專利名稱：新的血紅蛋白及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可用作細(xì)胞培養(yǎng)物、器官保存溶液和血液代用品的新的分離的血紅蛋白。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及血紅蛋白及其以簡單氧分壓固定、攜帶和釋放氧的性質(zhì)。這種血紅蛋白的一種特別的優(yōu)點(diǎn)是其用作工業(yè)和治療學(xué)應(yīng)用中的氧載體。目前存在兩種可行的氧療法基于血紅蛋白的氧載體(HBOC)和全氟化碳(PFC)。直接從紅血球中獲得的血紅蛋白不能用作血管內(nèi)的氧載體。為了避免血紅蛋白的自發(fā)破裂和從紅血球提取的血紅蛋白的毒性，基于血紅蛋白的氧載體使用純化的人血紅蛋白(Riess等人Chem Rev 2001,101 2797)、動(dòng)物(牛)血紅蛋白(Lok 等人 Nature 2001,410 :855)或重組(Looker 等人 Nature 1992,356:258)血紅蛋白作為原料。然后純化的血紅蛋白的各鏈與其他球蛋白鏈共價(jià)橋接或用微囊包封。全氟化碳是能溶解大量氧然后遞送所述氧的液體氟化烴化合物。然而，在這種情況下氧分壓必須高于空氣氧分壓。出于以下兩種主要目的來開發(fā)氧療i)它們可以作為輸血的備選方案，從而避免、減少或延遲異體血的輸送，和ii)改善供血差的器官的組織氧化。本發(fā)明人之前已經(jīng)表明，多毛綱環(huán)節(jié)動(dòng)物沙躅(Arenicola marina)的胞外聚合的血紅蛋白可用作氧療法 (Rousselot等人2006 Biotech Journal 1 :333)。所述血紅蛋白可容易地獲得并可純化為避免昂貴合成步驟的均質(zhì)產(chǎn)物。其也易于貯存且很少會(huì)引起免疫原性應(yīng)答，因?yàn)槿缫呀?jīng)證實(shí)的，其不是糖基化的。Zal等人已經(jīng)提出了來自沙躅的這種胞外血紅蛋白的四級(jí)結(jié)構(gòu)模型 (Zal等人Eur. J. Biochem 1997,243:85)。該研究表明存在十個(gè)亞基其中八個(gè)是球蛋白， 包括兩個(gè)單體(M = 15kDa)和兩個(gè)由五個(gè)二硫鍵結(jié)合的三聚體(T = 49kDa)。其余兩條鏈對(duì)應(yīng)于接頭鏈(L)，它們是二硫鍵結(jié)合的，以形成同種或異種二聚物( 50kDa)。這兩個(gè)單體亞基中的每一個(gè)的三個(gè)和六個(gè)拷貝與三聚體的一個(gè)拷貝形成十二聚體亞基(D)，其平均質(zhì)量接近于200kDa。十二個(gè)球蛋白鏈的這種復(fù)合物通過42個(gè)接頭鏈連接在一起，總質(zhì)量達(dá)到 3648 士 MkDa。當(dāng)研究另一科的多毛綱環(huán)節(jié)動(dòng)物時(shí)，本發(fā)明人從沙蠶科(Nereididae family) 中分離出一種新的血紅蛋白，其具有在若干介質(zhì)中長期保持穩(wěn)定性和功能性的優(yōu)點(diǎn)。屬于沙蠶科的蠕蟲在從其系統(tǒng)發(fā)育開始的若干方面與屬于沙躅科的蠕蟲不同。從進(jìn)化觀點(diǎn)來看，這兩科從幾百萬年前就彼此有差異(Halanych和Janosik，2006)。此外，這兩種環(huán)節(jié)動(dòng)物科不具有相同的形態(tài)、相同的特性、相同的基因、相同的生理機(jī)能，也不具有相同的有機(jī)體生物學(xué)。例如，沙蠶科是漂浮(errant)物種，而相比較，沙躅屬蠕蟲生活在潮間區(qū) (intertidal area)上的沙廊道中。此外，沙躅科在其壽命期間再生若干次，而沙蠶科一年再生一次并在再生期后死亡。然后本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，來自沙蠶科的新的分離的血紅蛋白可用作若干應(yīng)用(特別是用于細(xì)胞培養(yǎng)基補(bǔ)充劑)的氧載體、用作器官保存溶液的添加劑或用作用于輸送的人造氧載體。發(fā)明簡述本發(fā)明的一個(gè)目的是來自屬于沙蠶科的蠕蟲的分離的血紅蛋白或其部分，具有-6-7°C下的 P50 為 5 到 15、優(yōu)選 9 到 12_ Hg, 16_17°C下的 P50 為 12 到 20、優(yōu)選 15 到 18mm Hg,且 36_37°C下的 P50 為 20 到 50、優(yōu)選 30 到 44mm Hg,-優(yōu)選不含游離半胱氨酸，-優(yōu)選未糖基化。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述血紅蛋白從沙蠶Nereis virens中分離，Nereis virens 也禾爾為 Nereis diversicola>Neanthes virens 或 Hediste diversicolor (雖然這些學(xué)名是不同的，它們指相同的種)或該種的其他同義術(shù)語。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述血紅蛋白為水溶液、冷凍溶液、解凍溶液或凍干粉末形式。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是含有上述血紅蛋白的小袋。本發(fā)明的血紅蛋白可用作血液代用品。在這種情況下，所述血紅蛋白存在于生理學(xué)可接受的介質(zhì)中。“生理學(xué)可接受的介質(zhì)”是指與進(jìn)入活人血液的體內(nèi)注射相容的介質(zhì)。然后所述生理學(xué)可接受的介質(zhì)與人血相容，其不引起任何有害事件并保持本發(fā)明血紅蛋白的活性。所述血液代用品可存在于任何容器中，例如小袋、瓶子、燒瓶、袋中...所述血紅蛋白可以是水溶液、冷凍溶液、解凍溶液或凍干粉末形式。本發(fā)明的另一個(gè)目的是含有上述血紅蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基是適于生物生產(chǎn)的培養(yǎng)基。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基是適于細(xì)胞生長的培養(yǎng)基。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基中的血紅蛋白的濃度為至少0. 050g/l。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基中的血紅蛋白的濃度為至少lg/1。本發(fā)明的另一個(gè)目的是含有所述血紅蛋白的保存溶液。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述保存溶液是Viaspan 或Custodiol⑧。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述保存溶液中的血紅蛋白的濃度為至少0. 150g/l。本發(fā)明的另一個(gè)目的是含有上述血紅蛋白的用于輸送的人造氧載體。發(fā)明詳述本發(fā)明的一個(gè)目的是來自屬于沙蠶科(環(huán)節(jié)動(dòng)物，多毛綱)的蠕蟲的分離的血紅蛋白或其部分，具有-6-7°C下的 P5tl 為 5 到 15、優(yōu)選 9 到 12mm Hg，16_17°C下的 P5tl 為 12 到 20、優(yōu)選 15 到18讓Hg，且36-37°C下的P5tl為20到50、優(yōu)選30到44mmHg，-優(yōu)選不含游離半胱氨酸，-優(yōu)選未糖基化。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述血紅蛋白是胞外血紅蛋白，這是指不包含在細(xì)胞內(nèi)的且溶于血液中的血紅蛋白。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述血紅蛋白從屬于沙蠶屬的蠕蟲中分離。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述血紅蛋白從屬于沙蠶種Nereis virens (也稱為Nereis diversicola、Neanthes virens 或Hediste diversicolor)的蠕蟲中分離。
沙蠶屬蠕蟲可以在潮間區(qū)或河口區(qū)中收集。盡管它們的俗名是蠕蟲，但沙蠶在多種海底棲息地包括砂坪、泥灘、貝殼床和藻席中是常見的。發(fā)現(xiàn)一些種類也可在人造結(jié)構(gòu)例如樁材的藤壺和成薄殼狀的藻類(污損群落)中生存。沙蠶的分布無所不在，在沿著美國的西海岸、東海岸和海灣海岸以及大部分歐洲海岸的海水和河口水中常見。一些種類可在巖石中的潮間帶或高鹽度水的泥灘和沙坪中發(fā)現(xiàn)。它也是用于養(yǎng)殖魚或蝦的水產(chǎn)業(yè)中作為食物補(bǔ)充劑的主要的環(huán)節(jié)動(dòng)物種類之一。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述血紅蛋白在6_7°C下的P5tl為5到15、優(yōu)選9到 12mm Hg，在 16_17°C下的 P50 為 12 到 20、優(yōu)選 15 到 18mm Hg，且在 36_37°C下的 P50 為 20 到 50、優(yōu)選 30 到 44mm Hg。P5tl是用于測定呼吸色素與氧的親合性的參數(shù)，其對(duì)應(yīng)于呼吸色素結(jié)合位點(diǎn)的 50%氧飽和度。其對(duì)應(yīng)于氧固定至血紅素的效率。P5tl可使用hemox技術(shù)測定(Toulmond等人，1990 Biol. Bull. 179 :366)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述血紅蛋白在6. 65°C下的P50為約10. 98mm Hg，在16. 51°C下的P50為約16. 57mm Hg且在36. 56°C下的P50為37. Ilmm Hg，其中所述 P50的測定方法如下-根據(jù)如Paul R.等人，J. Comp. Physiol. 1997，167B，309-408 的題為 Circulation and respiratory control inmillimetre-sized animals(Daphni magna, Folsomia Candida) studied by optical methods所描述的擴(kuò)散室進(jìn)行操作；-在以下介質(zhì)中2.5mMCaCl2、145mM NaCl、0. 2mM MgCl2、4mMKCl、IOmM H印es，用 NaOH將pH調(diào)節(jié)至7. 35 ；-且所述介質(zhì)中所述血紅蛋白的濃度為30到70mg/ml，優(yōu)選40到60mg/ml。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述血紅蛋白的分子量為3000000到4000000道爾頓。本發(fā)明的另一個(gè)目的也是所述血紅蛋白的一部分?！八鲅t蛋白的一部分”是指所述血紅蛋白的片段，其能實(shí)現(xiàn)整個(gè)血紅蛋白的功能，特別是氧運(yùn)載功能。這種部分優(yōu)選自下組鏈、二聚體、三聚體、接頭和十二聚體。優(yōu)選地，對(duì)于鏈和二聚體而言，所述部分的分子量為14000到30000道爾頓；對(duì)于三聚體而言，所述部分的分子量為14000到60000道爾頓；對(duì)于十二聚體而言，所述部分的分子量為14000到250000道爾頓；對(duì)于雙十二聚體而言，所述部分的分子量為14000到500000 ；以及從500000到4000000道爾頓。所述分子量可通過在若干角度下的光散射測定(MALLS-多角度激光光散射(Multi Angle Lazer Light Scattering))0在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述血紅蛋白包含聚合球蛋白鏈至少一個(gè)單體亞基和至少一個(gè)三聚體亞基。優(yōu)選地，本發(fā)明血紅蛋白包含一個(gè)或兩個(gè)每個(gè)為10到20kDa、更優(yōu)選每個(gè)為15到16kDa的單體和一個(gè)40到55kDa、優(yōu)選48到50kDa的三聚體。本發(fā)明血紅蛋白也可以包含接頭。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述接頭的分子量為10到IOOkDa,更優(yōu)選40 到60kDa。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，所述接頭是二聚體且由兩個(gè)約20到30kDa、優(yōu)選22到^kDa 的單體鏈組成。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明，所述血紅蛋白不含半胱氨酸。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明，所述血紅蛋白也未糖基化。這降低了免疫原性應(yīng)答的風(fēng)險(xiǎn)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述血紅蛋白在6-7°C下的Ii5tl為1到2、優(yōu)選1到
1.3，在16-17°C下的n50為1到2. 5、優(yōu)選1到1. 3且在36_37°C下的n50為1到3、優(yōu)選1到2。Ii5tl為血紅蛋白協(xié)同性系數(shù)，并定義為用于評(píng)估位于位點(diǎn)后結(jié)合氧的氧結(jié)合能力的參數(shù)，n50可用使用hemox技術(shù)獲得的呼吸色素的氧飽和曲線計(jì)算。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述血紅蛋白在6. 65°C下的n5(1為約1. 19，在 16. 51°C下的n5Q為約1. 17且在36. 56°C下的n50為約1.47，其中所述n5Q根據(jù)如(Paul R.， 等人，J. Comp. Physiol. 1997，167B，309-408)描寫的擴(kuò)散室操作測定。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，上述血紅蛋白存在于水溶液、冷凍溶液、解凍溶液或凍干粉末形式的組合物中。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明血紅蛋白保存在貯存緩沖液中。所述貯存緩沖液是可接受的介質(zhì)。它可以包括 0-2. 5mM CaCl2,0-300mM NaCl、O-ImMMgCl2、0_5mM KC1.0-1M Hepes和/或Tris或能將pH調(diào)節(jié)至所需值的任何其他緩沖液，并用NaOH將pH調(diào)節(jié)至 7. 0-7. 8。本發(fā)明也涉及含有本發(fā)明血紅蛋白的水溶液。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述溶液中血紅蛋白的濃度為0. 050到200mg/ml，優(yōu)選30到100mg/ml，更優(yōu)選30到60mg/ml。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，含有上述血紅蛋白的溶液被配制成pH約為6-8，優(yōu)選約 7. 0-7. 8。本發(fā)明的另一個(gè)目的也是含有上述血紅蛋白的小袋。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的血紅蛋白被保存在貯存緩沖液中。所述貯存緩沖液是生理學(xué)可接受的介質(zhì)。它可以包含0-2. 5mM CaCl2,0-300mMNaCl,O-ImM MgCl2、0_5mM KCl.O-lM Hepes和/或Tris或能將pH調(diào)節(jié)至所需值的任何其他緩沖液，并用NaOH將pH 調(diào)節(jié)至7. 0-7. 8。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明血紅蛋白在介質(zhì)中穩(wěn)定，其特別適用于細(xì)胞培養(yǎng)基。此外， 本發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的血紅蛋白促進(jìn)細(xì)胞生長、改善細(xì)胞存活率并極大改善重組蛋白的產(chǎn)生。優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)基從而獲得最大量的蛋白和最有效的生產(chǎn)力手段是重組蛋白產(chǎn)生的一個(gè)目標(biāo)，因?yàn)槿魏胃纳瓶删哂芯薮蟮慕?jīng)濟(jì)效益。因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的是含有上述血紅蛋白的培養(yǎng)基。如本發(fā)明所使用，術(shù)語“培養(yǎng)基”、“細(xì)胞培養(yǎng)基”和“培養(yǎng)基制劑”是指用于在多細(xì)胞機(jī)體或組織以外的人造環(huán)境中維持、生長、繁殖和/或擴(kuò)增細(xì)胞的營養(yǎng)溶液?？蓛?yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)基用于特定培養(yǎng)用途，例如包括，配制成細(xì)胞生長培養(yǎng)基以促進(jìn)細(xì)胞的生長或配制成細(xì)胞產(chǎn)生培養(yǎng)基以促進(jìn)重組蛋白的產(chǎn)生。如本發(fā)明所使用，適于生物產(chǎn)生的細(xì)胞培養(yǎng)基是指配制成促進(jìn)重組蛋白產(chǎn)生的細(xì)胞培養(yǎng)基。所述重組蛋白可以是任何目標(biāo)蛋白，例如抗體，如抗-TNFa抗體、抗-IL-12抗體、抗-IL-18抗體或抗-EPO受體抗體。培養(yǎng)基的實(shí)例包括但不限于Dulbecco改進(jìn)的Eagle 培養(yǎng)基(DMEM)、DMEM/F12、最小必需培養(yǎng)基(MEM)、基礎(chǔ)Eagle培養(yǎng)基(BME)、RPMI 1640、 F-10、F-12、α -最小必需培養(yǎng)基(α -MEM)、Glasgow 最小必需培養(yǎng)基(G-MEM)、PF CHO (SAFC Biosciences)、用于不含蛋白的CHO細(xì)胞的Ex-cell 325PF CHO無血清培養(yǎng)基(SAFC Bioscience)和 Iscove' s 改進(jìn)的 Dulbecco 培養(yǎng)基、CD CHO 培養(yǎng)基。
細(xì)胞培養(yǎng)基的實(shí)例也包括優(yōu)化的細(xì)胞培養(yǎng)基，例如WO 2008/033517中所描述的那些。這些細(xì)胞培養(yǎng)基是含部分A、部分B和部分C的不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中a)部分A基本上由改進(jìn)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成，其不含以下成分碳酸氫鈉、緩沖液、 磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調(diào)節(jié)劑、表面活性劑、單糖葡萄糖；b)部分B基本上由無機(jī)鐵源組成；和c)部分C包含重組生長因子；緩沖液；滲透壓調(diào)節(jié)劑；能源；和至少兩種不同的非動(dòng)物水解產(chǎn)物。優(yōu)選地，這種不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)基包括a)改進(jìn)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其不含以下成分碳酸氫鈉、緩沖液、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、滲透壓調(diào)節(jié)劑、表面活性劑和單糖葡萄糖；b)約 8 到 12ml/kg 或 122. 45mg/L 檸檬酸鐵；和c)約4到8ml/kg或10到Hmg/kg重組人胰島素；約5到9g/kg無水葡萄糖；約 0. 5到0. 7g/kg L-谷氨酰胺；約1到2g/kg碳酸氫鈉；約1到2g/kg HEPES ；約2到3g/kg NaCl ；約 0. 5 到 2g/kg 表面活性劑(Pluronic F-68)；約 0. 01 到 0. lg/kg NaH2PO4-H2O ；約 0. 4到0. 5g/kg Na2HPOffH2O ；約8到12g/kg酵母基水解產(chǎn)物；和約60到70g/kg植物基水解產(chǎn)物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，含有上述血紅蛋白的所述細(xì)胞培養(yǎng)基用于培養(yǎng)任何種類的細(xì)胞、真核生物或原核生物和細(xì)胞系。待培養(yǎng)的細(xì)胞例如可以是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括人細(xì)胞、魚細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、軟體動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、環(huán)節(jié)動(dòng)物細(xì)胞...待培養(yǎng)的細(xì)胞種類的實(shí)例包括但不限于腎細(xì)胞、肝細(xì)胞、心臟細(xì)胞、肺細(xì)胞、腸細(xì)胞、胃細(xì)胞、結(jié)腸細(xì)胞、胰腺細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，優(yōu)化本發(fā)明細(xì)胞培養(yǎng)基，以用于表達(dá)目標(biāo)蛋白例如抗體的 CHO(中國倉鼠卵巢細(xì)胞)或Sp2/0或PTG2b細(xì)胞的生長和/或蛋白產(chǎn)生。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基所包含的本發(fā)明描述的血紅蛋白的濃度為至少0. 05g/l。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)基所包含的本發(fā)明血紅蛋白的濃度為至少 0.250g/l。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)基所包含的本發(fā)明血紅蛋白的濃度為至少 lg/1?；诖囵B(yǎng)的細(xì)胞的生理學(xué)種類，本領(lǐng)域技術(shù)人員能確定添加到特定培養(yǎng)基中的血紅蛋白的濃度。所述細(xì)胞培養(yǎng)基可存在于任何容器，例如瓶子、燒瓶、袋子...中。本發(fā)明人也發(fā)現(xiàn)，保存溶液中的本發(fā)明血紅蛋白能維持細(xì)胞存活率和細(xì)胞代謝活性，因此保護(hù)細(xì)胞不受由標(biāo)準(zhǔn)保存所導(dǎo)致的細(xì)胞損害。本發(fā)明的另一個(gè)目的是含有上述血紅蛋白的保存溶液。所述保存溶液具有保護(hù)細(xì)胞不受由標(biāo)準(zhǔn)保存所導(dǎo)致的細(xì)胞損害的優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“保存或維持溶液”是指可以保護(hù)器官、組織或細(xì)胞不受缺血再灌注的有害影響而維持所述器官、組織或細(xì)胞的代謝需要的任何溶液。常規(guī)保存溶液是水溶液，其包含電解質(zhì)，例如鉀、鈉、鎂、鈣、氯化物、硫酸鹽和任選的非滲透性物質(zhì)，例如甘露醇、棉子糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖酸或葡糖酸，或任選的膠體，例如白蛋白、羥乙基淀粉、聚乙二醇或右旋糖酐40。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述保存溶液包含至少陽離子和氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方式中， 所述保存溶液包含至少二糖鹽、三糖、核苷、三肽、黃嘌呤氧化酶抑制劑和淀粉衍生物。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述保存溶液包含至少陽離子、氨基酸和多元醇。常規(guī)保存溶液包括但不限于 UW(Viaspan )、IGLl 、Celsior 、SCOTMaco、BMPS Belzer ⑧、 Custodiol ⑥或 Plegisol 。優(yōu)選地，本發(fā)明的保存溶液包含上述血紅蛋白Viaspan 。Viaspan 是商業(yè)溶液，又名威斯康星大學(xué)溶液(UW溶液)。它包含乳糖酸鉀 (IOOmM)、KH2P04(25mM)、MgS04(5mM)、棉子糖(30mM)、腺苷(5mM)、谷胱甘肽(3mM)、別嘌呤醇 (ImM)和羥乙基淀粉(50g/L)。Custodiol 是商業(yè)溶液，含有鈉(15mM)、鉀(IOmM)、鎂 ^nM)、鈣(0. 015mM)、酮戊二酸/谷氨酸(ImM)、組氨酸(198mM)、甘露醇(30mM)和色氨酸QmM)；其滲透壓為310m0sm/ L0所述保存溶液可存在于任何容器，例如瓶子、燒瓶、袋子...中。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述保存溶液所包含的上述血紅蛋白的濃度為至少 0.005g/l。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述保存溶液所包含的上述血紅蛋白的濃度為至少 0. 150g/l。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述保存溶液所包含的上述血紅蛋白的濃度為 0.150g/l 到 5g/l?；诖４娴钠鞴?、組織或細(xì)胞，本領(lǐng)域技術(shù)人員能確定添加到保存溶液中的血紅蛋白的濃度。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述保存溶液的溫度可以為2°C到40°C，優(yōu)選4°C到 37 °C。本發(fā)明的保存或維持溶液能夠保護(hù)，-活組織，例如皮膚；角膜；器官，例如心、肺、腎、肝或胰腺；-器官部分，例如肌肉、胰島、心瓣膜等；和-組織或器官細(xì)胞。這種保護(hù)包括在移植到受試者之前的貯存期間免受由缺血和/或缺氧癥所引起的損害。對(duì)于器官保存，從供體(活的，腦死亡或沒有心跳)中移去器官(例如腎臟)而后立即用所述維持溶液浸漬。在死亡后移除的情況下，應(yīng)該盡快移去器官以阻止缺血性損害， 通常在約30分鐘到約90分鐘內(nèi)移去。所述器官在約2°C到約12°C (低體溫灌注)優(yōu)選 40C (冷缺血)的溫度下貯存在過量維持溶液中，或貯存在常溫灌注中直到隨后移植到受試者。體外器官保存領(lǐng)域的發(fā)展在過去的四分之一世紀(jì)中進(jìn)展到這樣的程度，其中取決于器官的性質(zhì)，移植器官可以在可變更時(shí)期內(nèi)安全貯存。腎臟可以貯存一到二天04-35小時(shí))， 肝和胰腺可以貯存小于一天(10-16/18小時(shí))，但是對(duì)于心臟的臨床接受界限僅為約6小時(shí)或更少?，F(xiàn)有的維持溶液在各器官的至少最大允許貯存時(shí)間內(nèi)為各種器官提供保護(hù)。器官可以以靜止或脈動(dòng)方式保存。在靜止方式中，所述器官浸漬在保存溶液中，在脈動(dòng)方式中， 使用包括泵系統(tǒng)的機(jī)器灌注所述器官。除個(gè)體組織或器官的保存之外，本發(fā)明保存溶液也可用于活供體、尸體包括腦死亡個(gè)體的全身保存。在這種方式中，可以實(shí)現(xiàn)個(gè)體器官及其他組織保存高達(dá)8小時(shí)或更長。 尸體可以以和本發(fā)明所述的用于不流血低體溫外科手術(shù)的基本上相同的方法處理，除了在低體溫溫度下引入維持溶液后，所述個(gè)體維持在低體溫溫度下直到一種或多種器官被需要的時(shí)間，然后采集以便使用。然后，如果需要，貯存移除的器官，以轉(zhuǎn)移到其他新鮮的維持溶液中。本發(fā)明的保存溶液也可用于保存和保護(hù)組織例如皮膚免受貯存損害，且可能避免毒素和化學(xué)毒性物質(zhì)的有害影響。因此，所述保存溶液也適用于組織例如皮膚和角膜的貯存，例如，用于隨后移植在例如燒傷患者上，以及適用于保護(hù)人類皮膚抵抗例如可能存在于被污染的環(huán)境中的毒素和毒性物質(zhì)的有害影響，抵抗化學(xué)或細(xì)菌戰(zhàn)爭等。對(duì)于保存隨后用于移植的皮膚和角膜組織而言，所述組織從供體移去并在4°C下在維持溶液中貯存至少一周和高達(dá)約2到4周，直到移植。本發(fā)明也提供保存器官或組織或來自所述器官或組織的細(xì)胞的方法，包括-在約4°C到37°C，優(yōu)選約4°C到25 °C，更優(yōu)選約4°C到15 °C下用本發(fā)明的保存溶液洗滌收集后的所述器官或組織或來自所述器官或組織的所述細(xì)胞，-在本發(fā)明的保存溶液中在約4°C到37°C，優(yōu)選約4°C到25°C，更優(yōu)選約4°C到 15°C下以靜止方式或動(dòng)力灌注來保存所述器官或組織或來自所述器官或組織的所述細(xì)胞。 保存的時(shí)間將取決于如上文所述的器官或組織或細(xì)胞的類型。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，其中所述器官或組織或細(xì)胞從活的或腦死亡的受試者中收集，所述器官或組織或細(xì)胞優(yōu)選在4°C下洗滌和保存。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，其中所述器官或組織或細(xì)胞從死于心臟驟停的受試者中收集，所述器官或組織或細(xì)胞優(yōu)選在室溫下洗滌和保存。本發(fā)明人也發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明血紅蛋白在血漿中是穩(wěn)定的且特別耐受自氧化。紅血球代用品的普遍問題之一是其壽命短，因?yàn)榕c紅血球的120天的平均滯留時(shí)間相比，基于血紅蛋白的氧載體的血漿滯留時(shí)間對(duì)于交聯(lián)血紅蛋白而言為約12h到對(duì)于 PEG-血紅蛋白而言為約2天。非細(xì)胞血紅蛋白對(duì)氧化和變性特別敏感。氧化的非細(xì)胞血紅蛋白還可以通過高鐵血色原的形成而降解，導(dǎo)致血紅素鐵的釋放和球蛋白鏈的沉淀，其可能引起內(nèi)皮和周圍組織損傷。已經(jīng)普遍接受的是，基于血紅蛋白的氧載體應(yīng)具有類似于人血氧載體的性質(zhì)。與該想法相關(guān)，目前階段III基于血紅蛋白的氧載體-血紅蛋白glutamer-250(牛)(基于血衾工胃白白勺fii^i本-201 [HB0C-201]，Hemopure ； Biopure Corporation, Cambridge, ΜΑ)為用戊二醛聚合的、在平衡的電解質(zhì)溶液中的牛血紅蛋白，其具有36到38mm Hg的P5tl，類似于本發(fā)明血紅蛋白的P5(l。因此本發(fā)明的另一個(gè)目的是用于輸送的、含有上述血紅蛋白的人造氧載體。 如本發(fā)明所使用，術(shù)語“人造氧載體”是指能替代存在于紅血球中的血紅蛋白并能進(jìn)行其作為氣體(氧和二氧化碳)轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能的生物產(chǎn)品。所述用于輸送的人造氧載體還必須為組織供氧，其中它變得裝載有CO2,以在交換表面(肺)釋放該氣體。所述用于輸送的人造氧載體也可以稱為血液代用品。本發(fā)明的用于輸送的人造氧載體具有以下優(yōu)點(diǎn)它是無毒的，它不含病原體，它在 4°C下至少6周內(nèi)保持不被氧化，它可輸送入所有血型中，它具有足夠長的滯留時(shí)間以確保其輸入的有機(jī)體再生天然血紅蛋白，且它被其輸入的有機(jī)體消除。表達(dá)“無毒”是指用于輸送的人造氧載體不引起免疫反應(yīng)、過敏性或腎中毒類型的任何病理性紊亂。表達(dá)“不含病原體”是指不存在鑒定到的微生物或病毒。不存在病理性紊亂間接暗指不存在病原體。表達(dá)“在4°C下至少6周內(nèi)保持不被氧化”是指涉及氧結(jié)合的活性位點(diǎn)和特別是存在于血紅素中的鐵保持狗2+形式(功能狀態(tài))。活性位點(diǎn)的氧化歸因于 Fe2+到狗3+的轉(zhuǎn)化，結(jié)果后者不再能夠結(jié)合氧。表達(dá)“可輸送入所有血型”是指不存在血型分型(ΑΒ0或恒河猴系統(tǒng))。所述血紅蛋白可以被認(rèn)為是通用的血紅蛋白，因?yàn)樗皇翘腔肿?。表達(dá)“具有足夠長的滯留時(shí)間以確保其輸入的有機(jī)體再生天然血紅蛋白”是指在輸送之前至少48小時(shí)后血系統(tǒng)中存在該血紅蛋白。所述時(shí)間是足夠久的，以使得有機(jī)體合成出其自己的紅血球。通過圖示，在人輸送的情況內(nèi)，有利地，所述時(shí)間必須為約48小時(shí)。 表達(dá)“在無副作用的情況下被其輸入的有機(jī)體消除”是指所述胞外血紅蛋白似乎通過不引起任何特定病理性紊亂的天然手段消除。在脊椎動(dòng)物中，紅血球的壽命持續(xù)約120天。然后紅血球被細(xì)胞吞噬(生理學(xué)紅血球溶解)。然后血紅蛋白被轉(zhuǎn)化為膽綠素和膽紅素，其通過膽汁消除?，F(xiàn)有技術(shù)的產(chǎn)物可能遇到任何一種副作用，尤其是水腫，致免疫性和腎中毒性問題在本發(fā)明范圍內(nèi)均不存在。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，本發(fā)明的用于輸送的人造氧載體還包含藥用可接受的水溶液。優(yōu)選地，本發(fā)明的用于輸送的人造氧載體包括上述血紅蛋白和人造血漿。如本發(fā)明所使用，人造血漿是指可注射的生理性液體，例如血漿容量擴(kuò)張劑或血漿代用品。人造血菜的實(shí)例包括但不限于 Hextend (BioTime，Inc.，Berkeley, CA)。有利地，本發(fā)明的用于輸送的人造氧載體是不含熱源和不含微生物的。本發(fā)明也涉及含有本發(fā)明的用于輸送的人造氧載體的血小袋。優(yōu)選地，所述血小袋是在約25°C下和外部相對(duì)濕度約50%下的氧阻擋膜初級(jí)包裝(或約0. 155cc/100平方厘米)/ 小時(shí)/大氣壓，在其中密封用于輸送的人造氧載體，因此使用于輸送的人造氧載體保存在基本上不含氧的環(huán)境中。


圖1沙蠶血紅蛋白的結(jié)構(gòu)分析。
圖2大鼠血漿中沙蠶血紅蛋白的穩(wěn)定性。
圖3:LDH釋放百分比作為沙蠶血紅蛋白濃度的函數(shù)。
圖4代謝活性百分比作為沙蠶血紅蛋白濃度的函數(shù)。
圖5在37°C下細(xì)胞培養(yǎng)基中沙蠶血紅蛋白的穩(wěn)定性。
圖6在37°C下細(xì)胞培養(yǎng)基中沙蠶血紅蛋白的穩(wěn)定性。
圖7沙蠶血紅蛋白對(duì)CHO細(xì)胞存活率、生長和蛋白產(chǎn)生的影響。
圖8沙蠶血紅蛋白對(duì)Sp2/0細(xì)胞存活率、生長和蛋白產(chǎn)生的影響。
圖9沙蠶血紅蛋白對(duì)PTG2b細(xì)胞存活率、生長和蛋白產(chǎn)生的影響。實(shí)施例沙蠶血紅蛋白樣品的提取和純化從為蝦和魚水產(chǎn)業(yè)養(yǎng)殖這些蠕蟲的海產(chǎn)畜產(chǎn)業(yè)者獲得沙蠶種類。將活的沙蠶放血。在冰上收集血樣。冷離心(在4°C下15 OOOg離心15min)以去除任何組織殘骸， 在-20°C或在液氮中冷凍上清液，或立即純化。血紅蛋白的純化純化前，在4°C下以5000g離心解凍樣品5min。離心后，通常存在少量殘余物； 其被去除。通過使用2. 5*100cm Sephacryl S-400HR柱(GE Healthcare，分離范圍為 2xl04-8xl06kDa)低壓過濾來純化上清液。用上述貯存緩沖液(150mM NaCl、2mM CaCl2, 1. 5mM CaCl2、5mM KCl、50mMH印es、pH 7. 2)洗脫樣品。所使用速率通常為 0. 4到0. 5ml/min。 在兩個(gè)波長處監(jiān)控洗脫物的吸收率280nm(蛋白吸收峰)和414nm(血紅蛋白吸收峰)。使用CentriCOn-100(15ml)管或使用分子量保持大于或等于IOOOODa的攪拌細(xì)胞來濃縮包含血紅素的級(jí)份。使用相同方案進(jìn)行兩個(gè)純化過程對(duì)于獲得純的級(jí)份而言可能是必須的。純化的樣品在0. 2 μ m濾膜上過濾，然后貯存在-80°C。獲得的血紅蛋白濃度為約50mg/ml且血紅蛋白的純度為95%。樣品保持冷凍或保存在液氮下直到使用。凝膠過濾LC分析使用高壓HPLC 系統(tǒng)(Waters，milford, MA, USA)在 1x30cm Superose6_C(分級(jí)范圍為5到5000kDa,GE Healthcare)對(duì)5到200 μ 1的注入樣品進(jìn)行分析性凝膠過濾。洗脫緩沖液是PH為7. 2的0. IN的Tris-HCl緩沖液。用光電二極管陣列檢測器(Waters 2996) 在250-700nm范圍監(jiān)控洗脫(流速0. 5ml/min)。通過Empower軟件(Waters)收集并處理色譜分析數(shù)據(jù)。通過用Empower軟件在414nm(亞鐵血紅素特有的)和280nm(蛋白特有的)處整合色譜圖來確定各亞基的百分比。多-角度-激光-光-散射用 MALLS 檢測器(DAWN EOS system, Wyatt Technology Corp.，Santa Barbara, CA, USA)直接在線用HPLC系統(tǒng)和Superose 6柱測定天然血紅蛋白的分子量和回轉(zhuǎn)半徑。 通過Astra軟件(Wyatt Technology Corp.)收集并處理色譜分析數(shù)據(jù)。Zimm擬合法用于分子量的測定。該方法中，折射率的濃度相關(guān)性設(shè)置在0. 19ml g—H通常用于人血紅蛋白)。 樣品保持在4°C下直到在室溫下進(jìn)行洗脫。質(zhì)譜分析在以IOs/掃描在600-2500的質(zhì)荷比(m/z)范圍內(nèi)掃描的ESI-Q-TOF(Q-T0F II ； Micromass, Altrincham, UK)質(zhì)譜儀上獲得電噴射數(shù)據(jù)。在^iin累積數(shù)據(jù)以生成最終光譜。 將錐電壓(反電極到錐孔電壓(skimmer voltage))設(shè)置在60V。用截留分子量為IOOkDa 的離心過濾器(Amicon Ultra-4,Millipore)用4ml MilliQ水(4°C )使純化的、天然Hb的 200- μ 1溶液脫鹽四次。在非還原Hb、還原Hb和還原且脲基甲基化Hb上進(jìn)行ESI-MS分析以確定亞基結(jié)合成為二硫化物橋接結(jié)構(gòu)。將1 l(v/v)乙腈/水(包含0.2% (ν/ν)甲酸)中的蛋白濃度為0.5yg μΓ1的樣品以5μ1 rniiT1引入電噴射源。在室溫下在堿性條件下在IOOmM碳酸氫銨的存在下用IOmM DTT還原Hb (0. 9mg ι Γ1)。培養(yǎng)IOmin后，將10-μ 1等分試樣與40 μ 1 MilliQ和50 μ 1包含0. 2%甲酸的乙腈混合并通過ESI-MS分析。在還原條件下培養(yǎng)20min后，在室溫下用4mM碘乙酰胺分別脲基甲基化Hb(0. 7mg πιΓ1) IOmin和10小時(shí)，之后12. 75-μ 1等分試樣與37. 75 μ 1 MilliQ和 50 μ 1包含0. 2%甲酸的乙腈混合并通過ESI-MS分析。進(jìn)行脲基甲基化用于總半胱氨酸的測定。質(zhì)量標(biāo)度校準(zhǔn)使用來自馬心臟肌紅蛋白的多電荷系列(multiply charged series) (16951. 7Da;Sigma, St Louis, MO) 0使用裝置所提供的基于最大熵的分析來解析原始多電荷ESI-MS譜。分子量是基于由IUPAC給出的元素的原子量。氧結(jié)合性使用與階式\V0Sthoff氣體混合泵(Bochum，德國)連接的恒溫?cái)U(kuò)散室 (Colmorgen等人.1997 J Comp. Physiol. 167B :309)在3 μ 1樣品上測定氧平衡曲線。所述擴(kuò)散室置于436nm處的分光計(jì)(Hitachi Ul 100)光路上。將基于0. 2到0. 8部分飽和(Y) 的至少三個(gè)平衡步驟的氧化數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為Hill圖(log[Y/l_Y)]對(duì)log PO2，其中PO2是氧分壓)，從而評(píng)估半-飽和度氧分壓(P5tl)和半-飽和度的Hill協(xié)同性系數(shù)(Ii5tl)。細(xì)胞培養(yǎng)基細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)條件使用CHO DXBlK 一種二氫葉酸還原酶(dhfr_)和中國倉鼠卵巢細(xì)胞系)、SP2/0 和PTG2b。將CHO和SP2/0以0. 5*105個(gè)細(xì)胞/ml接種在不含血清培養(yǎng)基的搖瓶中，所述培養(yǎng)基為特別設(shè)計(jì)用于最佳的懸浮生長和蛋白產(chǎn)生，其補(bǔ)充有8mM的L-谷氨酰胺和不同濃度的血紅蛋白。細(xì)胞在37°C下在搖動(dòng)的培養(yǎng)器中在不再補(bǔ)給情況下分批生長至少1天，優(yōu)選至少4天，更優(yōu)選至少8天。取樣和研究參數(shù)在接種的第0、1、4、6和8天后移去樣品以確定細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞存活率和蛋白的產(chǎn)生。通過臺(tái)盼藍(lán)排斥技術(shù)使用Vi-CELL 分析儀(Beckman Coulter)測定細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞存活率。根據(jù)制造商的說明書(ELISA kit, Bethyl Laboratories)，使用特別用于要表達(dá) IgG的ELISA試驗(yàn)來測定總的抗體產(chǎn)生。細(xì)胞保存細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)條件使用最初來源于豬腎臟的上皮細(xì)胞系-LLC-PKl進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將LLC-PKl細(xì)胞在補(bǔ)充有3% SVF、100U/ml青霉素、100μ g/ml鏈霉素和2mM L-谷氨酰胺的M199介質(zhì)中進(jìn)行培養(yǎng)。將LLC-PKl細(xì)胞以1. 6. IO5個(gè)細(xì)胞ml的濃度接種在6孔板中。培養(yǎng)4 后，細(xì)胞在PBS中洗滌并在4°C下在1. 2ml的UW溶液(Viaspan )或Custodiol 溶液(單獨(dú)或在不同濃度的血紅蛋白存在下)中保持Mh。細(xì)胞存活率檢測LDH 測試通過檢測乳酸脫氫酶(LDH)測定細(xì)胞存活率，因?yàn)樵撁冈诩?xì)胞中的存在反映質(zhì)膜的滲透作用及其由此引起的細(xì)胞死亡。在保存溶液中保存24h后，去除上清液，細(xì)胞在PBS中洗滌3次然后溶解在含有0. 1%的 Triton X-100 的 1. 2ml PBS 中。根據(jù)制造商說明書(T0X7，Sigma-Aldrich)，使用比色劑量來測定存在于細(xì)胞中的 LDH量。490nm和630nm處測得的吸收率Δ與存在于樣品中的酶量成正比。MTT 測試MTT測試是用于測定細(xì)胞存活率降低的另一種體外細(xì)胞存活率測試。在保存溶液中保存24h后，去除上清液且細(xì)胞在PBS中洗滌2次。將四唑化合物MTT (3-W，5- 二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基溴化四氮唑)以在PBS中的0. 5mg/ml的濃度添加到孔中，且細(xì)胞在37°C下培養(yǎng)30min。MTT被代謝活性細(xì)胞還原為不溶的紫色甲暨染料晶體。通過添加 2ml DMSO使該晶體溶解，用分光光度計(jì)檢測吸光度。在535nm和690nm處測得的吸收率Δ 與細(xì)胞的代謝活性成正比。結(jié)果結(jié)構(gòu)分析通過MALLS測定分子量和回轉(zhuǎn)半徑(圖1)。通過ESI-MS測定亞基和多肽鏈組成(表1)。表權(quán)利要求
1.來自屬于沙蠶科的環(huán)節(jié)蠕蟲的分離的血紅蛋白或其部分，具有-6-7°C下的P50為5到15、優(yōu)選9到12_ Hg, 16_17°C下的P50為12到20、優(yōu)選15到 18mm Hg,且 36-37°C 下的 P50 為 20 到 50、優(yōu)選 30 到 44mm Hg,-優(yōu)選不含游離半胱氨酸，-優(yōu)選未糖基化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血紅蛋白或其部分，其來自沙蠶Nereisvirens、沙蠶Nereis diversicola、沙香 Neanthes virens 或沙香 Hediste diversicolor。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的血紅蛋白，其是胞外的且其分子量為3000000到4000000 道爾頓。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到2任一所述的血紅蛋白部分，其分子量為14000到30000道爾頓， 優(yōu)選為14000到60000道爾頓，優(yōu)選為14000到250000道爾頓，優(yōu)選為14000到500000道爾頓，優(yōu)選為500000到4000000道爾頓。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到4任一所述的血紅蛋白或其部分，其中它包含-一個(gè)或兩個(gè)每個(gè)10到20kDa、更優(yōu)選每個(gè)15到16kDa的單體，-一個(gè)40到55kDa、優(yōu)選48到50kDa的三聚體，和-由兩個(gè)每個(gè)約20到30kDa、優(yōu)選每個(gè)22到^kDa的單體鏈組成的二聚接頭。
6.組合物，其含有根據(jù)權(quán)利要求1到5任一所述的血紅蛋白或其部分，所述組合物為水溶液、解凍溶液或凍干粉末形式。
7.小袋，其含有根據(jù)權(quán)利要求1到5任一所述的血紅蛋白或其部分或權(quán)利要求6所述的組合物。
8.細(xì)胞培養(yǎng)基，其含有根據(jù)權(quán)利要求1到5任一所述的血紅蛋白或其部分或權(quán)利要求 6所述的組合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基是被配制成促進(jìn)重組蛋白的產(chǎn)生的培養(yǎng)基。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基是適于細(xì)胞生長的培養(yǎng)基。
11.根據(jù)權(quán)利要求8到10任一所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述血紅蛋白或其部分的濃度為至少0. 050g/l，優(yōu)選為至少lg/1。
12.保存溶液，其含有根據(jù)權(quán)利要求1到5任一所述的血紅蛋白或其部分或權(quán)利要求6 所述的組合物。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的保存溶液，其中所述保存溶液是含有以下成分的水溶液電解質(zhì)，選自鉀、鈉、鎂、鈣、氯化物、硫酸鹽；任選的非滲透性物質(zhì)，選自甘露醇、棉子糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖酸和葡糖酸，和任選的膠體，選自白蛋白、羥乙基淀粉、聚乙二醇或右旋糖酐40。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的保存溶液，其中所述血紅蛋白或其部分的濃度為至少 0.150g/l。
15.用于輸送的人造氧載體，其含有根據(jù)權(quán)利要求1到5任一所述的血紅蛋白或其部分或權(quán)利要求6所述的組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及來自屬于沙蠶科的蠕蟲的分離的血紅蛋白和其在細(xì)胞培養(yǎng)基、保存溶液中的用途以及作為用于輸送的人造氧載體的用途。
文檔編號(hào)A01N1/02GK102574901SQ201080030729
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2010年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月7日
發(fā)明者D·杜戴爾, F·察爾, M·魯斯洛 申請(qǐng)人:埃瑪里納