗體結(jié)合于VEGF的Kd (k。ff/k。n)為1(Γ8Μ或以下、5X IOl或以下、IOl或以下、5X IO-ltlM或以下、IO-ltlM或以下、5X 10_"M或以下、KT11M 或以下、5X 10-1 或以下、KT12M或以下、5X KT13M或以下、1(Γ13Μ或以下、5X 1(Γ14Μ或以下、 10_mM或以下、5X10—、或以下、ΙΟ—、或以下，或Kd在介于任一對上述值之間的任何范圍內(nèi) (例如 5 X KT9M 到 5 X 1(Γ12Μ，或 5 X KT11M 到 5 X I(T13M)。在特定實(shí)施例中，通過此項(xiàng)技術(shù)中眾所周知或本文中所述的分析測定Kd(k。ff/k。n) 值，所述分析例如為ELISA、等溫滴定量熱法(isothermal titration calorimetry, ITC)、 熒光偏振分析或任何其它生物傳感器技術(shù)(例如BIAcore)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的抗VEGF抗體結(jié)合于VEGF并抑制VEGF與VEGF受體(Flt-I或Flk-I)的結(jié)合，其中IC5tl值小于5X107nM、小于107nM、小于5X106nM、小于 106nM、小于 5X105nM、小于 105nM、小于 5X104nM、小于 104nM、小于 5X 103nM、小于 103nM、小于5X102nM、小于ΙΟΟηΜ、小于90nM、小于80nM、小于70nM、小于65nM、小于60nM、小于50nM、 小于40nM、小于30nM、小于25nM、小于20nM、小于15nM、小于12nM、小于10nM、小于5nM、 小于 InM、小于 5 X ΙΟ—ηΜ、小于 ΙΟ—ηΜ、小于 5 X 10_2nM、小于 10_2nM、小于 5 X 10_3nM、小于 10_3nM、小于5X ΙΟΛιΜ或小于ΙΟΛιΜ，或IC5tl在介于任一對上述值之間的任何范圍內(nèi)(例如 5X 107ηΜ到50ηΜ，或15ηΜ到5Χ 10_3nM)。IC5tl可根據(jù)此項(xiàng)技術(shù)中眾所周知或本文中所述的方法(例如ELISA)測量。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明的抗VEGF抗體在生物分析(例如EC增殖或遷移分析)中結(jié)合于VEGF并中和VEGF的活性，其中IC5tl值小于5Χ 107ηΜ、小于107ηΜ、小于5Χ 106ηΜ、小于 106ηΜ、小于 5Χ 105ηΜ、小于 105ηΜ、小于 5Χ 104ηΜ、小于 104ηΜ、小于 5Χ 103ηΜ、小于 103ηΜ、 小于5 X 102ηΜ、小于ΙΟΟηΜ、小于90nM、小于80nM、小于70nM、小于65nM、小于60nM、小于 50nM、小于40nM、小于30nM、小于25nM、小于20nM、小于15nM、小于12nM、小于10nM、小于 5nM、小于 InM、小于 δΧΙΟ—ηΜ、小于 ΙΟ—ηΜ、小于 5X 10_、M、小于 10_2nM、小于 5X10_3nM、小于10_3ηΜ、小于5 X ΙΟΛιΜ或小于ΙΟΛιΜ，或IC5tl在介于任一對上述值之間的任何范圍內(nèi)(例如5 X 107ηΜ到50ηΜ，或15ηΜ到5 X 1(Γ3ηΜ)?？捎糜跍y量抗VEGF抗體的IC5tl的例示性中和分析描述于下文第6. 3節(jié)中。在某些實(shí)施例中，抗VEGF抗體在VEGF中和分析中結(jié)合于VEGF并抑制VEGF結(jié)合于 Flt-UFlk-I或兩者，或抑制VEGF活性，其中IC5tl值介于約Ipm與約1 μ M之間。在特定實(shí)施例中，抗VEGF抗體在VEGF中和分析中結(jié)合于VEGF并抑制VEGF結(jié)合于Flt-I、Flk-I或兩者，或抑制VEGF活性，其中IC5tl值介于IOpM與IOOnM之間、介于IOOpM與IOnM之間、介于200ρΜ與5ηΜ之間、介于300ρΜ與^M之間、介于500ρΜ與3ηΜ之間、介于750ρΜ與2ηΜ之間、介于InM與20ηΜ之間、介于500ρΜ與40ηΜ之間、介于50ρΜ與50ηΜ之間、介于250ρΜ與 IOOnM之間和介于IOOnM與1 μ M之間，或IC5tl在介于任一對上述值之間的任何范圍內(nèi)(例如 IOpM 到 50nM,或 750pM 到 2nM)。在上述實(shí)施例的某些方面中，測量在以下濃度VEGF存在下的IC5tl 0. 001 μ M, 0. 005 μΜ、0· 01 μ Μ、0· 05 μ Μ、0· 1μΜ、0· 5μΜ、1μΜ、10μΜ、20μΜ、30μΜ、40μΜ、50μΜ、 60 μ Μ、70 μ Μ、80 μ Μ、90 μ Μ、100 μ Μ、200 μ Μ、300 μ Μ、400 μ Μ、500 μ Μ、600 μ Μ、700 μ Μ、 800 μ Μ、900 μ MU000 μ Μ,或在任一對上述值之間的任何范圍內(nèi)的濃度(例如0. 01 μ M到 50 μ Μ，或 10 μ M 至Ij 100 μ Μ) ο在某些實(shí)施例中，本發(fā)明抗體在可比較分析中的動力學(xué)性質(zhì)與貝伐單抗或蘭尼單抗的動力學(xué)性質(zhì)相當(dāng)，或相對于貝伐單抗或蘭尼單抗的動力學(xué)性質(zhì)有所改良。舉例來說，在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的抗VEGF抗體結(jié)合于VEGF的k。n速率在貝伐單抗或蘭尼單抗的k。n 的約0.5X到1000X的范圍內(nèi)，例如k。n為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。n&0.5X、k。n為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。n的0. 75X、k。n為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。n的0. 9X、k。n為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。n的1 X、k。n為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。n的1. 1 X、k。n為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。n的1. 2X、k。n為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。n的1. 3X、k。n為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。n的1. 4X、k。n為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。n的1. 5X、k。n為貝伐單抗或蘭尼單抗的 k。n的1. 75X、k。n為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。n的2X、k。n為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。n的 2. 25X、k。n為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。n的2. 5X、k。n為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。n的3X、 k。n為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。n的4X、k。n為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。n的5X、k。n為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。n的7. 5X、k。n為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。n的IOX、k。n為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。n的15X、k。n為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。n的20X、k。n為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。n的50X、k。n為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。n的75X、k。n為貝伐單抗或蘭尼單抗的 k。n的100X、k。n為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。n的150X、k。n為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。n的 200 X、k。n為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。n的200 X或k。n的范圍介于任一對上述值之間，例如 k。n為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。n的2X到75X、k。n為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。n的5X到 100X、k。n為貝伐單抗或蘭尼單抗的、的0.5X到1000X、k。n為貝伐單抗或蘭尼單抗的 k。n 的 0. 75X 到 200X 等。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的抗VEGF抗體結(jié)合于VEGF的k。ff速率在貝伐單抗或蘭尼單抗的k。ff的0. OOlX到3X的范圍內(nèi)，例如k。ff為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。ff的
0.002X、k。ff為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。ff的0. 005X、k。ff為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。ff 的0. 0075 X、k。ff為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。ff的0. OlX、k。ff為貝伐單抗或蘭尼單抗的 k。ff的0. 025X、k。ff為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。ff的0. 05X、k。ff為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。ff的0. 075X、k。ff為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。ff的0. 1 X、k。ff為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。ff的0. 25X、k。ff為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。ff的0. 5X、k。ff為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。ff的0. 75X、k。ff為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。ff的0. 9X、k。ff為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。ff的1 X、k。ff為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。ff的1. 1 X、k。ff為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。ff 的1. 25X、k。ff為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。ff的1. 5X、k。ff為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。ff的
1.75X、k。ff為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。ff的4X、k。ff為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。ff的3X、 k。ff為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。ff的2X、k。ff為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。ff的3X，或k。ff 的范圍介于任一對上述值之間，例如k。ff為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。ff的0. 01 X到1. 1 X、 k。ff為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。ff的0. 05 X到1. 25X、k。ff為貝伐單抗或蘭尼單抗的k。ff的0. IX 到 0. 9X 等。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明的抗VEGF抗體結(jié)合于VEGF的Ka(k。n/k。ff)在貝伐單抗或蘭尼單抗的Ka的0. 25 X到1000 X的范圍內(nèi)，例如Ka為貝伐單抗或蘭尼單抗的Ka的0. 5 X、 Ka為貝伐單抗或蘭尼單抗的Ka的0. 75X、KA為貝伐單抗或蘭尼單抗的Ka的1 X、KA為貝伐單抗或蘭尼單抗的Ka的2X、Ka為貝伐單抗或蘭尼單抗的Ka的4X、Ka為貝伐單抗或蘭尼單抗的Ka的IOX、Ka為貝伐單抗或蘭尼單抗的Ka的15X、Ka為貝伐單抗或蘭尼單抗的Ka 的20X、KA為貝伐單抗或蘭尼單抗的Ka的30X、KA為貝伐單抗或蘭尼單抗的Ka的40X、KA 為貝伐單抗或蘭尼單抗的Ka的50X、KA為貝伐單抗或蘭尼單抗的Ka的100X、KA為貝伐單抗或蘭尼單抗的Ka的250X、Ka為貝伐單抗或蘭尼單抗的Ka的500X、Ka為貝伐單抗或蘭尼單抗的Ka的750 X、KA為貝伐單抗或蘭尼單抗的Ka的1000X，或Ka的范圍介于任一對上述值之間，例如Ka為貝伐單抗或蘭尼單抗的Ka的0. 75X到10 5X、Ka為貝伐單抗或蘭尼單抗的Ka的1 X到100X、Ka為貝伐單抗或蘭尼單抗的Ka的IOX到20X、Ka為貝伐單抗或蘭尼單抗的Ka的4X到50X、KA為貝伐單抗或蘭尼單抗的Ka的2X到20X，或者為可根據(jù)本文揭示的k。n* k。ff速率計算的任何值或范圍。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明的抗VEGF抗體結(jié)合于VEGF的Kd (koff/kon)在貝伐單抗或蘭尼單抗的Kd的0. OOlX到IOX的范圍內(nèi)，例如Kd為貝伐單抗或蘭尼單抗的Kd 的0. OOlX、Kd為貝伐單抗或蘭尼單抗的Kd的0. 005 X、Kd為貝伐單抗或蘭尼單抗的Kd 的0. OlX、Kd為貝伐單抗或蘭尼單抗的Kd的0. 05X、Kd為貝伐單抗或蘭尼單抗的Kd的
0.075X、KD為貝伐單抗或蘭尼單抗的Kd的0. 1 X、KD為貝伐單抗或蘭尼單抗的Kd的0. 2X、 Kd為貝伐單抗或蘭尼單抗的Kd的0. 3X、Kd為貝伐單抗或蘭尼單抗的Kd的0. 4X、Kd為貝伐單抗或蘭尼單抗的Kd的0. 5X、KD為貝伐單抗或蘭尼單抗的Kd的0. 6X、KD為貝伐單抗或蘭尼單抗的Kd的0. 7X、Kd為貝伐單抗或蘭尼單抗的Kd的0. 8X、Kd為貝伐單抗或蘭尼單抗的Kd的0. 9X、Kd為貝伐單抗或蘭尼單抗的Kd的1 X、Kd為貝伐單抗或蘭尼單抗的Kd的
1.5X、Kd為貝伐單抗或蘭尼單抗的Kd的2X、Kd為貝伐單抗或蘭尼單抗的Kd的4X、Kd為貝伐單抗或蘭尼單抗的Kd的7. 5X、KD為貝伐單抗或蘭尼單抗的Kd的IOX，或Kd的范圍介于任一對上述值之間，例如Kd為貝伐單抗或蘭尼單抗的Kd的0. OlX到2X、KD為貝伐單抗或蘭尼單抗的Kd的0. 1 X到1. 5X、Kd為貝伐單抗或蘭尼單抗的Kd的0. 7X到4X、Kd為貝伐單抗或蘭尼單抗的Kd的0. 2X到2X，或者為可根據(jù)本文揭示的1^和k。ff速率計算的任何值或范圍。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的抗VEGF抗體結(jié)合于VEGF并抑制VEGF結(jié)合于Flt-I、 Flk-I或兩者，或中和VEGF的活性，其中IC5tl值在貝伐單抗或蘭尼單抗的IC5tl的0. 001 X到 IOX的范圍內(nèi)，例如IC5tl為貝伐單抗或蘭尼單抗的IC5tl的0. OOlX、IC5tl為貝伐單抗或蘭尼單抗的IC5tl的0. 005X、IC5tl為貝伐單抗或蘭尼單抗的IC5tl的0. OlX、IC5tl為貝伐單抗或蘭尼單抗的IC5tl的0. 05 X、IC5tl為貝伐單抗或蘭尼單抗的IC5tl的0. 075 X、IC5tl為貝伐單抗或蘭尼單抗的IC5tl的0. 1 X、IC50為貝伐單抗或蘭尼單抗的IC5tl的0. 2X、IC50為貝伐單抗或蘭尼單抗的IC5tl的0. 3X、IC50為貝伐單抗或蘭尼單抗的IC5tl的0. 4X、IC50為貝伐單抗或蘭尼單抗的IC5tl的0. 5X、IC50為貝伐單抗或蘭尼單抗的IC5tl的0. 6X、IC50為貝伐單抗或蘭尼單抗的IC5tl的0. 7X、IC50為貝伐單抗或蘭尼單抗的IC5tl的0. 8X、IC50為貝伐單抗或蘭尼單抗的IC5tl的0. 9X、IC50為貝伐單抗或蘭尼單抗的IC5tl的1 X、IC50為貝伐單抗或蘭尼單抗的IC5tl的1. 5X、IC50為貝伐單抗或蘭尼單抗的IC5tl的2X、IC50為貝伐單抗或蘭尼單抗的IC5tl的4X、IC50為貝伐單抗或蘭尼單抗的IC5tl的7. 5X、IC50為貝伐單抗或蘭尼單抗的IC5tl的10 X，或IC5tl的范圍介于任一對上述值之間，例如IC5tl為貝伐單抗或蘭尼單抗的 IC50的0. OlX到2X、IC50為貝伐單抗或蘭尼單抗的IC50的0. IX到1. 5X、IC50為貝伐單抗或蘭尼單抗的IC5tl的0. 7X到4X、IC50為貝伐單抗或蘭尼單抗的IC5tl的0. 2X到2X。 在某些實(shí)施例中，單一CDR取代可引起與貝伐單抗或蘭尼單抗相比較的上述IC5tl差異，而與貝伐單抗或蘭尼單抗相比較，本發(fā)明的抗VEGF抗體可包含此取代以及至多16個額外⑶R 取代。6. 5抗VEGF抗體的降低的免疫原性在某些方面中，本發(fā)明提供免疫原性相比貝伐單抗或蘭尼單抗有所降低的抗VEGF 抗體。本發(fā)明提供相比貝伐單抗的CDR在CDR和/或框架區(qū)中具有單一或多個氨基酸取代的抗VEGF抗體，其中至少一個取代使所述抗體的免疫原性相比貝伐單抗或蘭尼單抗有所降低。在某些實(shí)施例中，免疫原性降低由導(dǎo)致消除或減少一個或一個以上T細(xì)胞表位的一個或一個以上氨基酸取代引起。在某些方面中，免疫原性降低的本發(fā)明抗VEGF抗體具有相比貝伐單抗或蘭尼單抗相當(dāng)或改良的生物活性，例如對VEGF的親和力或?qū)EGF活性的中和作用。這些性質(zhì)可例如通過上文第6. 3節(jié)中所述的方法來測試。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明抗VEGF抗體的免疫原性相對于貝伐單抗或蘭尼單抗抗體有所降低。這些抗體一般相對于重鏈和/或輕鏈可變區(qū)在對應(yīng)于SEQ ID NO 25,SEQ ID N0:62和/或SEQ ID NO :74的區(qū)域中具有變體序列。所述抗體一般將在對應(yīng)于SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO :62和SEQ ID NO 74的一個、兩個或全部三個序列中具有一個、兩個或三個氨基酸取代，但是本文中也涵蓋在一個、兩個或全部三個區(qū)域中有至多四個或五個取代。如本發(fā)明中所用，“免疫原性降低的”變體是指在對應(yīng)于SEQ ID NO 25、SEQ ID NO 62和/或SEQ ID NO 74的區(qū)域中具有變體序列的抗VEGF抗體在末梢血液單核細(xì)胞中引起的增殖反應(yīng)分別低于SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 62或SEQ ID NO :74的肽?？捎糜谠u價增殖反應(yīng)的例示性增殖分析闡述于下文第7節(jié)中。增殖反應(yīng)的降低可通過反應(yīng)者 (responder)百分比、刺激指數(shù)或兩者來反映。在其它實(shí)施例中，與具有SEQ ID NO 25、SEQ ID N0:62或SEQ ID N0:74的序列的肽相比較，變體序列使反應(yīng)者減少至少25%、反應(yīng)者減少至少30%、反應(yīng)者減少至少35%、 反應(yīng)者減少至少40 %、反應(yīng)者減少至少45 %、反應(yīng)者減少至少50 %、反應(yīng)者減少至少60 %、 反應(yīng)者減少至少65 %、反應(yīng)者減少至少70 %、反應(yīng)者減少至少75 %、反應(yīng)者減少至少80 %、 反應(yīng)者減少至少85%、反應(yīng)者減少至少90%、反應(yīng)者減少至少95%、反應(yīng)者減少100%，或反應(yīng)者減少的范圍介于任何上述值之間，例如反應(yīng)者減少25%到75%、反應(yīng)者減少50%到 90%、反應(yīng)者減少60%到100%、反應(yīng)者減少70%到90%等。在其它實(shí)施例中，變體序列導(dǎo)致刺激指數(shù)比分別由SEQ ID NO :25、SEQ ID NO 62 或SEQ ID NO 74的肽引起的刺激指數(shù)減低至少5%、減低至少10%、減低至少15%、減低至少20%、減低至少25%、減低至少30%、減低至少35%或減低至少40%，或?qū)е麓碳ぶ笖?shù)相比SEQ ID NO 25,SEQ ID NO :62或SEQ ID NO :74的肽減低的范圍介于任何上述值之間，例如減低5%到20%、減低10%到30%、減低25%到35%、減低30%到40%等。
28
與貝伐單抗或蘭尼單抗相比較免疫原性降低的候選抗VEGF抗體的例示性實(shí)施例包含表6中所示的一個或一個以上CDR取代或取代的組合。與貝伐單抗或蘭尼單抗相比較免疫原性降低的抗VEGF抗體任選包含一個或一個以上額外取代，例如表7到13的任一者中的呈單一形式或組合形式的⑶R突變。與貝伐單抗或蘭尼單抗相比較免疫原性降低的候選抗VEGF抗體的其它例示性實(shí)施例包含表14到16中所示的一個或一個以上⑶R取代或取代的組合。與貝伐單抗或蘭尼單抗相比較免疫原性降低的抗VEGF抗體的一些優(yōu)選實(shí)施例提供于表19中。6.6抗體結(jié)合物本發(fā)明的抗VEGF抗體包括例如通過將任何類型的分子共價連接到抗體以使共價連接不干擾與VEGF的結(jié)合來進(jìn)行修飾的抗體結(jié)合物。在某些方面中，本發(fā)明的抗VEGF抗體可結(jié)合于效應(yīng)部分或標(biāo)記。本文所用的術(shù)語 “效應(yīng)部分”包括例如抗贅瘤劑、藥物、毒素、生物活性蛋白質(zhì)(例如酶)、其它抗體或抗體片段、合成或天然存在的聚合物、核酸(例如DNA和RNA)、放射性核素(具體說來，放射性碘、 放射性同位素)、螯合金屬、納米粒子和報告子組(例如熒光化合物或可用NMR或ESR光譜法檢測的化合物)。在一個實(shí)例中，抗VEGF抗體可結(jié)合于效應(yīng)部分(例如細(xì)胞毒性劑、放射性核素或藥物部分)，以改變指定生物反應(yīng)。效應(yīng)部分可為蛋白質(zhì)或多肽，例如(但不限于)毒素(例如相思豆毒素(abrin)、蓖麻毒素A、綠膿桿菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)或白喉毒素 (Diphtheria toxin))、信號傳導(dǎo)分子(例如α-干擾素、β -干擾素、神經(jīng)生長因子、血小板源性生長因子或組織纖維蛋白溶酶原活化因子)、血栓形成劑(thrombotic agent)或抗血管生成劑(例如血管抑制素(angiostatin)或內(nèi)皮抑制素(endostatin))或生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑(例如細(xì)胞激素或生長因子，例如白細(xì)胞介素-1 (IL-I)、白細(xì)胞介素-2 (IL-2)、白細(xì)胞介素-6 (IL-6)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)或神經(jīng)生長因子(NGF))。在另一實(shí)例中，效應(yīng)部分可為細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒性劑。細(xì)胞毒素和細(xì)胞毒性劑的實(shí)例包括紫杉醇(taxol)、細(xì)胞遲緩素B (cytochalasin B)、短桿菌素D (gramicidin D)、溴化乙錠、吐根素(emetine)、絲裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、替諾泊苷(tenoposide)、長春新堿(vincristine)、長春花堿(vinblastine)、秋水仙素 (colchicin)、多柔比星(doxorubicin)、佐柔比星(daunorabicin)、二尹圣基炭直菌素二 Sf (dihydroxy anthracin dione)、米托惠酉昆(mitoxantrone)、光神霄素(mithramycin) > 放線菌素Dbctinomycin D)、1-去氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因(procaine)、丁卡因 (tetracaine)(Iidocaine)(propranolol)禾口0^(1^ (puromycin), 以及其類似物或同系物。效應(yīng)部分也包括(但不限于)抗代謝物(例如甲氨蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷(cytarabine)、5_氟尿嘧啶、達(dá)卡巴嗪(decartazine))、烷基化劑(例如二氯甲基二乙胺、硫替派(thio印a)苯丁酸氮芥(chlorambucil)、美法侖 (melphalan)、卡莫司汀(carmustine) (BSNU)和洛莫斯汀(Iomustine) (CCNU)、環(huán)硫磷酰胺 (cyclothosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露糖醇、鏈脲佐菌素(streptozotocin)、 絲裂霉素C5 (mitomycin C5)和順-二氯二胺鉬(II) (DDP)順鉬(cisplatin))、蒽環(huán)霉素(anthracycline)(例如佐柔比星(daunorubicin)(以前稱為道諾霄素(daunomycin))禾口多柔比星)、抗生素(例如放線菌素(dactinomycin)(以前稱為放線菌素(actinomycin)、 博萊霉素(bleomycin)、光神霉素(mithramycin)和氨茴霉素(anthramycin, AMC)、卡奇霉素(calicheamicin)或倍癌霉素(duocarmycin))和抗有絲分裂劑(例如長春新堿和長春花堿)。其它效應(yīng)部分可包括放射性核素，例如(但不限于)和9°Y、Lum、鉍213、锎M2、 銥1532和鎢188/錸188 ；以及藥物，例如(但不限于)烷基磷酸膽堿、拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑、紫杉化物(taxoid)和蘇拉明(suramin)。用于使這些效應(yīng)部分結(jié)合于抗體的技術(shù)是此項(xiàng)技術(shù)中眾所周知的(參見例如海爾斯托姆(Hellstrom)等人，控制性藥物傳遞(Controlled Drug Delivery)，第二版，第 623-53頁(羅賓森(Robinson)等人編，1987))；賽洛普(Thorpe)等人，1982，免疫學(xué)評述(Immunol. Rev. )62 :119-58 ；和杜波維奇克(Dubowchik)等人，1999，藥理學(xué)與治療學(xué) (Pharmacology and Therapeutics) 83 :67_123)。在一個實(shí)例中，抗VEGF抗體或其片段經(jīng)由共價鍵(例如肽鍵)通過抗體的N末端或C末端或在內(nèi)部與另一蛋白質(zhì)(或其部分，例如蛋白質(zhì)的至少10、20或50個氨基酸部分) 的氨基酸序列融合?？贵w或其片段可在抗體恒定域的N末端連接到另一蛋白質(zhì)。重組DNA 程序可用于產(chǎn)生這些融合物，例如WO 86/01533和EP0392745中所述。在另一實(shí)例中，效應(yīng)分子可延長體內(nèi)半衰期和/或增進(jìn)抗體跨上皮障壁傳遞到免疫系統(tǒng)。適合的此類型效應(yīng)分子的實(shí)例包括聚合物、白蛋白、白蛋白結(jié)合蛋白或白蛋白結(jié)合化合物，例如WO 2005/117984 中所述者。在某些方面中，抗VEGF抗體結(jié)合于小分子毒素。在某些例示性實(shí)施例中，本發(fā)明的抗VEGF抗體結(jié)合于海兔毒素(dolastatin)或者海兔毒素的肽類似物或衍生物，例如奧瑞他汀(auristatin)(美國專利第5，635，483號和第5，780，588號)。海兔毒素或奧瑞他汀藥物部分可通過其N(氨基)末端、C(羧基)末端或在內(nèi)部連接到抗體(W0 02/088172)。 例示性奧瑞他汀實(shí)施例包括N末端連接的單甲基奧瑞他汀藥物部分DE和DF，如美國專利第7，498，298號中所揭示(所述專利以全文引用的方式并入本文中；其揭示例如連接子以及制備結(jié)合于連接子的例如MMAE和MMAF等單甲基纈氨酸化合物的方法)。在其它例示性實(shí)施例中，小分子毒素包括(但不限于)卡奇霉素、美登素 (maytansine)(美國專利第 5，208，020 號)、新月毒素(trichothene)和 CC1065。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，抗體結(jié)合于一個或一個以上美登素分子(例如每個抗體分子約1到約 10個美登素分子)。美登素可例如轉(zhuǎn)變成May-SS-Me,May-SS-Me可被還原成May_SH3并與抗體反應(yīng)(查瑞(Chari)等人，1992，癌癥研究(Cancer Research) 52 :127-131)以產(chǎn)生美登素生物堿-抗體(maytansinoid-antibody)或美登素生物堿-Fc融合結(jié)合物。也可使用的卡奇霉素的結(jié)構(gòu)類似物包括(但不限于)Y/、Y Λ N-乙?；?γ/、PSAG和θ/(海因曼(Hinman)等人，1993，癌癥研究，53 :3336-3342 ；羅德(Lode)等人，1998，癌癥研究，58 2925-2928 ；美國專利第5，714，586號、美國專利第5，712，374號、美國專利第5，264，586 號、美國專利第5，773，001號)。本發(fā)明抗體還可結(jié)合于脂質(zhì)粒以用于靶向傳遞(參見例如帕克(Park)等人，1997，藥理學(xué)進(jìn)展(Adv. Pharmacol. )40 :399-435 ；馬提(Marty)和斯查文登納(Schwendener)，2004，分子醫(yī)學(xué)方法(Methods in Molecular Medicine) 109 :389-401)。在一個實(shí)例中，本發(fā)明抗體可連接到聚乙二醇(PEG)部分。在一個特定實(shí)例中， 抗體為抗體片段且PEG部分可通過位于抗體片段中的任何可用氨基酸側(cè)鏈或末端氨基酸官能團(tuán)(例如任何自由氨基、亞氨基、硫醇基、羥基或羧基)連接。這些氨基酸可天然存在于抗體片段中或可使用重組DNA方法經(jīng)工程改造到所述片段中。參見例如美國專利第 5，219，996號?？梢允褂枚鄠€位點(diǎn)連接兩個或兩個以上PEG分子。PEG部分可通過位于抗體片段中的至少一個半胱氨酸殘基的硫醇基共價連接。當(dāng)硫醇基用作連接點(diǎn)時，可使用適當(dāng)活化的效應(yīng)部分，例如硫醇選擇性衍生物，例如順丁烯二酰亞胺和半胱氨酸衍生物。在一個特定實(shí)例中，抗VEGF抗體結(jié)合物是聚乙二醇化的經(jīng)修飾Fab'片段，即例如根據(jù)EP0948M4中揭示的方法共價連接到PEG(聚(乙二醇))。也參見聚(乙二醇)化學(xué)、生物技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用(Poly(ethyleneglycol)Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications), (J.米爾頓哈瑞絲(J.Milton Harris)編，派拉蒙出版社(Plenum Press)，紐約(New York)，1992)；聚(乙二醇)化學(xué)與生物應(yīng)用 (Poly (ethyleneglycol)Chemistry and Biological Applications), (J.米爾頓哈瑞絲和S.扎利浦斯基(S. Zalipsky)編，美國化學(xué)協(xié)會(American Chemical Society)，華盛頓哥倫比亞特區(qū)(Washington D. C.)，1997)；和生物結(jié)合生物醫(yī)學(xué)科學(xué)的蛋白質(zhì)偶合技術(shù) (Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences), (M.艾斯蘭(Μ. As lam)和Α.登特(A.Dent)編，格魯夫出版社(Grove Publishers)，紐約(New York), 1998)；和查普曼(Chapman)，2002，先進(jìn)藥物傳遞評論(Advanced Drug Delivery Reviews) 54 :531-545。PEG可連接到鉸鏈區(qū)中的半胱氨酸。在一個實(shí)例中，PEG修飾的Fab ‘ 片段具有順丁烯二酰亞胺基共價連接到經(jīng)修飾鉸鏈區(qū)中的單一硫醇基。賴氨酸殘基可共價連接到順丁烯二酰亞胺基，且對于賴氨酸殘基上的各胺基，可連接分子量為約20，OOODa的甲氧基聚(乙二醇)聚合物。連接到!^b'片段的PEG的總分子量因此可為約40，OOODa?！皹?biāo)記” 一詞當(dāng)用于本文中時是指可直接或間接結(jié)合于本發(fā)明的抗VEGF抗體的可檢測化合物或組合物。標(biāo)記可本身為可檢測的(例如放射性同位素標(biāo)記或熒光標(biāo)記)，或在酶標(biāo)記情形中可催化底物化合物或組合物發(fā)生可檢測的化學(xué)變化。有用的熒光部分包括 (但不限于)熒光素、熒光素異硫氰酸酯、若丹明(rhodamine)、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻紅素(phycoerythrin)等。有用的酶標(biāo)記包括(但不限于)堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、 葡萄糖氧化酶等。特別適用于診斷目的的其它抗VEGF抗體結(jié)合物描述于下文第6. 7節(jié)中。6. 7抗VEGF抗體的診斷應(yīng)用本發(fā)明的抗VEGF抗體，包括已例如通過生物素化、辣根過氧化物酶或任何其它可檢測部分(包括第6.6節(jié)中所述者)修飾的抗體，可有利地用于診斷目的。具體說來，抗VEGF抗體可用于例如(但不限于)純化或檢測VEGF，包括體外和體內(nèi)診斷方法。舉例來說，抗體可在免疫分析中用于定性和定量測量生物樣本中VEGF的含量。參見例如哈羅(Harlow)等人，抗體實(shí)驗(yàn)手冊(Antibodies :A Laboratory Manual)，第二版(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，1988)，其以全文引用的方式并入本文中。本發(fā)明進(jìn)一步涵蓋結(jié)合于診斷劑的抗體或其片段。可在診斷上使用抗體(例如)來檢測相關(guān)目標(biāo)于特定細(xì)胞、組織或血清中的表達(dá)；或監(jiān)測免疫反應(yīng)的發(fā)展或進(jìn)展作為臨床測試程序的一部分以例如確定既定治療方案的功效?？赏ㄟ^使抗體與可檢測物質(zhì)偶合來促進(jìn)檢測?？蓹z測物質(zhì)的實(shí)例包括各種酶、輔基、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、生物發(fā)光物質(zhì)、放射性物質(zhì)、正電子發(fā)射金屬(使用各種正電子發(fā)射斷層攝影術(shù))和非放射性順磁性金屬離子?？蓹z測物質(zhì)可直接或使用此項(xiàng)技術(shù)中已知的技術(shù)通過中間物(例如此項(xiàng)技術(shù)中已知的連接子)間接偶合或結(jié)合于抗體(或其片段)。酶標(biāo)記的實(shí)例包括熒光素酶(例如螢火蟲熒光素酶和細(xì)菌熒光素酶；美國專利第4，737，456號)、熒光素、2，3- 二氫酞嗪二酮 (2，3-dihydr0phthalazinedi0ne)、蘋果酸脫氫酶、尿素酶、過氧化物酶(例如辣根過氧化物酶(HRPO))、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、乙酰膽堿酯酶、葡糖淀粉酶(glucoamylase)、 溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、雜環(huán)氧化酶(例如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)、乳酸過氧化物酶(lactoperoxidase)、微過氧化物酶 (microperoxidase)等。適合輔基復(fù)合物的實(shí)例包括抗生蛋白鏈菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；適合熒光物質(zhì)的實(shí)例包括傘酮、熒光素、熒光素異硫氰酸酯、若丹明、二氯三嗪基胺熒光素、丹酰氯或藻紅素；發(fā)光物質(zhì)的實(shí)例包括魯米諾(luminol)；生物發(fā)光物質(zhì)的實(shí)例包括熒光素酶、熒光素和水母發(fā)光蛋白(aequorin)；且適合放射性物質(zhì)的實(shí)例包括 125L131Cn 或"Tc。本發(fā)明提供VEGF表達(dá)的檢測，其包含使用一種或一種以上本發(fā)明的抗VEGF抗體(任選結(jié)合于可檢測部分)接觸生物樣本(個體的細(xì)胞、組織或體液)，并檢測樣本對于 VEGF表達(dá)是否為陽性或樣本的表達(dá)相比對照樣本是否發(fā)生改變(例如降低或增加)?？墒褂帽景l(fā)明方法診斷的疾病包括(但不限于)本文所述的疾病。在某些實(shí)施例中，組織或體液為末梢血液、末梢血液白細(xì)胞、活組織檢查組織(例如肺或皮膚活組織檢查)和組織。6.8使用抗VEGF抗體的治療方法6.8.1臨床益處本發(fā)明的抗VEGF抗體可用于治療以病理性血管生成為特征的各種贅瘤或非贅生性病狀。本發(fā)明抗體適用于治療血管生成在腫瘤生長中起重要作用的腫瘤，包括癌癥和良性腫瘤。本文中欲治療的癌癥的實(shí)例包括(但不限于)癌瘤、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤、肉瘤和白血病。所述癌癥的更特定的實(shí)例包括鱗狀細(xì)胞癌、肺癌(包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌和肺鱗癌)、腹膜癌、肝細(xì)胞癌、胃癌(包括胃腸癌)、胰腺癌、神經(jīng)膠母細(xì)胞瘤、 子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細(xì)胞瘤、乳癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎臟癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌(vulval cancer)、甲狀腺癌、肝癌(h印atic carcinoma)和各種類型的頭和頸癌，以及B細(xì)胞淋巴瘤(包括低度/濾泡性非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin' s lymphoma, NHL)、小淋巴細(xì)胞性(SL)NHL、中度/濾泡性NHL、中度彌漫性NHL、重度免疫母細(xì)胞性NHL、重度淋巴母細(xì)胞性NHL、重度小無裂細(xì)胞(non-cleaved cell)NHL、巨大腫塊NHL、套細(xì)胞淋巴瘤、AIDS相關(guān)性淋巴瘤和瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥 (Waldenstrom' s Macroglobulinemia))、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)、急性淋巴母細(xì)胞性白血病(ALL)、毛細(xì)胞白血病(Hairy cell leukemia)、慢性骨髓母細(xì)胞白血病和移植后淋巴組織增生病癥(PTLD)，以及與母斑病、水腫(例如與腦腫瘤相關(guān)的水腫)和梅格氏綜合癥(Meigs' syndrome)相關(guān)的異常血管增生。更具體說來，可用本發(fā)明抗體治療的癌癥包括乳癌、結(jié)腸直腸癌、直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、腎細(xì)胞癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、軟組織肉瘤、卡波西氏肉瘤(kaposi' s sarcoma)、類癌瘤(carcinoid carcinoma)、頭和頸癌、黑色素瘤、卵巢癌、間皮瘤(mesothelioma)和多發(fā)性骨髓瘤。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的抗VEGF抗體用于治療人類患者的結(jié)腸直腸癌。本發(fā)明涵蓋抗血管生成療法，這是一種旨在抑制提供養(yǎng)分以支持腫瘤生長所需的腫瘤血管的發(fā)育的癌癥治療策略。因?yàn)檠苌膳c原發(fā)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移兩者有關(guān)，所以本發(fā)明提供的抗血管生成治療能夠抑制在原發(fā)部位處腫瘤的贅生性生長以及防止在繼發(fā)部位處腫瘤的轉(zhuǎn)移?？捎帽景l(fā)明抗體治療的非贅生性病狀包括視網(wǎng)膜疾病(例如年齡相關(guān)性黃斑部變性)以及免疫和發(fā)炎疾病(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、動脈粥樣硬化、糖尿病性和其它增生性視網(wǎng)膜病(包括早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病)、晶狀體后纖維組織增生、新生血管性青光眼、 年齡相關(guān)性黃斑部變性、甲狀腺增生(包括格雷夫氏病(Grave' s disease))、角膜和其它組織移植、慢性炎癥、肺炎、腎病綜合癥、子癇前癥、腹水、心包積液(例如與心包炎相關(guān)的心包積液)和胸膜積液)。因此，本發(fā)明提供治療有需要的患者的任何上述疾病的方法，其包含投予所述患者本發(fā)明的抗VEGF抗體。任選例如在以下時間之后重復(fù)所述投藥一天、兩天、三天、五天、 一周、兩周、三周、一個月、五周、六周、七周、八周、兩個月或三個月?？梢韵嗤瑒┝炕虿煌瑒┝恐貜?fù)投藥。投藥可重復(fù)一次、兩次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或十次以上。舉例來說，根據(jù)某些給藥方案，患者接受抗VEGF療法較長時間，例如6個月、1年或 1年以上。在某些實(shí)施例中，投予患者的抗VEGF抗體的量為治療有效量。如本文所用，“治療有效”量的VEGF抗體可作為單次劑量投予或在治療方案的整個過程內(nèi)投予，持續(xù)例如一周、兩周、三周、一個月、三個月、六個月、一年或一年以上的過程。例示性治療方案描述于下文第6. 11節(jié)中。根據(jù)本發(fā)明，治療疾病涵蓋治療已診斷為患有處于任何臨床階段或表現(xiàn)的任何形式的疾病的患者、延遲疾病癥狀或病征的發(fā)作或發(fā)展或加重或惡化，和/或預(yù)防疾病和/或降低疾病的嚴(yán)重性。本發(fā)明的抗VEGF抗體所投予的“個體”或“患者”優(yōu)選為哺乳動物，例如非靈長類動物(例如牛、豬、馬、貓、狗、大鼠等)或靈長類動物(例如猴或人類)。在某些實(shí)施例中， 個體或患者為人類。在某些方面中，人類為兒科患者。在其它方面中，人類為成人患者。6.9醫(yī)藥組合物和投藥途徑本文提供包含本發(fā)明的抗VEGF抗體、任選使用的一種或一種以上額外治療劑(例如下文第6. 10節(jié)中所述的組合治療劑)的組合物。組合物通常將作為一般會包括醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑的無菌醫(yī)藥組合物的一部分來提供。所述組合物可呈任何適合的形式(取決于將其投予患者的所需方法)。本發(fā)明的抗VEGF抗體可通過多種途徑，例如經(jīng)口、透皮、經(jīng)皮下、經(jīng)鼻內(nèi)、經(jīng)靜脈內(nèi)、經(jīng)肌肉內(nèi)、經(jīng)眼內(nèi)、經(jīng)局部、經(jīng)鞘內(nèi)和經(jīng)腦室內(nèi)投予患者。在任何既定情況下，最適合的投藥途徑將取決于特定抗體、個體和疾病的性質(zhì)與嚴(yán)重性以及個體的身體狀況。對于治療除視網(wǎng)膜疾病以外的適應(yīng)癥，本發(fā)明抗VEGF抗體的有效劑量范圍可為每單次(例如團(tuán)注)投藥、多次投藥或連續(xù)投藥約0. lmg/kg到約75mg/kg，或每單次(例如團(tuán)注)投藥、多次投藥或連續(xù)投藥使血清濃度達(dá)到0. 01 μ g/mL到5000 μ g/mL血清濃度，或其中任何有效范圍或值，此取決于所治療病狀、投藥途徑以及個體的年齡、重量和狀況。在某些實(shí)施例中，例如對于治療癌癥，各劑量范圍可為每公斤體重約0. Img到約50mg，例如每公斤體重約:3mg到約25mg?？贵w可調(diào)配成水溶液并通過皮下注射來投予。對于治療視網(wǎng)膜疾病(例如年齡相關(guān)性黃斑部變性(AMD))，劑量宜使所注射的眼中水狀液的抗VEGF抗體濃度為1 μ g/mL到50 μ g/mL。對于治療AMD，各劑量可為0. Img到約lmg，例如約0. 25mg到約0. 5mg。抗體可調(diào)配成水溶液并通過玻璃體內(nèi)注射來投予。醫(yī)藥組合物宜呈每劑含有預(yù)定量本發(fā)明的抗VEGF抗體的單位劑型形式。此類單位可含有例如(但不限于)0. Img到5g，例如Img到lg、或10到50mg。用于本發(fā)明中的醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑可例如視欲治療病狀或投藥途徑而采用各種形式?？赏ㄟ^將具有所要純度的抗體與通常用于此項(xiàng)技術(shù)中的任選的醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑、賦形劑或穩(wěn)定劑(全部在本文中稱為“載劑”；即緩沖劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、等張劑、 非離子清潔劑、抗氧化劑和其它各種各樣的添加劑)混合，將本發(fā)明抗VEGF抗體的治療性調(diào)配物制備成凍干調(diào)配物或水溶液形式以供儲存。參見雷氏藥學(xué)大全(Remington' s Pharmaceutical Sciences)，第16版(奧索(Osol)編1980)。這些添加劑在所用劑量和濃度下必須對接受者是無毒的。緩沖劑有助于將pH值維持在接近生理?xiàng)l件的范圍內(nèi)。其濃度可在約2mM到約 50mM的范圍內(nèi)。適用于本發(fā)明的緩沖劑包括有機(jī)酸與無機(jī)酸兩者及其鹽，例如檸檬酸鹽緩沖液(例如檸檬酸單鈉-檸檬酸二鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸三鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸單鈉混合物等)、琥珀酸鹽緩沖液(例如琥珀酸-琥珀酸單鈉混合物、琥珀酸-氫氧化鈉混合物、琥珀酸-琥珀酸二鈉混合物等)、酒石酸鹽緩沖液(例如酒石酸-酒石酸鈉混合物、酒石酸-酒石酸鉀混合物、酒石酸-氫氧化鈉混合物等)、反丁烯二酸鹽緩沖液(例如反丁烯二酸-反丁烯二酸單鈉混合物、反丁烯二酸-反丁烯二酸二鈉混合物、反丁烯二酸單鈉-反丁烯二酸二鈉混合物等)、葡糖酸鹽緩沖液(例如葡糖酸-葡糖酸鈉混合物、葡糖酸-氫氧化鈉混合物、葡糖酸-葡糖酸鉀混合物等)、草酸鹽緩沖液(例如草酸-草酸鈉混合物、草酸-氫氧化鈉混合物、草酸-草酸鉀混合物等)、乳酸鹽緩沖液(例如乳酸-乳酸鈉混合物、 乳酸-氫氧化鈉混合物、乳酸-乳酸鉀混合物等)和乙酸鹽緩沖液(例如乙酸-乙酸鈉混合物、乙酸-氫氧化鈉混合物等)。另外，可使用磷酸鹽緩沖液、組氨酸緩沖液和三甲胺鹽 (例如 Tris)?？商砑臃栏瘎┮宰柚刮⑸锷L，且其添加量可在0.2%到(w/v)的范圍內(nèi)。適用于本發(fā)明的防腐劑包括苯酚、芐醇、間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、十八基二甲基芐基氯化銨、苯甲烴銨鹵化物(benzalconium halide)(例如，氯化物、 溴化物和碘化物)、氯化六羥季銨和對羥基苯甲酸烷基酯(例如，對羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯)、兒茶酚、間苯二酚、環(huán)己醇和3-戊醇。可添加等張劑(有時稱為“穩(wěn)定劑”)以確保本發(fā)明的液體組合物的等張性，且其包括多羥基糖醇，例如三羥基或三個以上羥基的糖醇，例如甘油、赤藻糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。穩(wěn)定劑是指一大類賦形劑，其功能可在增積劑(bulking agent)到使治療劑溶解或有助于防止變性或粘著于容器壁的添加劑的范圍內(nèi)。典型穩(wěn)定劑可為多羥基糖醇(如上文列舉)；氨基
34酸，例如精氨酸、賴氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、丙氨酸、鳥氨酸、L-亮氨酸、 2-苯丙氨酸、谷氨酸、蘇氨酸等；有機(jī)糖或糖醇，例如乳糖、海藻糖、水蘇糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇(myoinisitol)、半乳糖醇、甘油等，包括環(huán)醇(cyclitol)，例如纖維醇(inositol)；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫還原劑，例如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸(thioctic acid)、巰基乙酸鈉、硫代甘油、α-單硫代甘油和硫代硫酸鈉；低分子量多肽 (例如具有10個或10個以下殘基的肽)；蛋白質(zhì)，例如人類血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮單糖，例如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；雙糖，例如乳糖、麥芽糖、蔗糖；和三糖，例如棉子糖；以及多糖，例如葡聚糖。存在的穩(wěn)定劑可在每重量份活性蛋白質(zhì)0. 1到10，000重量的范圍內(nèi)?？商砑臃请x子表面活性劑或清潔劑(也稱為“濕潤劑”)以幫助溶解治療劑以及保護(hù)治療性蛋白質(zhì)免于發(fā)生攪拌誘發(fā)的聚集，其也允許調(diào)配物暴露于承受應(yīng)力的剪切面而不引起蛋白質(zhì)變性。適合的非離子表面活性劑包括聚山梨醇酯O0、80等)、泊洛沙姆 (polyoxamer) (184、188等)、普流尼克多元醇(Pluronic polyol)、聚氧化乙烯脫水山梨糖醇單醚(TWEEN -20、TWEEN -80等)。存在的非離子表面活性劑可在約0. 05mg/ml到約 1. 0mg/ml，例如約0. 07mg/ml到約0. 2mg/ml的范圍內(nèi)。其它各種各樣的賦形劑包括增積劑(例如淀粉)、螯合劑(例如EDTA)、抗氧化劑 (例如抗壞血酸、甲硫氨酸、維生素E)和共溶劑。本文的調(diào)配物除本發(fā)明的抗VEGF抗體外也可含有組合治療劑。適合的組合治療劑的實(shí)例提供于下文第6. 10節(jié)中。皮下投藥的給藥時程可在每六個月一次到每日一次之間變化，此取決于眾多臨床因素，包括疾病類型、疾病的嚴(yán)重性和患者對抗VEGF抗體的敏感性。欲投予的本發(fā)明抗VEGF抗體的劑量將視以下而變化特定抗體、疾病類型(例如癌癥、發(fā)炎等)、個體和疾病的嚴(yán)重性、個體的身體狀況、治療方案(例如是否使用組合治療齊U)和所選投藥途徑；所屬領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定適當(dāng)劑量。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到，本發(fā)明抗VEGF抗體的最佳量和個別劑量的間隔將由所治療病狀的性質(zhì)和程度；投藥形式、途徑和部位；以及所治療特定個體的年齡和狀況決定，且醫(yī)師將最終確定欲使用的適當(dāng)劑量。每當(dāng)適當(dāng)時可重復(fù)所述劑量。如果發(fā)生副作用，那么可根據(jù)常規(guī)臨床實(shí)踐來改變或降低給藥的量和/或頻率。6. 10組合療法下文描述組合方法，其中可利用本發(fā)明的抗VEGF抗體。本發(fā)明的組合方法涉及投予患者至少兩種藥劑，第一藥劑為本發(fā)明的抗VEGF抗體，且第二藥劑為組合治療劑?？?VEGF抗體與組合治療劑可同時、依序或分開投予。本發(fā)明的組合治療方法可產(chǎn)生比加性效應(yīng)(additive effect)大的效應(yīng)，從而提供治療益處，其中抗VEGF抗體和組合治療劑都不以單獨(dú)治療有效的量投予。在本發(fā)明方法中，本發(fā)明的抗VEGF抗體和組合治療劑可并行(同時或相繼)投予。如本文中所用，如果本發(fā)明的抗VEGF抗體和組合治療劑在同一天(例如在同一患者就診期間)投予患者，就認(rèn)為其為相繼投予。相繼投藥可相隔1、2、3、4、5、6、7或8小時發(fā)生。 相反，如果本發(fā)明的抗VEGF抗體和組合治療劑在不同日投予患者，例如本發(fā)明的抗VEGF抗體和組合治療劑可按1天、2天或3天、一周、2周或每月的間隔投予，就認(rèn)為其為分開投予。在本發(fā)明的方法中，投予本發(fā)明的抗VEGF抗體可在投予組合治療劑之前或之后進(jìn)行。作為一個非限制性實(shí)例，本發(fā)明的抗VEGF抗體和組合治療劑可并行投予一段時間，隨后為交替投予本發(fā)明的抗VEGF抗體和組合治療劑的第二時間毀。由于投予本發(fā)明的抗VEGF抗體和組合治療劑具有潛在的協(xié)同效應(yīng)，故這些藥劑可以按在單獨(dú)投予所述藥劑中的一者或兩者時不具治療有效性的量投予。在某些方面中，組合治療劑為抗血管生成劑、抗風(fēng)濕藥、消炎劑、化學(xué)治療劑、放射治療、免疫抑制劑或細(xì)胞毒性藥。預(yù)期當(dāng)用于治療各種疾病時，本發(fā)明的抗VEGF抗體可與適用于相同或類似疾病的其它治療劑組合。當(dāng)用于治療癌癥時，本發(fā)明抗體可與常規(guī)癌癥療法(例如手術(shù)、放射療法、化學(xué)療法或其組合)組合使用。在一些其它方面中，可與本發(fā)明抗體一起用于組合腫瘤療法的其它治療劑包括與腫瘤生長有關(guān)的其它因子(例如EGFR、ErbB2 (也稱為Her2)、ErbB3、ErbB4或TNF- α )的拮抗劑，例如抗體。有時，對于治療癌癥和免疫疾病，投予患者一種或一種以上細(xì)胞激素也可能是有益的。在一個優(yōu)選實(shí)施例中，將VEGF抗體與生長抑制劑共投予。生長抑制劑的適合劑量為目前使用的劑量且可能因生長抑制劑與抗VEGF抗體的聯(lián)合作用(協(xié)同作用)而降低。對于治療癌癥、免疫疾病和視網(wǎng)膜疾病，宜將消炎劑與本發(fā)明的抗VEGF抗體組合使用。消炎劑包括(但不限于)對乙酰氨基酚、苯海拉明(diphenhydramine)、哌替啶 (meperidine)、地塞米松(dexamethasone)、頗得斯安(pentasa)、美沙拉嗪(mesalazine)、 安腸克(asacol)、磷酸可待因(codeine phosphate)、貝諾酯(benorylate)、芬布芬 (fenbufen)、萘普生(naprosyn)、雙氯芬酸(diclofenac)、依托度酸(etodolac)以及吲哚美辛(indomethacin)、阿斯匹靈(aspirin)和布洛芬(ibuprofen)。對于治療癌癥，宜將化學(xué)治療劑與本發(fā)明的抗VEGF抗體組合使用?；瘜W(xué)治療劑包括(但不限于)放射性分子、毒素(也稱為細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒性劑，其包括對細(xì)胞活力有害的任何試劑)、含有化學(xué)治療化合物的藥劑以及脂質(zhì)?；蚱渌∨?vesicle)。 適合化學(xué)治療劑的實(shí)例包括(但不限于)1-脫氫睪酮、5-氟尿嘧啶達(dá)卡巴嗪、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、放線菌素D、阿德力霉素(adriamycin)、阿地白介素(aldesleukin), 抗α 5 β 1整合素抗體、烷基化劑、別嘌呤醇鈉(allopurinol sodium)、六甲蜜胺 (altretamine)、氨磷汀(amifostine)、阿那曲唑(anastrozole)、氨茴霉素(AMC))、 抗有絲分裂劑、順-二氯二胺鉬(II) (DDP)順鉬、二氨基二氯鉬(diamino dichloro platinum)、蒽環(huán)霉素、抗生素、抗代謝物、天冬酰胺酶、BCG活體(膀胱內(nèi))、倍他米松磷酸納(betamethasone sodium phosphate)禾口乙酸倍他米豐公、比卡魯胺(bicalutamide)、ifL 酸博萊霉素、白消胺(busulfan)、甲酰四氫葉酸鈣(calcium leucouorin)、卡奇霉素、卡培他濱(capecitabine)、卡鉬(carboplatin)、洛莫斯汀(CCNU)、卡莫司汀(BSNU)、苯丁酸氮芥、順鉬、克拉屈濱(Cladribine)、秋水仙素、結(jié)合雌激素、環(huán)磷酰胺、環(huán)硫磷酰胺、阿糖胞苷、細(xì)胞遲緩素B、環(huán)磷酰胺(Cytoxan)、達(dá)卡巴嗪(Dacartazine)、放線菌素、放線菌素 (dactinomycin,以前稱為放線菌素(actinomycin))、鹽酸佐柔比星、檸檬酸佐柔比星、地尼白介素-毒素連接物(denileukin diftitox)、右雷佐生(Dexrazoxane)、二溴甘露醇、二羥基炭疽菌素二酮、多西他賽(Docetaxel)、甲磺酸多拉司瓊(dolasetron mesylate)、鹽酸多柔比星、屈大麻酚(dronabinol)、大腸桿菌L-天冬酰胺酶、伊洛昔單抗(eolociximab)、吐根素、依泊汀-α (印oetin-α)、伊文氏桿菌屬L-天冬酰胺酶(Erwinia L-asparaginase)、 酯化雌激素、雌二醇、雌莫司汀磷酸鈉、溴化乙錠、乙烯雌二醇(ethinyl estradiol), 依替膦酸鹽(etidronate)、依托泊苷嗜橙菌因子(etoposide citrororum factor)、磷酸依托泊苷、非格司亭(filgrastim)、氟尿苷、氟康唑(fluconazole)、磷酸氟達(dá)拉賓 (fludarabine phosphate)、氟尿嘧啶、氟他胺(f lutamide)、葉酸酸(folinic acid)、鹽酸吉西他濱、糖皮質(zhì)激素、乙酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、短桿菌素D、鹽酸格拉司瓊 (granisetron HCL)、羥基脲、鹽酸黃膽素(idarubicin HCL)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、 干擾素α _2b、鹽酸伊立替康(irinotecan HCL)、來曲唑(letrozole)、甲酰四氫葉酸鈣、 乙酸柳培林(leuprolide acetate)、鹽酸左旋咪唑(levamisole HCL)、利多卡因、洛莫斯汀、美登素生物堿(maytansinoid)、鹽酸氮芥(mechlorethamine HCL)、乙酸甲羥助孕酮(medroxyprogesterone acetate)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、鹽酸美法倉 (melphalan HCL)、硫醇嘌呤(mercaptipurine)、美司鈉(mesna)、甲氨蝶呤、甲基睪固酮、 光神霉素、絲裂霉素C、米托坦(mitotane)、米托蒽醌、尼魯米特(nilutamide)、乙酸奧曲肽 (octreotide acetate)(ondansetron HCL) ,ΧΨ^^Μψ (paclitaxel) >
帕米膦酸二鈉、噴司他丁(pentostatin)、鹽酸毛果蕓香素(pilocarpine HCL)、吡利霉素 (plimycin)、以聚苯丙生20為載體的卡莫司汀植入劑(polif印rosan 20 with carmustine implant)、卟非姆鈉(porfimer sodium)、普魯卡因、鹽酸丙卡巴胼(procarbazine HCL)、普萘洛爾、利妥昔單抗(rituximab)、沙格司亭(sargramostim)、鏈脲佐菌素、 他莫昔芬(tamoxifen)、紫杉醇(taxol)、替尼泊苷(teniposide)、替諾泊苷、睪內(nèi)酯 (testolactone)、四卡因(tetracaine)、噻替派苯丁酸氮芥、硫鳥嘌呤、噻替派、鹽酸拓樸替 (topotecan HCL) ,^fWM^m^^· (toremifene citrate)、￠^ ^ (trastuzumab)、 維甲酸(tretinoin)、戊柔比星(valrubicin)、硫酸長春花堿(vinblastine sulfate)、硫酸長春新堿(vincristine sulfate)花酒石酸長春瑞濱(vinorelbine tartrate)?？膳c本發(fā)明的抗VEGF抗體結(jié)合使用的任何抗血管生成劑包括卡密雷特 (Carmeliet)和杰恩(Jain)，2000，自然，407 :249-257所列舉者。在某些實(shí)施例中，抗血管生成劑為另一 VEGF拮抗劑或VEGF受體拮抗劑，例如VEGF變體、可溶性VEGF受體片段、能夠阻斷VEGF或VEGFR的適體、中和抗VEGFR抗體、低分子量VEGFR酪氨酸激酶抑制劑和其任何組合。或者，或此外，可共投予患者兩種或兩種以上抗VEGF抗體。在某些實(shí)施例中，可將激素療法與本發(fā)明的抗VEGF抗體結(jié)合使用。在一些實(shí)施例中，激素療法包括一種或一種以上可抑制雌激素和/或孕酮以防止促進(jìn)癌細(xì)胞生長的藥劑，例如選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(例如他莫昔芬)、芳香酶抑制劑(例如阿那曲唑 (Arimidex )或來曲唑(費(fèi)瑪拉(Femara)))、芳香酶失活劑(例如依西美坦(exemestane ； Aromasin ))或抑制雌激素產(chǎn)生的藥劑(例如戈舍瑞林(佐拉迪斯(Zoladex)))。在其它實(shí)施例中，激素療法是一種或一種以上可抑制自卵巢產(chǎn)生激素的藥劑。在一些方面中，抗VEGF抗體可與小分子蛋白質(zhì)酪氨酸激酶(PTK)抑制劑結(jié)合使用。在一些實(shí)施例中，PTK抑制劑對VEGF受體酪氨酸激酶具有特異性。在其它實(shí)施例中，PTK 抑制劑結(jié)合于酪氨酸激酶的VEGF受體家族中的一個以上成員(例如VEGFR-1、VEGFR-2)。在其它實(shí)施例中，適用于本發(fā)明的組合物和方法中的蛋白質(zhì)酪氨酸激酶抑制劑包括PTK抑制劑，其不以選擇性方式結(jié)合于VEGF家族的受體酪氨酸激酶，而是也結(jié)合于其它蛋白質(zhì)家族(例如HER2、HER3、HER4、PDGFR和/或Raf)的酪氨酸激酶域。在一些實(shí)施例中，酪氨酸激酶是受體酪氨酸激酶，即，是具有細(xì)胞外配體結(jié)合域且可由一個或一個以上配體的結(jié)合而活化的較大蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)域。在某些實(shí)施例中，蛋白質(zhì)酪氨酸激酶為非受體酪氨酸激酶?？捎糜诒景l(fā)明方法中的PTK抑制劑包括(但不限于)吉非替尼(gefitinib) (ZD-1839，Iressa )、埃羅替尼(erlotinib) (0SI-1774, Tarceva )、卡奈替尼(canertinib) (CI-1033)、凡德他尼(vandetanib) (ZD6474, Zactima )、酪氨酸磷酸化抑制劑(tyrphostin) AG-825 (CAS 149092-50-2)、 拉帕替尼(Iapatinib) (Gff-572016)、索拉非尼(sorafenib) (BAY43-9006)、AG-494(CAS 133550-35-3)、RG-13022(CAS 149286-90-8)、RG_14620(CAS 136831-49-7),BIBff 2992(托沃克(Tovok))、酪氨酸磷酸化抑制劑9 (CAS 136831-49-7)、酪氨酸磷酸化抑制劑23 (CAS 118409-57-7)、酪氨酸磷酸化抑制劑25 (CAS 118409-58-8)、酪氨酸磷酸化抑制劑46 (CAS 122520-85-8)、酪氨酸磷酸化抑制劑47 (CAS 122520-86-9)、酪氨酸磷酸化抑制劑53 (CAS 122520-90-5),紫鉚花素(butein) (1-(2,4- 二羥苯基)-3-(3,4- 二羥苯基)_2_ 丙烯-1-酮 2' ,3,4,4'-四羥查酮；CAS 487-52-5)、姜黃素(curcumin) ((E，E)-l，7-雙 (4-羥基-3-甲氧苯基)-1，6_ 庚二烯-3，5-二酮；CAS 458-37-7)、N4-(1-芐基-IH-吲唑-5-基)-N6，N6- 二甲基-吡啶并-[3，4-d]-嘧啶-4，6- 二胺(202272-68-2)、AG_1478、 AG-879、環(huán)丙烷甲酸-(3-(6-(3-三氟甲基-苯氨基)-嘧啶-4-基氨基)-苯基)-酰胺 (CAS 879127-07-8)、呢-(3-氯-4-氟苯基)-擬-(1-甲基哌啶-4-基)-嘧啶并[5，4_d]嘧啶-2，8-二胺二鹽酸鹽(CAS 196612-93-8)、4_ (4-芐氧苯胺基)-6，7-二甲氧喹唑啉(CAS 179248-61-4)、N-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)吡啶并[3，4_d]嘧啶-6-基)2- 丁酰胺 (CAS 881001-19-0)、EKB-569、HKI-272 和 HKI-357。在一個特定實(shí)施例中，本發(fā)明的抗VEGF抗體與基于5-氟尿嘧啶的靜脈內(nèi)化學(xué)療法組合使用。此組合特別適用于結(jié)腸或直腸轉(zhuǎn)移癌患者的第一線或第二線治療。在另一特定實(shí)施例中，本發(fā)明的抗VEGF抗體與卡鉬和太平洋紫杉醇組合使用。此組合特別適用于患有不可切除、局部晚期、復(fù)發(fā)性或轉(zhuǎn)移性非鱗狀非小細(xì)胞肺癌的患者的第一線治療。在另一特定實(shí)施例中，本發(fā)明的抗VEGF抗體與太平洋紫杉醇組合使用。此組合特別適用于治療尚未接受針對轉(zhuǎn)移性HER2陰性乳癌的化學(xué)療法的患者。對于治療視網(wǎng)膜疾病，本發(fā)明的抗VEGF抗體可與以下組合使用E10030，一種抗血小板源性生長因子(PDGF)聚乙二醇化適體；ARC1905，一種靶向補(bǔ)體級聯(lián)的C5組分的聚乙二醇化適體；和伏洛昔單抗(volociximab)，一種靶向α 5 β 1整合素跨膜受體的單克隆抗體；用Visudyne 的光動力學(xué)療法(PDT)；或Macugen —種適體(哌加他尼鈉 (pegaptanib sodium))。6. 11治療方案本發(fā)明提供包括投予本發(fā)明的抗VEGF抗體的治療方案。治療方案將視患者的年齡、體重和疾病狀況而變化。治療方案可持續(xù)2周到無限期。在特定實(shí)施例中，治療方案持續(xù)2周到6個月、3個月到5年、6個月到1或2年、8個月到18個月等。治療方案可為不變
38劑量方案或多變劑量方案。對于下述劑量例示性方案，抗VEGF抗體可以適于皮下投藥的無菌、不含防腐劑溶液形式投予。對于治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌，本發(fā)明的抗VEGF抗體以每2周0. 5mg/kg到15mg/kg 的劑量與團(tuán)注IFL (伊立替康、5-氟尿嘧啶和甲酰四氫葉酸方案)一起經(jīng)靜脈內(nèi)投予。在特定實(shí)施例中，在團(tuán)注IFL存在下，所述劑量為每兩周lmg/kg到％ig/kg、2mg/kg到6mg/kg、 0. 5mg/kg 至Ij 3mg/kg、lmg/kg 至Ij 10mg/kg、3mg/kg 至Ij 4. 8mg/kg 或 lmg/kg 至Ij 4. 5mg/kg。在治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌的另一實(shí)施例中，本發(fā)明的抗VEGF抗體以每2周lmg/ kg到30mg/kg的劑量與F0LF0X4(奧沙利鉬(oxaliplatin)、甲酰四氫葉酸和氟尿嘧啶方案)一起經(jīng)靜脈內(nèi)投予。在特定實(shí)施例中，在F0LF0X4存在下，所述劑量為每兩周ang/kg 至Ij 9mg/kg、3mg/kg 至Ij 12mg/kg、lmg/kg 至Ij 7. 5mg/kg、2mg/kg 至Ij 20mg/kg、6mg/kg 至Ij 9. 75mg/ kg 或 4mg/kg 至Ij 9. 5mg/kg。對于治療非鱗狀非小細(xì)胞肺癌，本發(fā)明的抗VEGF抗體以每三周ang/kg到40mg/ kg的劑量與卡鉬/太平洋紫杉醇一起經(jīng)靜脈內(nèi)投予。在特定實(shí)施例中，在卡鉬/太平洋紫杉醇存在下，所述劑量為每三周5mg/kg到Hmg/kgdmg/kg到20mg/kg、10mg/kg到17. 5mg/ kg、7mg/kg 至Ij 14mg/kg、10mg/kg 至Ij 30mg/kg 或 3mg/kg 至Ij 30mg/kg。對于治療轉(zhuǎn)移性乳癌，本發(fā)明的抗VEGF抗體以每兩周0. 5mg/kg到20mg/kg的劑量與太平洋紫杉醇一起經(jīng)靜脈內(nèi)投予。在特定實(shí)施例中，與太平洋紫杉醇存在下，所述劑量為每兩周 lmg/kg 到 4mg/kg、ang/kg 到 6mg/kg、0. 5mg/kg 到 3mg/kg、lmg/kg 到 10mg/kg、 3mg/kg 至Ij 4. 8mg/kg 或 lmg/kg 至Ij 4. 5mg/kg。對于治療轉(zhuǎn)移性乳癌，本發(fā)明的抗VEGF抗體作為單藥療法以每兩周0. 5mg/kg到 20mg/kg的劑量經(jīng)靜脈內(nèi)投予。在特定實(shí)施例中，作為單藥療法，所述劑量為每兩周lmg/kg 至Ij 4mg/kg、2mg/kg 至Ij 6mg/kg、0. 5mg/kg 至Ij 3mg/kg、lmg/kg 至Ij 10mg/kg、3mg/kg 至Ij 4. 8mg/kg 或 lmg/kg 至Ij 4. 5mg/kg。對于治療年齡相關(guān)性黃斑部變性(AMD)，一月(約觀天)一次以0. Img到Img的劑量通過玻璃體內(nèi)注射來投予本發(fā)明的抗VEGF抗體。在特定實(shí)施例中，一月(約觀天)一次通過玻璃體內(nèi)注射投予的劑量為0. Img到0. 4mg、0. 2mg到0. 6mg、0. Img到0. 25mg、0. 25mg 到0. 5mg、0. 25mg到0. 75mg或0. 3mg到0. 45mg。在一個特定實(shí)施例中，用本發(fā)明的抗VEGF 抗體治療的患者患有濕性AMD。在另一特定實(shí)施例中，患者患有干性AMD。6. 12診斷和醫(yī)藥試劑盒本發(fā)明涵蓋含有本發(fā)明的抗VEGF抗體(包括抗體結(jié)合物)的醫(yī)藥試劑盒。醫(yī)藥試劑盒是包含本發(fā)明的抗VEGF抗體(例如呈凍干形式或呈水溶液形式)和一種或一種以上以下物質(zhì)的包裝 組合治療劑，例如上文第6. 10節(jié)中所述； 用于投予抗VEGF抗體的裝置，例如筆、針和/或注射器；及 當(dāng)抗體呈凍干形式時用于再懸浮抗體的醫(yī)藥級水或緩沖液。在某些方面中，各單位劑量的抗VEGF抗體是分開包裝，且試劑盒可含有一個或一個以上單位劑量(例如兩個單位劑量、三個單位劑量、四個單位劑量、五個單位劑量、八個單位劑量、十個單位劑量，或更多個單位劑量)。在一個特定實(shí)施例中，將一個或一個以上單位劑量各自安置于注射器或筆中。本文也涵蓋含有本發(fā)明的抗VEGF抗體(包括抗體結(jié)合物)的診斷試劑盒。診斷試劑盒是一種包含本發(fā)明的抗VEGF抗體(例如呈凍干形式或呈水溶液形式)和一種或一種以上適用于進(jìn)行診斷分析的試劑的包裝。當(dāng)抗VEGF抗體用酶標(biāo)記時，試劑盒可包括所述酶所需的底物和輔因子(例如提供可檢測發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)的底物前體)。此外，還可包括其它添加劑，例如穩(wěn)定劑、緩沖劑(例如阻斷緩沖劑或溶解緩沖劑)等。在某些實(shí)施例中，診斷試劑盒中所包括的抗VEGF抗體固定于固體表面上，或在試劑盒中包括上面可固定抗體的固體表面(例如載片)?？纱蠓淖兏鞣N試劑的相對量以提供實(shí)質(zhì)上使分析敏感度最佳的試劑溶液的濃度。在一個特定實(shí)施例中，抗體和一種或一種以上試劑可以干粉(通常經(jīng)凍干)的形式提供(以個別方式或以組合方式)，所述干粉包括在溶解時將提供具有適當(dāng)濃度的試劑溶液的賦形劑。7.實(shí)例1 貝伐單抗的T細(xì)胞表位的鑒別7. 1材料和方法7. 1. 1 肽使用多針(multi-pin)形式由模擬抗原表位(Mimotope)(澳大利亞阿德萊德 (Adelaide,Australia))合成肽。合成貝伐單抗輕鏈和重鏈V區(qū)的序列，其呈有12個氨基酸重疊的15肽形式(表3和4)，總計為69種肽。將肽凍干并以約lmg/mL到2mg/mL再懸浮于DMSO(西格瑪-阿爾德里奇公司(Sigma-Aldrich))中。儲備肽于_20°C下冷凍保存。7. 1. 2人類末梢血液單核細(xì)胞社區(qū)供體白細(xì)胞層產(chǎn)品(Community donor buffy coat product)購自斯坦福血液中心(Stanford Blood Center)(加利福尼亞州圣克拉拉(Palo Alto, CA)) 用不含鈣或鎂的DPBS按1 1體積比稀釋白細(xì)胞層物質(zhì)。用12.5ml的菲科爾帕克-PLUS(FicollPaque-PLUQ (GE醫(yī)療集團(tuán)(GE Healthcare))使稀釋的白細(xì)胞層物質(zhì) (25ml到35ml)處于50ml錐形離心管(沙斯特(Sarsted)或科斯塔(Costar)離心管)的下層。在室溫下以900g將樣本離心30分鐘。從界面收集末梢血液單核細(xì)胞(PBMC)。添加 DPBS以使最終體積達(dá)到50ml，并以350g將細(xì)胞離心5分鐘。將聚結(jié)成團(tuán)的細(xì)胞再懸浮于 DPBS中并計數(shù)。7. 1. 3樹突狀細(xì)胞為了分離樹突狀細(xì)胞，用含IO8個新鮮分離的PBMC的AIM V培養(yǎng)基(英杰公司 (Invitrogen))(總體積為30ml)接種T75培養(yǎng)瓶(科斯塔(Costar))。在_80°C下，將過量 PBMC按5X IO7個細(xì)胞/毫升于90%胎牛血清(FCS)、10% DMSO中冷凍。在37°C下于5% CO2中培育T75培養(yǎng)瓶2小時。移除非粘著細(xì)胞，并用DPBS洗滌粘著單層細(xì)胞。為了使單核細(xì)胞分化成樹突狀細(xì)胞，添加30ml含有800個單位/毫升GM-CSF (R&D系統(tǒng)公司(R and D Systems))和500個單位/毫升IL-4 (R&D系統(tǒng)公司)的AIM V培養(yǎng)基。將培養(yǎng)瓶培育5 天。在第5天添加IL-I α (英多杰公司(Endogen))和TNFa (英多杰公司)達(dá)到50pg/mL 和0. 2ng/mL。再將培養(yǎng)瓶培育兩天。在第7天，通過添加3ml含有0. 5mg到1. Omg絲裂霉素C (西格瑪-阿爾德里奇公司)的IOOmM EDTA達(dá)到IOmM EDTA以及16. 5 μ g/mL到33 μ g/ mL絲裂霉素C的最終濃度來收集樹突狀細(xì)胞。在37°C和5% CO2下再培育培養(yǎng)瓶1小時。 收集樹突狀細(xì)胞，并用AIM V培養(yǎng)基洗滌2到3次。
7. 1. 4細(xì)胞培養(yǎng)在第7天，在37°C水浴中迅速解凍先前冷凍的自體PBMC。立即將細(xì)胞稀釋于DPBS 或AIM V培養(yǎng)基中，并以350g離心5分鐘。使用磁珠(Easy-kp⑶4+試劑盒，干細(xì)胞技術(shù)公司(Stem Cell Technologies))通過陰性選擇來富集CD4+細(xì)胞。在96孔圓底培養(yǎng)盤(科斯塔9077)中以每孔每2 X IO4個樹突狀細(xì)胞對應(yīng)2 X IO5個CD4+ T細(xì)胞來共培養(yǎng)自體CD4+T 細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。以約5yg/mL添加肽。對照孔僅含有DMSO(西格瑪公司(Sigma))媒齊IJ (0. 25% ν ν)。陽性對照孔含有0. 25%的DMSO和1 μ g/mL的破傷風(fēng)類毒素(李斯特生物公司(List Biologicals)或卡爾生物化學(xué)公司(CalBioChem))。將培養(yǎng)物培育5天。 在第5天，每孔添加0. 25 μ Ci的氚化胸腺嘧啶(安瑪西亞公司(Amersham)或GE醫(yī)療集團(tuán))。在第6天，使用帕卡德費(fèi)特美O^ckard Filtermate)細(xì)胞收集器將培養(yǎng)物收集到過濾墊(filtermat)。使用沃拉克麥克貝塔1450型(Wallac MicroBeta 1450)閃爍計數(shù)器 (珀金埃爾默公司(Perkin Elmer))進(jìn)行閃爍計數(shù)。7. 1. 5數(shù)據(jù)分析通過對6到12個重復(fù)實(shí)驗(yàn)的個別結(jié)果求平均值來計算平均背景CPM值。對四個陽性對照孔的CPM值求平均值。對各肽的重復(fù)實(shí)驗(yàn)孔或三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)孔求平均值。通過用平均對照值除平均實(shí)驗(yàn)CPM值來計算陽性對照孔和肽孔的刺激指數(shù)值。為了能被納入數(shù)據(jù)集中，需要破傷風(fēng)類毒素陽性對照孔的刺激指數(shù)大于3.0。記錄產(chǎn)生2. 95或2. 95以上的刺激指數(shù)的任何肽的反應(yīng)。使用來自一組99個供體的末梢血液樣本來測試肽。匯集對所有肽的反應(yīng)。對于所測試的每一肽，計算在2. 95或2. 95以上的刺激指數(shù)下起反應(yīng)的供體集合(donor set)所占的百分比。此外，也計算所有供體的平均刺激指數(shù)。7.2 結(jié)果7. 2. 1貝伐單抗VH和VL區(qū)中⑶4+ T細(xì)胞表位的鑒別通過分析在具有99個供體的組內(nèi)對肽的反應(yīng)百分比來鑒別⑶4+T細(xì)胞表位肽。計算所測試的描述貝伐單抗重鏈和輕鏈V區(qū)的所有肽的平均反應(yīng)百分比和標(biāo)準(zhǔn)偏差。大于或等于平均背景反應(yīng)加上3個標(biāo)準(zhǔn)偏差的反應(yīng)率被視為潛在CD4+T細(xì)胞表位。對于貝伐單抗輕鏈V區(qū)，測試32種肽(表3)，所得平均背景反應(yīng)百分比為2. 1 士 2. 7%。背景以上的3個標(biāo)準(zhǔn)偏差經(jīng)測定為10. 2%。在貝伐單抗輕鏈肽數(shù)據(jù)集中，一種在位置13處的肽OHO-TM) 展現(xiàn)此種程度的反應(yīng)，且反應(yīng)率為15.2% (圖2A)。對于貝伐單抗重鏈V區(qū)，測試37種肽 (表4)。平均背景反應(yīng)百分比為2. 8士3.1%。背景以上的3個標(biāo)準(zhǔn)偏差為12.1%。在貝伐單抗重鏈數(shù)據(jù)集內(nèi)的一種肽#18(N52-R56)達(dá)到16. 2 %的反應(yīng)百分比(圖3A)。重鏈數(shù)據(jù)集中在位置#30處的第二肽達(dá)到9. 的反應(yīng)率，且因刺激指數(shù)增加而被視為表位(參見下文)。計算數(shù)據(jù)集中所有肽的平均刺激指數(shù)。輕鏈肽13具有高平均刺激指數(shù)，即 1. 82 士0. 24s. e. m.(圖 2B)。重鏈肽 #18 的平均刺激指數(shù)值為 2. 16 士0. 35s. e. m.(圖 3B)。 位置#30處的肽由于平均刺激指數(shù)升高和反應(yīng)率在平均值以上而返回1. 45+0. 18s. e. m.的平均刺激指數(shù)(圖3B)。當(dāng)測定所述抗體V區(qū)的CD4+T細(xì)胞表位含量時包括位置#30處的肽。所有這些刺激指數(shù)值都顯著高于兩個數(shù)據(jù)集中所有肽的平均刺激指數(shù)(全部69種重鏈和輕鏈肽的平均刺激指數(shù)為1. 14士0. 07)。這些數(shù)據(jù)表明在貝伐單抗V區(qū)中有三個⑶4+T細(xì)胞表位區(qū)(表幻。在VL區(qū)中，在肽位置13處發(fā)現(xiàn)一個表位，其涵蓋框架2和來自⑶R2的兩個氨基酸。序列含有在人源化期間插入所述序列中的鼠類回復(fù)突變(V46)。在表5中，源自CDR的氨基酸加有下劃線。 在重鏈中，標(biāo)識出兩個表位肽區(qū)。在位置#18處的較強(qiáng)表位涵蓋所有⑶R2。第二表位肽區(qū)含有框架3和⑶R3氨基酸。7.2.2貝伐單抗變體抗體的免疫原性降低的變體對貝伐單抗進(jìn)行突變分析(參見下文實(shí)例2)。根據(jù)結(jié)合突變分析進(jìn)行的抗原結(jié)合研究，鑒別出CDR-H2和CDR-H3區(qū)內(nèi)不會顯著降低抗體對VEGF的親和力的一組候選氨基酸取代(表6)。這些氨基酸取代經(jīng)單獨(dú)和組合測試以鑒別免疫原性相比野生型抗體有所降低的貝伐單抗變體。8. ^#11 2 對VEGF的親和力:t曾加的貝伐單杭奪體的鑒另！丨對貝伐單抗抗體進(jìn)行綜合性突變分析以鑒別對VEGF的親和力相比貝伐單抗有所增加的突變體。通過BIAcore對候選高親和力突變體進(jìn)行分析以證實(shí)其結(jié)合特征對VEGF 的親和力相比貝伐單抗有所增加。8. 1材料和方法8. 1. 1 BIAcore將十五個變異貝伐單抗VH區(qū)構(gòu)建體連同未經(jīng)修飾的VL區(qū)一起克隆到含有人類 IgG1的質(zhì)粒中，通過短暫轉(zhuǎn)染使其在293T/17細(xì)胞系中表達(dá)，并通過蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G親和力法來純化抗體。通過使用BIAcore 2000和3000表面等離子共振系統(tǒng)(BIAcore ；GE 醫(yī)療集團(tuán)，新澤西州皮斯卡塔韋(PisCataway，NJ))來測定抗體對VEGF (R&D系統(tǒng)公司(R&D systems)，明尼蘇達(dá)州明尼阿波利斯(MirmeapolisMN))的親和力。首先使用標(biāo)準(zhǔn)BIAcore 胺偶合試劑(N-乙基-N' -二甲氨基-丙基碳化二亞胺，EDC ；N-羥基丁二酰亞胺，NHS ； 和鹽酸乙醇胺，pH值8. 將多克隆山羊抗人類Fc抗體(杰克森免疫研究公司(Jackson Immunoresearch))固定到生物傳感器表面，隨后在平行表面上以5 μ L/min的低流速捕捉抗VEGF抗體(貝伐單抗和貝伐單抗變體)。保持較低的RL以使由VEGF的二聚性質(zhì)引起的親合力(avidity)減到最小。未在參考表面上進(jìn)行抗體捕捉以充當(dāng)陰性對照。隨后，以 50 μ L/min的流速在兩分鐘內(nèi)將VEGF注射到所有流槽中以監(jiān)測締合，隨后為持續(xù)25分鐘的流過 HBS-P 操作緩沖液(running buffer) (IOmM HEPES、150mM 氯化鈉、0. 005% P_20，pH 值 7.4)以監(jiān)測解離階段。在每一循環(huán)中，將VEGF以范圍介于OnM與512nM之間且以四倍增量變化的6種不同的VEGF濃度注射于表面上。在每一循環(huán)結(jié)束時，以兩個短暫脈沖用1. 5% H3PO4在100 μ L/min流速下使表面再生。將結(jié)合數(shù)據(jù)擬合到1 1朗繆爾模型(Langmuir model)以由BIAevaluate軟件求出結(jié)合常數(shù)。在各分析中應(yīng)用雙重參考以消除參考表面和僅含緩沖液的對照組的背景反應(yīng)。分析至少三次獨(dú)立測定的所有結(jié)合動力學(xué)數(shù)據(jù)。8.2 結(jié)果結(jié)果呈現(xiàn)為絕對數(shù)以及優(yōu)于野生型的改良倍數(shù)。幾乎所有列出的變體當(dāng)與貝伐單抗或野生型相比較時都具有改良的締合(k。n)和解離(k。ff)速率(表7)。變體的最終親和力值在0. InM范圍內(nèi)且對應(yīng)于SEQ ID NO 82的變體達(dá)到低至0. 08nM的值。這些值與在這些實(shí)驗(yàn)中所測得的親和力為1. 9nM的貝伐單抗形成對比。表8和表9展示初步結(jié)合研究顯示對VEGF的親和力高于貝伐單抗(數(shù)據(jù)未示) 的其它重鏈變體。表10展示初步研究指示對VEGF的親和力類似于貝伐單抗(數(shù)據(jù)未示)的重鏈變體。表11展示初步研究指示對VEGF的親和力類似于貝伐單抗(數(shù)據(jù)未示)的輕鏈變體。9.實(shí)例3 脫免疫的變體肽的詵擇產(chǎn)生對應(yīng)于貝伐單抗的免疫原性區(qū)域(參見實(shí)例1)的變體肽(表14到16)。根據(jù)實(shí)例2中描述的綜合性突變分析來選擇變體肽，其中鑒別出不會實(shí)質(zhì)上降低貝伐單抗對 VEGF的結(jié)合親和力的⑶R修飾?？偣埠铣?7種肽，并根據(jù)抗原結(jié)合研究加以測試，包括各親本15肽的兩種合成法。利用第7. 1節(jié)中描述的方法用親本肽和變體肽測試總共93個供體且結(jié)果展示于圖4A 到圖4C中。具體說來，圖4A到圖4C展示對突變貝伐單抗表位肽的CD4+T細(xì)胞反應(yīng)。用空心標(biāo)記指示對未經(jīng)修飾的親本表位序列的平均反應(yīng)。大圓形指示表17 (參見下文)中提到的所選肽。圖4A展示VH⑶R2肽；圖4B展示VH⑶R3肽；且圖4C展示VIXDR2肽。所選肽的免疫原性數(shù)據(jù)展示于表17中。對于重鏈可變區(qū)⑶R2肽，在此研究中對親本肽的平均反應(yīng)百分比為5. 38%和 6. 45%。三種突變肽展示與親本肽相比較，總反應(yīng)率和平均刺激指數(shù)降低。重鏈可變區(qū)⑶R3表位肽的親本肽反應(yīng)率在此研究中為7. 53%和6. 45%。發(fā)現(xiàn)了展示比親本肽低的總反應(yīng)的單突變肽序列。最后，輕鏈可變區(qū)⑶R2肽親本反應(yīng)率在此研究中為25. 8%和15%。鑒別出一種展示比親本肽低的總免疫原性的突變肽。為了證實(shí)脫免疫突變與貝伐單抗相比較維持對VEGF的親和力，使用流式細(xì)胞測量術(shù)來比較在經(jīng)修飾的表位肽中并有突變的變體抗體(呈單氨基酸或雙氨基酸修飾形式) 與貝伐單抗的結(jié)合性質(zhì)。幾種脫免疫突變對VEGF的親和力與貝伐單抗相當(dāng)或有所增加。在一項(xiàng)研究中，用3nM結(jié)合有Alexa647的rHuVEGF(英杰公司目錄號PHG0143) 和以1 400稀釋的山羊抗人類KRPE(南方生物技術(shù)公司(Southern Biotech)目錄號 2063-09)對表達(dá)表面結(jié)合形式的貝伐單抗變體的經(jīng)短暫轉(zhuǎn)染的細(xì)胞染色。通過流式細(xì)胞測量術(shù)使用達(dá)科賽脫美(DakoCytomatiorOCyAn ADP流式細(xì)胞儀來采集數(shù)據(jù)，并使用 Treestar' s FloJo分析程式加以分析。此研究中測量的平均熒光強(qiáng)度(MFI)列于表18 中。在另一研究中，測量貝伐單抗和變體抗體與VEGF結(jié)合的EC5tlt5使用貝伐單抗和其變體以及如上所述結(jié)合有Alexas647的rHu VEGF來產(chǎn)生抗體滴定曲線，其中VEGF自5μΜ 經(jīng)兩倍連續(xù)稀釋達(dá)到0. 01 μ M。EC50值展示于表19中。10.特定實(shí)施例、參考文獻(xiàn)的引用本申請案中引用的所有出版物、專利、專利申請案和其它文獻(xiàn)都以全文引用的方式并入本文中用于所有目的，引用的程度就如同已個別地指示將各個別出版物、專利、專利申請案或其它文獻(xiàn)以引用的方式并入用于所有目的一般。盡管已經(jīng)說明和描述各種特定實(shí)施例，但應(yīng)了解可在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下進(jìn)行各種改變。
權(quán)利要求
1.一種抗VEGF抗體或一種抗體的抗VEGF結(jié)合片段，其包含具有對應(yīng)于SEQ ID NO 3 (CDR-Hl)、SEQ ID NO 4 (CDR-H2)、SEQ ID NO 5 (CDR-H3)、SEQ ID NO 6 (CDR-Ll)、SEQ ID NO :7(CDR-L2)和SEQ ID NO :8(CDR-L3)的氨基酸序列的CDR，其中CDR-H2包括取代K64S和任選存在的一個或一個以上額外突變或突變的組合，所述突變選自表6、7、8、9、10、11、12-1 到12-9或13到16中的一者或一者以上，其中與抗體貝伐單抗(bevacizumab)或抗體蘭尼單抗(ranibizumab)的⑶R序列相比較，所述六個⑶R總共具有至多17個氨基酸取代。
2.一種抗VEGF抗體或一種抗體的抗VEGF結(jié)合片段，其包含具有對應(yīng)于SEQ ID NO 3 (CDR-Hl)、SEQ ID NO 4 (CDR-H2)、SEQ ID NO 5 (CDR-H3)、SEQ ID NO 6 (CDR-Ll)、SEQ ID NO J(CDR-U)和SEQ ID NO :8 (CDR-U)的氨基酸序列的CDR，其中CDR-H2包括取代K64Q和任選存在的一個或一個以上額外突變或突變的組合，所述突變選自表6、7、8、9、10、11、12-1 到12-9或13到16中的一者或一者以上，其中與抗體貝伐單抗或抗體蘭尼單抗的CDR序列相比較，所述六個CDR總共具有至多17個氨基酸取代。
3.一種抗VEGF抗體或一種抗體的抗VEGF結(jié)合片段，其包含具有對應(yīng)于SEQ ID NO 3 (CDR-Hl)、SEQ ID NO 4 (CDR-H2)、SEQ ID NO 5 (CDR-H3)、SEQ ID NO 6 (CDR-Ll)、SEQ ID NO J(CDR-U)和SEQ ID NO :8(CDR_L3)的氨基酸序列的CDR，其中CDR-H2包括取代TO3F 和K64Q，以及任選存在的一個或一個以上額外突變或突變的組合，所述突變選自表6、7、8、 9、10、11、12-1到12-9或13到16中的一者或一者以上，其中與抗體貝伐單抗或抗體蘭尼單抗的CDR序列相比較，所述六個CDR總共具有至多17個氨基酸取代。
4.一種抗VEGF抗體或一種抗體的抗VEGF結(jié)合片段，其包含具有對應(yīng)于SEQ ID NO 3 (CDR-Hl)、SEQ ID NO 4 (CDR-H2)、SEQ ID NO 5 (CDR-H3)、SEQ ID NO 6(CDR-Ll)、SEQ ID NOJ(CDR-U)和SEQ ID N0:8(CDR_L3)的氨基酸序列的CDR，其中CDR-H3包括取代H97E 和Y98F，以及任選存在的一個或一個以上額外突變或突變的組合，所述突變選自表6、7、8、 9、10、11、12-1到12-9或13到16中的一者或一者以上，其中與抗體貝伐單抗或抗體蘭尼單抗的CDR序列相比較，所述六個CDR總共具有至多17個氨基酸取代。
5.一種抗VEGF抗體或一種抗體的抗VEGF結(jié)合片段，其包含具有對應(yīng)于SEQ ID NO 3 (CDR-Hl)、SEQ ID NO 4 (CDR-H2)、SEQ ID NO 5 (CDR-H3)、SEQ ID NO 6 (CDR-Ll)、SEQ ID NO 7 (⑶R-U)和SEQ ID NO J(OTR-U)的氨基酸序列的⑶R，其中⑶R-L2包括取代T51A和任選存在的一個或一個以上額外突變或突變的組合，所述突變選自表6、7、8、9、10、11、12-1 到12-9或13到16中的一者或一者以上，其中與抗體貝伐單抗或抗體蘭尼單抗的CDR序列相比較，所述六個CDR總共具有至多17個氨基酸取代，且其中所述VEGF抗體中的CDR-L2 不由表13中所示的⑶R-L2序列組成。
6.一種抗VEGF抗體或一種抗體的抗VEGF結(jié)合片段，其包含具有對應(yīng)于SEQ ID NO 3 (CDR-Hl)、SEQ ID NO 4 (CDR-H2)、SEQ ID NO 5 (CDR-H3)、SEQ ID NO 6 (CDR-Ll)、SEQ ID N0:7(CDR-L2)和SEQ ID N0:8(CDR_L3)的氨基酸序列的六個互補(bǔ)決定區(qū)(“CDR”)，其中所述⑶R-Hl包括取代N31F和任選存在的一個或一個以上額外突變或突變的組合，所述突變選自表6、7、8、9、10、11、12-1到12_9和13中的一者或一者以上，其中與抗體貝伐單抗或抗體蘭尼單抗的CDR序列相比較，所述六個CDR總共具有至多17個氨基酸取代，且其中所述VEGF抗體中的⑶R-Hl不由表12-1到12_9中所示的⑶R-Hl序列組成。
7.一種抗VEGF抗體或一種抗體的抗VEGF結(jié)合片段，其包含具有對應(yīng)于SEQ ID NO -3 (CDR-Hl)、SEQ ID NO 4 (CDR-H2)、SEQ ID NO 5 (CDR-H3)、SEQ ID NO 6 (CDR-Ll)、SEQ ID NO 7 (⑶R-U)和SEQ ID NO 8 (⑶R-L3)的氨基酸序列的六個⑶R，其中所述⑶R-H3包括取代H97E和任選存在的一個或一個以上額外突變或突變的組合，所述突變選自表6、7、8、 9、10、11、12-1到12-9和13中的一者或一者以上，其中與抗體貝伐單抗或抗體蘭尼單抗的 CDR序列相比較，所述六個CDR總共具有至多17個氨基酸取代，且其中所述VEGF抗體中的 ⑶R-H3不由表12-1到12-9中所示的⑶R-H3序列組成。
8.一種抗VEGF抗體或一種抗體的抗VEGF結(jié)合片段，其包含具有對應(yīng)于SEQ ID NO 3 (CDR-Hl)、SEQ ID NO 4 (CDR-H2)、SEQ ID NO 5 (CDR-H3)、SEQ ID NO 6 (CDR-Ll)、SEQ ID NO 7 (⑶R-U)和SEQ ID NO 8 (⑶R-L3)的氨基酸序列的六個⑶R，其中所述⑶R-H3包括取代H97D和任選存在的一個或一個以上額外突變或突變的組合，所述突變選自表6、7、8、 9、10、11、12-1到12-9和13中的一者或一者以上，其中與抗體貝伐單抗或抗體蘭尼單抗的 CDR序列相比較，所述六個CDR總共具有至多17個氨基酸取代，且其中所述VEGF抗體中的 ⑶R-H3不由表12-1到12-9中所示的⑶R-H3序列組成。
9.一種抗VEGF抗體或一種抗體的抗VEGF結(jié)合片段，其包含具有對應(yīng)于SEQ ID NO 3 (CDR-Hl)、SEQ ID NO 4 (CDR-H2)、SEQ ID NO 5 (CDR-H3)、SEQ ID NO 6 (CDR-Ll)、SEQ ID NO 7 (⑶R-U)和SEQ ID NO 8 (⑶R-L3)的氨基酸序列的六個⑶R，其中所述⑶R-H3包括取代H97P和任選存在的一個或一個以上額外突變或突變的組合，所述突變選自表6、7、8、 9、10、11、12-1到12-9和13中的一者或一者以上，其中與抗體貝伐單抗或抗體蘭尼單抗的 CDR序列相比較，所述六個CDR總共具有至多17個氨基酸取代，且其中所述VEGF抗體中的 ⑶R-H3不由表12-1到12-9中所示的⑶R-H3序列組成。
10.一種抗VEGF抗體或一種抗體的抗VEGF結(jié)合片段，其包含具有對應(yīng)于SEQ ID NO 3 (CDR-Hl)、SEQ ID NO 4 (CDR-H2)、SEQ ID NO 5 (CDR-H3)、SEQ ID NO 6 (CDR-Ll)、SEQ ID NO 7 (⑶R-U)和SEQ ID NO 8 (⑶R-L3)的氨基酸序列的六個⑶R，其中所述⑶R-H3包括取代Y99E和任選存在的一個或一個以上額外突變或突變的組合，所述突變選自表6、7、8、 9、10、11、12-1到12-9和13中的一者或一者以上，其中與抗體貝伐單抗或抗體蘭尼單抗的 CDR序列相比較，所述六個CDR總共具有至多17個氨基酸取代，且其中所述VEGF抗體中的 ⑶R-H3不由表12-1到12-9中所示的⑶R-H3序列組成。
11.一種抗VEGF抗體或一種抗體的抗VEGF結(jié)合片段，其包含具有對應(yīng)于SEQ ID NO: 3 (CDR-Hl)、SEQ ID NO 4 (CDR-H2)、SEQ ID NO 5 (CDR-H3)、SEQ ID NO 6 (CDR-Ll)、SEQ ID NO 7 (⑶R-U)和SEQ ID NO 8 (⑶R-L3)的氨基酸序列的六個⑶R，其中所述⑶R-H3包括取代Y99D和任選存在的一個或一個以上額外突變或突變的組合，所述突變選自表6、7、8、 9、10、11、12-1到12-9和13中的一者或一者以上，其中與抗體貝伐單抗或抗體蘭尼單抗的 CDR序列相比較，所述六個CDR總共具有至多17個氨基酸取代，且其中所述VEGF抗體中的 ⑶R-H3不由表12-1到12-9中所示的⑶R-H3序列組成。
12.—種抗VEGF抗體或一種抗體的抗VEGF結(jié)合片段，其包含具有對應(yīng)于SEQ ID NO: 3 (CDR-Hl)、SEQ ID NO 4 (CDR-H2)、SEQ ID NO 5 (CDR-H3)、SEQ ID NO 6 (CDR-Ll)、SEQ ID N0:7(CDR-L2)和SEQ ID NO :8 (CDR-U)的氨基酸序列的六個CDR，其中所述CDR-H3包括取代SlOOaG和任選存在的一個或一個以上額外突變或突變的組合，所述突變選自表6、7、8、 9、10、11、12-1到12-9和13中的一者或一者以上，其中與抗體貝伐單抗或抗體蘭尼單抗的CDR序列相比較，所述六個CDR總共具有至多17個氨基酸取代，且其中所述VEGF抗體中的 ⑶R-H3不由表12-1到12-9中所示的⑶R-H3序列組成。
13.一種抗VEGF抗體或一種抗體的抗VEGF結(jié)合片段，其包含具有對應(yīng)于SEQ ID NO: 3 (CDR-Hl)、SEQ ID NO 4 (CDR-H2)、SEQ ID NO 5 (CDR-H3)、SEQ ID NO 6 (CDR-Ll)、SEQ ID NO 7 (⑶R-U)和SEQ ID NO 8 (⑶R-L3)的氨基酸序列的⑶R，其中所述⑶R-H3包括取代 SlOOaG和任選存在的一個或一個以上額外突變或突變的組合，所述突變選自表6、7、8、9、 10、11、12-1到12-9和13中的一者或一者以上，其中與抗體貝伐單抗或抗體蘭尼單抗的 CDR序列相比較，所述六個CDR總共具有至多17個氨基酸取代，且其中所述VEGF抗體的 ⑶R-H3中的3位不為酪氨酸。
14.一種抗VEGF抗體或一種抗體的抗VEGF結(jié)合片段，其包含具有對應(yīng)于SEQ ID NO: 3 (CDR-Hl)、SEQ ID NO 4 (CDR-H2)、SEQ ID NO 5 (CDR-H3)、SEQ ID NO 6 (CDR-Ll)、SEQ ID NO :7(CDR-L2)和SEQ ID NO :8(CDR_L3)的氨基酸序列的CDR，其中CDR-Hl包括至少一個選自D8P、N31F、N31G和N31M的取代以及任選存在的一個或一個以上額外突變或突變的組合，所述突變選自表6、7、8、9、10、11、12-1到12_9和13中的一者或一者以上，其中與抗體貝伐單抗或抗體蘭尼單抗的CDR序列相比較，所述六個CDR總共具有至多17個氨基酸取代，且其中所述VEGF抗體中的⑶R-Hl不由表12-1到12_9中所示的⑶R-Hl序列組成。
15.一種抗VEGF抗體或一種抗體的抗VEGF結(jié)合片段，其包含具有對應(yīng)于SEQ ID NO: 3 (CDR-Hl)、SEQ ID NO 4 (CDR-H2)、SEQ ID NO 5 (CDR-H3)、SEQ ID NO 6 (CDR-Ll)、SEQ ID NO :7(CDR-L2)和SEQ ID NO :8(CDR_L3)的氨基酸序列的CDR，其中CDR-H3包括至少一個選自H97A、H97Q、H97S、H97T、S100aD、S100aE和SlOOaV的取代以及任選存在的一個或一個以上額外突變或突變的組合，所述突變選自表6、7、8、9、10、11、12-1到12_9和13中的一者或一者以上，其中與抗體貝伐單抗或抗體蘭尼單抗的CDR序列相比較，所述六個CDR總共具有至多17個氨基酸取代，且其中所述VEGF抗體中的⑶R-H3不由表12_1到12_9中所示的 CDR-H3序列組成。
16.一種抗VEGF抗體或一種抗體的抗VEGF結(jié)合片段，其包含具有對應(yīng)于SEQ ID NO: 3 (CDR-Hl)、SEQ ID NO 4 (CDR-H2)、SEQ ID NO 5 (CDR-H3)、SEQ ID NO 6 (CDR-Ll)、SEQ ID NO 7 (CDR-U)和SEQ ID NO 8 (CDR-U)的氨基酸序列的CDR，其中CDR-Hl包括取代T30W、 T30R或T30Q，和任選存在的一個或一個以上額外突變或突變的組合，所述突變選自表6、7、8、9、10、11、12-1到12-9和13中的一者或一者以上，其中與抗體貝伐單抗或抗體蘭尼單抗的CDR序列相比較，所述六個CDR總共具有至多17個氨基酸取代，且其中所述VEGF抗體中的⑶R-Hl不由表12-1到12-9中所示的⑶R-Hl序列組成。
17.一種抗VEGF抗體或一種抗體的抗VEGF結(jié)合片段，其包含具有對應(yīng)于SEQ ID NO: 3 (CDR-Hl)、SEQ ID NO 4 (CDR-H2)、SEQ ID NO 5 (CDR-H3)、SEQ ID NO 6 (CDR-Ll)、SEQ ID NO 7 (CDR-L2)和SEQ ID NO 8 (CDR-L3)的氨基酸序列的CDR，其中CDR-H2包括至少一個選自 Y53F、T58F、A61G、A61K、A61R、A61H、A61Y、K64G、K64E、R65L、R65T、R65A、R65E 和 R65D 的取代，以及任選存在的一個或一個以上額外突變或突變的組合，所述突變選自表6、7、8、9、10、11、12-1到12-9和13中的一者或一者以上，其中與抗體貝伐單抗或抗體蘭尼單抗的 CDR序列相比較，所述六個CDR總共具有至多17個氨基酸取代，且其中所述VEGF抗體中的 ⑶R-H2不由表12-1到12-9中所示的⑶R-H2序列組成。
18.一種抗VEGF抗體或一種抗體的抗VEGF結(jié)合片段，其包含具有對應(yīng)于SEQ ID NO: 3 (CDR-Hl)、SEQ ID NO 4 (CDR-H2)、SEQ ID NO 5 (CDR-H3)、SEQ ID NO 6 (CDR-Ll)、SEQ ID NO 7 (CDR-L2)和SEQ ID NO 8 (CDR-L3)的氨基酸序列的CDR，其中CDR-H3包括至少一個選自Y98F和YlOOeF的取代，以及任選存在的一個或一個以上額外突變或突變的組合，所述突變選自表6、7、8、9、10、11、12-1到12_9和13中的一者或一者以上，其中與抗體貝伐單抗或抗體蘭尼單抗的CDR序列相比較，所述六個CDR總共具有至多17個氨基酸取代，且其中所述VEGF抗體中的⑶R-H3不由表12-1到12_9中所示的⑶R-H3序列組成。
19.一種抗VEGF抗體或一種抗體的抗VEGF結(jié)合片段，其包含具有對應(yīng)于SEQ ID NO: 3 (CDR-Hl)、SEQ ID NO 4 (CDR-H2)、SEQ ID NO 5 (CDR-H3)、SEQ ID NO 6 (CDR-Ll)、SEQ ID NO :7 (OTR-U)和SEQ ID N0:8(⑶R-L3)的氨基酸序列的⑶R，其中所述重鏈⑶R包括選自以下的取代的組合(a)在CDR-Hl 中的 N31F、在 CDR-H3 中的 H97D、在 CDR-H3 中的 Y99D 和在 CDR-H3 中的 S IOOaG ；(b)在CDR-Hl 中的 N31F、在 CDR-H3 中的 H97P、在 CDR-H3 中的 Y99D 和在 CDR-H3 中的 S IOOaG ；(c)在CDR-Hl 中的 N31F、在 CDR-H3 中的 H97P 和在 CDR-H3 中的 Y99E ；(d)在CDR-Hl 中的 N31F、在 CDR-H3 中的 H97E 和在 CDR-H3 中的 Y99E ；(e)在CDR-Hl 中的 N31F、在 CDR-H3 中的 H97D 和在 CDR-H3 中的 Y99E ；(f)在CDR-Hl 中的 N31F、在 CDR-H3 中的 H97E、在 CDR-H3 中的 Y99D 和在 CDR-H3 中的 SlOOaG ；(g)在CDR-Hl 中的 N31F、在 CDR-H3 中的 Y99D 和在 CDR-H3 中的 SlOOaG ；(h)在CDR-Hl 中的 N31F、在 CDR-H3 中的 H97P 和在 CDR-H3 中的 Y99D ；(i)在CDR-Hl 中的 N31F、在 CDR-H3 中的 H97D 和在 CDR-H3 中的 SlOOaG ；(j)在 CDR-Hl 中的 N31F 和在 CDR-H3 中的 SlOOaG ；(k)在 CDR-Hl 中的 N31F、在 CDR-H3 中的 H97P 和在 CDR-H3 中的 SlOOaG ；其中所述抗體或結(jié)合片段任選包含一個或一個以上額外突變或突變的組合，所述突變選自表6、7、8、9、10、11、12-1到12_9和13中的一者或一者以上，其中與抗體貝伐單抗或抗體蘭尼單抗的CDR序列相比較，所述六個CDR總共具有至多17個氨基酸取代。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的抗VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段，其中除選自(a)到(k) 的取代的組合外，與所述抗體貝伐單抗的重鏈CDR序列相比較或與所述抗體蘭尼單抗的重鏈⑶R序列相比較，所述重鏈⑶R不包含額外突變。
21.根據(jù)權(quán)利要求1到19中任一權(quán)利要求所述的抗VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段，其中與所述抗體貝伐單抗或所述抗體蘭尼單抗的CDR序列相比較，所述六個CDR總共具有至多16個、至多15個、至多14個、至多13個、至多12個、至多11個、至多10個、至多9個、 至多8個、至多7個、至多6個、至多5個或至多4個氨基酸取代。
22.根據(jù)權(quán)利要求1到21中任一權(quán)利要求所述的抗VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段，其中與所述抗體貝伐單抗或所述抗體蘭尼單抗的相應(yīng)CDR序列相比較，任何個別CDR都具有不超過三個氨基酸取代。
23.根據(jù)權(quán)利要求1到21中任一權(quán)利要求所述的抗VEGF抗體或抗VEGF抗體的抗VEGF結(jié)合片段或抗VEGF結(jié)合片段，其中與所述抗體貝伐單抗或所述抗體蘭尼單抗的相應(yīng)CDR序列相比較，任何個別CDR都具有不超過兩個氨基酸取代。
24.根據(jù)權(quán)利要求1到23中任一權(quán)利要求所述的抗VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段，其分別為單克隆抗體或單克隆抗體的抗VEGF結(jié)合片段。
25.根據(jù)權(quán)利要求1到M中任一權(quán)利要求所述的抗VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段，其分別為人類或人源化抗體，或者人源化或人源化抗體的抗VEGF結(jié)合片段。
26.根據(jù)權(quán)利要求1到25中任一權(quán)利要求所述的抗VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段，其為 IgG0
27.根據(jù)權(quán)利要求沈所述的抗VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段，其為IgG115
28.根據(jù)權(quán)利要求沈所述的抗VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段，其為Ig(i2。
29.根據(jù)權(quán)利要求1到觀中任一權(quán)利要求所述的抗VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段，其在Fc區(qū)中包括一個或一個以上增加ADCC活性的突變。
30.根據(jù)權(quán)利要求1到四中任一權(quán)利要求所述的抗VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段，其未經(jīng)巖藻糖基化。
31.根據(jù)權(quán)利要求1到30中任一權(quán)利要求所述的抗VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段，其在所述Fc區(qū)中包括一個或一個以上增加與Fc γ R的結(jié)合的突變。
32.根據(jù)權(quán)利要求1到30中任一權(quán)利要求所述的抗VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段，其在所述Fc區(qū)中包括一個或一個以上增加與Fcfoi的結(jié)合的突變。
33.根據(jù)權(quán)利要求1到27中任一權(quán)利要求所述的抗VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段，其在所述Fc區(qū)中包括一個或一個以上降低ADCC活性的突變。
34.根據(jù)權(quán)利要求1到34中任一權(quán)利要求所述的抗VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段，其除所述一個或一個以上突變外，還具有對應(yīng)于SEQ ID NO :1 序列和對應(yīng)于SEQ ID NO: 2的Vl序列。
35.根據(jù)權(quán)利要求1到34中任一權(quán)利要求所述的抗VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段，其除所述一個或一個以上突變外，還具有對應(yīng)于SEQ ID NO :9的重鏈序列和對應(yīng)于SEQ ID NO: 10的輕鏈序列。
36.根據(jù)權(quán)利要求1到34中任一權(quán)利要求所述的抗VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段，其親和力是具有對應(yīng)于SEQ ID NO 1的Vh序列和對應(yīng)于SEQ ID NO 2的八序列的抗體的親和力的1.5到50倍。
37.根據(jù)權(quán)利要求1到34中任一權(quán)利要求所述的抗VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段，其親和力是具有對應(yīng)于SEQ ID NO 9的重鏈序列和對應(yīng)于SEQ ID NO 10的輕鏈序列的抗體的親和力的1.5到50倍。
38.根據(jù)權(quán)利要求36所述的抗VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段，其親和力是具有對應(yīng)于 SEQ ID NO 1的Vh序列和對應(yīng)于SEQ ID NO 2的\序列的抗體的親和力的2到30倍。
39.根據(jù)權(quán)利要求37所述的抗VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段，其親和力是具有對應(yīng)于 SEQ ID NO :9的重鏈序列和對應(yīng)于SEQ ID NO :10的輕鏈序列的抗體的親和力的2到30倍。
40.根據(jù)權(quán)利要求36到39中任一權(quán)利要求所述的抗VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段，其中所述親和力是采用生物傳感器分析的Kd的量度。
41.根據(jù)權(quán)利要求1到40中任一權(quán)利要求所述的抗VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段，其經(jīng)純化。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的抗VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段，其經(jīng)純化到至少85%、 至少90%、至少95%或至少98%均質(zhì)性。
43.一種抗VEGF抗體或一種抗體的抗VEGF結(jié)合片段，其包含具有對應(yīng)于SEQ ID NO: 3 (CDR-Hl)、SEQ ID NO 4 (CDR-H2)、SEQ ID NO 5 (CDR-H3)、SEQ ID NO 6 (CDR-Ll)、SEQ ID N0:7(CDR-L2)和SEQ ID N0:8(CDR_L3)的氨基酸序列的六個互補(bǔ)決定區(qū)(“CDR”)，其中重鏈包括至少一個選自以下的取代在⑶R-H2中的A61F、在⑶R-H2中的A61E、在⑶R-H2 中的 A61D、在 CDR-H2 中的 D62L、在 CDR-H2 中的 D62G、在 CDR-H2 中的 D62Q、在 CDR-H2 中的 D62T、在 CDR-H2 中的 D62K、在 CDR-H2 中的 D62R、在 CDR-H2 中的 D62E、在 CDR-H2 中的 D62H、 在 CDR-H2 中的 K64S、在 CDR-H2 中的 K64V、在 CDR-H2 中的 K64Q、在 CDR-H2 中的 R65V、在 CDR-H2 中的 R65F、在 CDR-H2 中的 R65H、在 CDR-H2 中的 R65N、在 CDR-H2 中的 R65S、在 CDR-H2 中的R65Q、在CDR-H2中的、在CDR-H2中的R65I和在CDR-H3中的Y98H，以及任選存在的一個或一個以上額外突變或突變的組合，所述突變選自表7、8、9、10、11、12-1到12_9和 13中的一者或一者以上，其中與抗體貝伐單抗或抗體蘭尼單抗的CDR序列相比較，所述六個CDR總共具有至多17個氨基酸取代。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的抗VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段，其中與所述抗體貝伐單抗或所述抗體蘭尼單抗的CDR序列相比較，所述六個CDR總共具有至多16個、至多15個、 至多14個、至多13個、至多12個、至多11個、至多10個、至多9個、至多8個、至多7個、 至多6個、至多5個或至多4個氨基酸取代。
45.根據(jù)權(quán)利要求43或權(quán)利要求44所述的抗VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段，其中與所述抗體貝伐單抗的相應(yīng)CDR序列相比較，任何個別CDR都具有不超過三個氨基酸取代。
46.根據(jù)權(quán)利要求43或權(quán)利要求44所述的抗VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段，其中與所述抗體貝伐單抗的相應(yīng)CDR序列相比較，任何個別CDR都具有不超過兩個氨基酸取代。
47.根據(jù)權(quán)利要求43到46中任一權(quán)利要求所述的抗VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段，其分別為單克隆抗體或單克隆抗體的抗VEGF結(jié)合片段。
48.根據(jù)權(quán)利要求43到47中任一權(quán)利要求所述的抗VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段，其分別為人類或人源化抗體，或者人源化或人源化抗體的抗VEGF結(jié)合片段。
49.根據(jù)權(quán)利要求43到48中任一權(quán)利要求所述的抗VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段，其為 IgG0
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的抗VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段，其為IgG115
51.根據(jù)權(quán)利要求49所述的抗VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段，其為Ig(i2。
52.根據(jù)權(quán)利要求43到51中任一權(quán)利要求所述的抗VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段，其在Fc區(qū)中包括一個或一個以上增加ADCC活性的突變。
53.根據(jù)權(quán)利要求43到52中任一權(quán)利要求所述的抗VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段，其未經(jīng)巖藻糖基化。
54.根據(jù)權(quán)利要求43到53中任一權(quán)利要求所述的抗VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段，其在所述Fc區(qū)中包括一個或一個以上增加與Fc γ R的結(jié)合的突變。
55.根據(jù)權(quán)利要求43到53中任一權(quán)利要求所述的抗VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段，其在所述Fc區(qū)中包括一個或一個以上增加與Fcfoi的結(jié)合的突變。
56.根據(jù)權(quán)利要求43到50中任一權(quán)利要求所述的抗VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段，其在所述Fc區(qū)中包括一個或一個以上降低ADCC活性的突變。
57.根據(jù)權(quán)利要求43到56中任一權(quán)利要求所述的抗VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段，其除所述一個或一個以上突變外，還具有對應(yīng)于SEQ ID NO :1 序列和對應(yīng)于SEQ ID NO: 2的Vl序列。
58.根據(jù)權(quán)利要求43到57中任一權(quán)利要求所述的抗VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段，其經(jīng)純化。
59.根據(jù)權(quán)利要求58所述的抗VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段，其經(jīng)純化到至少85%、 至少90%、至少95%或至少98%均質(zhì)性。
60.一種抗體-藥物結(jié)合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1到59中任一權(quán)利要求所述的抗 VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段。
61.一種醫(yī)藥組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1到59中任一權(quán)利要求所述的抗VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段或根據(jù)權(quán)利要求60所述的抗體-藥物結(jié)合物，和醫(yī)藥學(xué)上可接受的載劑。
62.一種核酸，其包含編碼根據(jù)權(quán)利要求1到36和43到57中任一權(quán)利要求所述的抗 VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段的核苷酸序列。
63.一種載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求62所述的核酸。
64.一種原核宿主細(xì)胞，其經(jīng)根據(jù)權(quán)利要求63所述的載體轉(zhuǎn)化。
65.一種真核宿主細(xì)胞，其經(jīng)根據(jù)權(quán)利要求63所述的載體轉(zhuǎn)化。
66.一種真核宿主細(xì)胞，其經(jīng)工程改造以表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求62所述的核苷酸序列。
67.根據(jù)權(quán)利要求66所述的真核宿主細(xì)胞，其為哺乳動物宿主細(xì)胞。
68.一種產(chǎn)生抗VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段的方法，其包含(a)培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求 66或67所述的真核宿主細(xì)胞及(b)回收所述抗VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段抗體。
69.一種治療癌癥的方法，其包含對有此需要的人類患者投予治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1到59中任一權(quán)利要求所述的抗VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段、根據(jù)權(quán)利要求60所述的抗體-藥物結(jié)合物或根據(jù)權(quán)利要求61所述的醫(yī)藥組合物。
70.根據(jù)權(quán)利要求69所述的方法，其中所述癌癥為結(jié)腸轉(zhuǎn)移癌、直腸轉(zhuǎn)移癌、非鱗狀非小細(xì)胞肺癌或轉(zhuǎn)移性HER2陰性乳癌。
71.根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其中所述癌癥為不可切除、局部晚期、復(fù)發(fā)性或轉(zhuǎn)移性的非鱗狀非小細(xì)胞肺癌。
72.—種治療年齡相關(guān)性黃斑部變性的方法，其包含對有此需要的人類患者投予治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1到59中任一權(quán)利要求所述的抗VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段、根據(jù)權(quán)利要求60所述的抗體-藥物結(jié)合物或根據(jù)權(quán)利要求61所述的醫(yī)藥組合物。
73.一種治療免疫病癥的方法，其包含對有此需要的人類患者投予治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1到59中任一權(quán)利要求所述的抗VEGF抗體或抗VEGF結(jié)合片段、根據(jù)權(quán)利要求60 所述的抗體-藥物結(jié)合物或根據(jù)權(quán)利要求61的醫(yī)藥組合物。
74.根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，其中所述免疫病癥為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或格雷夫氏病 (Grave‘ s disease)。
全文摘要
本發(fā)明涉及針對血管內(nèi)皮生長因子“VEGF”的抗體和所述抗體例如用于治療與VEGF活性和/或VEGF過度產(chǎn)生相關(guān)的疾病的用途。
文檔編號A61K47/48GK102482349SQ201080027121
公開日2012年5月30日 申請日期2010年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月17日
發(fā)明者大衛(wèi)·B·鮑爾斯, 羅伯特·B·迪布里吉, 菲奧娜·阿爾丹, 赤松謙子 申請人:亞培生物醫(yī)療股份有限公司