專利名稱：組成型合成植物啟動子以及使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，具體地植物生物技術(shù)的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在農(nóng)業(yè)生物技術(shù)中，可以根據(jù)人們的需要對植物進行修飾。實現(xiàn)這一點的一種方式是通過使用現(xiàn)代基因工程技術(shù)。例如，通過將感興趣的基因引入到一種植物中，可以對該植物進行特異性修飾用來表達一種令人希望的表型性狀。為此，最通常地用包含一個啟動子區(qū)、一個編碼區(qū)以及一個終止區(qū)的異源基因來轉(zhuǎn)化這些植物。當(dāng)對異源基因進行基因工程化用于在植物中進行表達時，啟動子的選擇通常是一個關(guān)鍵因素。雖然組成地表達某些基因可能是令人希望的(即在任何時候遍及該植物并且在大多數(shù)組織和器官中)，其他基因僅應(yīng)答于特定刺激是更令人希望表達的或限于特定細胞或組織中。 已經(jīng)顯示的是與其他啟動子相比較某些啟動子能夠以更高的速率指導(dǎo)RNA合成。這些稱為“強啟動子”。已經(jīng)顯示某些其他啟動子僅在特定類型的細胞或組織中以更高的水平指導(dǎo)RNA合成，并且通常稱為“組織特異性啟動子”或“組織優(yōu)先型啟動子(tissue-preferred promoters)”,如果這些啟動子優(yōu)先地在某些組織中指導(dǎo)RNA合成(RNA合成可以在其他組織中以降低的水平發(fā)生)。因為引入到植物中的一個嵌合基因(或多個基因)的表達模式是使用啟動子來控制的，在分離出能夠控制一個嵌合基因(或多個基因)在特定組織類型中以某些水平或在特定的植物發(fā)育階段表達的新型啟動子方面存在持續(xù)的興趣。某些啟動子能夠橫跨植物的所有組織以相對類似的水平指導(dǎo)RNA合成。這些稱為“組成型啟動子”或“組織依賴型”啟動子。根據(jù)它們指導(dǎo)RNA合成的效力，可以將組成型啟動子分成強、中等和弱類型。因為在許多情況下必需在植物的不同組織中同時表達一種嵌 合基因(或多個基因)用以得到該基因(或多個基因)的希望的功能，組成型啟動子在這方面是尤其有用的。雖然許多組成型啟動子已經(jīng)從植物和植物病毒中被發(fā)現(xiàn)并且被表征，在分離出能夠控制一種嵌合基因(或多種基因)以不同水平表達和在同一轉(zhuǎn)基因植物中的多基因表達(用于基因堆疊(gene stacking))的更加新型的組成型啟動子(合成的或天然的)方面仍然存在持續(xù)的興趣。最常用的啟動子是胭脂堿合酶(NOS)啟動子(Ebert et al. Proc. Natl. Acad.Sci. USA 84:5745-5749(1987));章魚堿合酶(OCS)啟動子；花椰菜花葉病毒啟動子，例如花椰菜花葉病毒(CaMV) 19S 啟動子(Lawton et al. Plant Mol. Biol. 9:315-324 (1987))；來自核酮糖二磷酸輕化酶(rubisco)小亞基的光誘導(dǎo)型啟動子(Pellegrineschi etal. Biochem. Soc. Trans. 23 (2) : 247-250 (1995) ) ；Adh 啟動子(Walker et al. Proc. Natl.Acad. Sci. USA 84:6624-66280(1987))。蔗糖合酶啟動子(Yang et al. Proc. Natl. Acad.Sci. USA 87:414-44148(1990) ) ;R 基因復(fù)合體啟動子(Chandler et al. Plant Cell1:1175-1183(1989));葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因啟動子等。同源依賴性基因沉默(HDGS)和同源依賴性雄性不育(HDMS)是植物基因工程策略中關(guān)注的問題，且被認為是由同源轉(zhuǎn)基因和啟動子序列的多重拷貝引起的。轉(zhuǎn)基因沉默可以在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上發(fā)生(Venter, M(2007). Trends Plant Sci. 12(3) :1360-1385 ；Meyer,P and Saedler, H. (1996)Homology dependent gene silencing in plants.Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47, 23-48 ；Kooter, J. M. et al. (1999)Listening to the silent genes: transgene silencing, gene regulation, and pathogencontrol. Trends Plant Sci. 4，340-345)。重復(fù)使用具有相同核心序列以及同源插入?yún)^(qū)的順式作用元件(在一個功能結(jié)構(gòu)域中)可能引起轉(zhuǎn)錄因子耗盡，因此降低了內(nèi)源基因表達(Bhullar, S. et al. (2003)Strategies for development of functionallyequivalent promoters with minimum sequence homology for transgene expressionin plant:cis-elements in a novel DNA context versus domain swapping. PlantPhysiol. 132，988-998)。因此，在用于能夠表達不誘導(dǎo)HDGS或HDMS的異源序列的合成植物啟動子的工業(yè)中存在當(dāng)前的需要。在此披露的合成啟動子的一部分能夠在不誘導(dǎo)HDGS和HDMS的情況下起作用。另外地，在本行業(yè)中對于使用HDGS或HDMS作為在大田中選擇雜合植物的手段存在需要。在此披露的合成啟動子的一部分能夠誘導(dǎo)HDGS和HDMS。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明一方面是在植物細胞中起作用的一種合成植物啟動子，其中該合成植物啟動子的5’末端是來自玄參花葉病毒的一種增強子或來自煙草花葉病毒的一種增強子，并且其中當(dāng)該5’末端是來自玄參花葉病毒的增強子時，該合成植物啟動子的3’末端是來自煙草花葉病毒的增強子，或者當(dāng)該5’末端是來自煙草花葉病毒的增強子時，該3’末端是來自玄參花葉病毒的增強子。在另一方面，該合成植物啟動子具有一種任選的Kozak序列，該序列延伸超出該合成植物啟動子的3’末端。在該合成植物啟動子的另一方面,該來自玄參花葉病毒的增強子包含SEQ IDNO : I并且該來自煙草花葉病毒的增強子包含SEQ ID NO :2。在本發(fā)明的又另一方面中，該合成植物啟動子包含SEQ ID N0:3。在又另一個方面，該合成植物啟動子包含SEQ ID NO :4。在本發(fā)明的另外又另一方面中，該合成植物啟動子包含SEQID N0:5。在另一方面，該合成植物啟動子包含SEQ ID NO :6。在又另一方面中，該合成植物啟動子包含SEQ ID N0:7。在另外又另一方面中，該合成植物啟動子包含SEQ ID NO :8。在又另一方面中，該合成植物啟動子包含SEQ ID N0:9。本發(fā)明的另一方面是構(gòu)建在植物中起作用的合成植物啟動子的一種方法，包括以下步驟(a)獲得來自玄參花葉病毒的一種增強子和來自煙草花葉病毒的一種增強子，以及任選地選自下組的一種或多種核苷酸序列，其組成為增強子、啟動子、外顯子、內(nèi)含子、和其他調(diào)節(jié)序列；(b)可操作地連接該來自玄參花葉病毒的增強子、該一種或多種任選的核苷酸序列、以及該來自煙草花葉病毒的增強子，因此產(chǎn)生在植物中起作用的合成植物啟動子，其中該合成植物啟動子的5’末端是來自玄參花葉病毒的增強子或來自煙草花葉病毒的增強子，并且其中當(dāng)所述5’末端是來自玄參花葉病毒的增強子時，該合成植物啟動子的3’末端是來自煙草花葉病毒的增強子，或者當(dāng)所述5’末端是來自煙草花葉病毒的增強子時，該合成植物啟動子的3’末端是來自玄參花葉病毒的增強子，并且其中該一種或多種任選的核苷酸序列定位在這些增強子之間。本發(fā)明的又另一方面，該來自玄參花葉病毒的增強子包含SEQ ID NO: I并且該來自煙草花葉病毒的增強子包含SEQ ID NO :2。在又另一方面中，步驟(b)的產(chǎn)物包含SEQ ID N0:3。在本發(fā)明的另一方面中，步驟(b)的產(chǎn)物包含SEQ ID N0:4。在又另一方面中，步驟(b)的產(chǎn)物包含SEQ ID NO :5。在又另一方面中，步驟(b)的產(chǎn)物包含SEQID N0:6。在又另一方面中，步驟(b)的產(chǎn)物包含SEQ ID NO :7。在另外又另一方面中，步驟(b)的產(chǎn)物包含SEQ ID N0:8。在又另一方面中，步驟(b)的產(chǎn)物包含 SEQ ID NO 9o本發(fā)明的又另一方面是在植物、植物細胞、或植物組織中表達異源基因的一種方法，包括(a )根據(jù)上面的方法構(gòu)建一種表達盒，其中該表達盒在植物、植物細胞、或植物組織中起作用；以及(b)產(chǎn)生包含該表達盒的植物、植物細胞、或植物組織，或者其一部分，其中該異源基因被表達。在另一方面，該異源基因包含對除草劑耐受性性狀進行編碼的核苷酸序列。在又另一方面，對除草劑耐受性性狀進行編碼的該核苷酸序列包含對HPH)耐受性進行編碼的核苷酸序列。在又另一方面，該合成植物啟動子被操縱用來優(yōu)化表達。在又另一方面，該合成植物啟動子被操縱用來降低表達。在另一方面，該合成植物啟動子被操縱用來增加表達。在又另一方面，該植物、植物細胞、或植物組織，或者其一部分是一種單子葉植物。在又另一方面，該植物、植物細胞或植物組織，或者其一部分是玉米。在另外又另一方面，該植物、植物細胞、或植物組織，或者其一部分是一種雙子葉植物。在又另一方面，該植物、植 物細胞、或植物組織，或者其一部分是大豆。本發(fā)明的另一方面是選擇雄性不育植物的一種方法，包括(a)構(gòu)建包含可操作地連接到異源基因上的合成植物啟動子的一種表達盒，其中該合成植物啟動子的5’末端包含SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2，并且其中當(dāng)該5’末端是SEQ ID NO 1時，該合成植物啟動子的3’末端包含SEQ ID NO :2，或者當(dāng)該5’末端是SEQ ID NO :2時，該合成植物啟動子的3’末端是SEQ ID NO :1，并且其中該合成植物啟動子在植物細胞中起作用；(b)產(chǎn)生包含該表達盒的植物、植物細胞、或植物組織，或者其一部分，其中該異源基因被過表達，并且其中這樣的過表達誘導(dǎo)雄性不育；以及(c)選擇雄性不育植物。在另一方面，該合成植物啟動子是選自下組，其組成為SEQ ID NO :4和6。在又另一方面，該異源基因包含對除草劑耐受性性狀進行編碼的核苷酸序列。在又另一方面，對除草劑耐受性性狀進行編碼的核苷酸序列包含對HPro耐受性進行編碼的核苷酸序列。本發(fā)明的又另一方面是選擇雜合植物的一種方法，包括(a)構(gòu)建包含可操作地連接到異源基因上的合成植物啟動子的一種表達盒，其中該合成植物啟動子的5’末端包含SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2，并且其中當(dāng)該5’末端是SEQ ID NO :I時，該合成植物啟動子的3’末端包含SEQ ID NO :2，或者當(dāng)該5’末端是SEQ ID NO 2時，該合成植物啟動子的3’末端是SEQ ID NO :1，并且其中該合成植物啟動子在植物細胞中起作用；(b)產(chǎn)生包含該表達盒的植物、植物細胞、或植物組織，或者其一部分，其中在純合植物中該異源基因被過表達，并且其中這樣的過表達誘導(dǎo)基因沉默；以及(c)選擇雜合植物。在另一方面，該合成植物啟動子是選自下組，其組成為SEQ ID NO :4和6。在又另一方面，該異源基因包含對除草劑耐受性性狀進行編碼的一種核苷酸序列。在另外又另一方面，對除草劑耐受性性狀進行編碼的該核苷酸序列包含對HPH)耐受性進行編碼的核苷酸序列。參考下面的說明和所附的權(quán)利要求可以更好地理解本發(fā)明的這些和其他的特征、方面和優(yōu)勢。序列表中序列的簡要說明
SEQ ID NO :1是玄參花葉病毒增強子eFMV_03的核苷酸序列。SEQ ID NO :2是煙草花葉病毒增強子eTMV_02的核苷酸序列。SEQ ID NO :3是合成植物啟動子的核苷酸序列。SEQ ID NO :4是合成植物啟動子的核苷酸序列。SEQ ID NO :5是合成植物啟動子的核苷酸序列。SEQ ID NO :6是合成植物啟動子的核苷酸序列。SEQ ID NO :7是合成植物啟動子的核苷酸序列。SEQ ID NO :8是合成植物啟動子的核苷酸序列。 SEQ ID NO :9是合成植物啟動子的核苷酸序列。SEQ ID NO :10是野生型夜香樹病毒啟動子(cestrum virus promoter)的核苷酸序列。定義術(shù)語“開放閱讀框”和“0RF”是指在編碼序列的翻譯起始和終止密碼子之間編碼的氨基酸序列。術(shù)語“起始密碼子”和“終止密碼子”是指在編碼序列中三個鄰接核苷酸單元(“密碼子”)，它們分別限定蛋白合成(mRNA翻譯)的起始和鏈終止。術(shù)語“核酸”是指高分子量的多核苷酸，它可以是單鏈或雙鏈的，由包含糖、磷酸鹽和作為嘌呤亦或嘧啶的堿基的單體(核苷酸)所組成?！昂怂崞巍笔墙o定核酸分子的一部分。在高等植物中，脫氧核糖核酸(DNA)是遺傳物質(zhì)，而核糖核酸(RNA)涉及將DNA中包含的信息轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)中?！盎蚪M”是在生物體的每個細胞中包含的遺傳物質(zhì)的整體。術(shù)語“核苷酸序列”是指可以是單鏈或雙鏈的DNA或RNA的聚合物，任選地包含能夠結(jié)合到DNA或RNA聚合物中的合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基。除非另有說明，本發(fā)明的特定核酸序列也暗含地包括其保守修飾的變異體(例如簡并密碼子取代)，和互補序列以及明確指示的序列。具體地，可以通過產(chǎn)生其中用混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代一個或多個所選的(或全部)密碼子的第三位置的序列來實現(xiàn)簡并密碼子取代(Batzer, et al. NucleicAcid Res.19:5081 (1991);Ohtsuka, et al.J.Biol.Chem. 260:2605-2608(1985) ;andRossolini, et al. Mol. Cell. Probes 8:91-98(1994))。術(shù)語核酸與基因、cDNA 以及由基因編碼的mRNA可互換地使用。“可操作地連接”是指在一個單個核酸片段上核酸序列的結(jié)合，從而使得一個的功能受另一個的影響。例如，當(dāng)啟動子能夠影響一個編碼序列或功能性RNA的表達時，使該啟動子與該編碼序列或功能性RNA可操作地連接(即該編碼序列或功能性RNA是在該啟動子的轉(zhuǎn)錄控制之下)。在正義或反義方向上的編碼序列可以可操作地連接到調(diào)節(jié)序列上?！皢幼印笔侵竿ㄟ^提供對于正確轉(zhuǎn)錄所要求的RNA聚合酶和其他因子的識別來控制編碼序列表達的核苷酸序列?！皢幼诱{(diào)節(jié)序列”由近端的和更遠端的上游元件組成。啟動子調(diào)節(jié)序列影響轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性，或相關(guān)編碼序列的翻譯。這些調(diào)節(jié)序列包括增強子、非翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子、以及多腺苷酸化信號序列。它們包括天然和合成序列以及可以是合成和天然序列的組合的序列。術(shù)語“啟動子”的含義包括“啟動子調(diào)節(jié)序列”?！霸鰪娮印笔强梢源碳幼踊钚缘暮塑账嵝蛄?，并可以是啟動子的固有元件或被插入用來增強啟動子的水平或組織特異性的異源元件。一級序列可以存在于雙鏈DNA分子的任一條鏈上，并且甚至當(dāng)置于離開啟動子的上游亦或下游時也能夠起作用?！稗D(zhuǎn)錄增強子”起作用因為它增加了從DNA分子翻譯的信使RNA (mRNA)轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量?！胺g增強子”起作用因為它增加了從該mRNA分子翻譯的蛋白的數(shù)量?！盎颉笔侵副磉_mRNA、功能性RNA、或特異性蛋白的核酸片段，包括調(diào)節(jié)序列。術(shù)語“天然基因”是指在自然中發(fā)現(xiàn)的基因。術(shù)語“嵌合基因”是指其任何基因，該基因包括I) DNA序列，包括未在自然中一起發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)序列和編碼序列，或2)對非天然鄰接的蛋白部分進行編碼的序列，或3)非天然鄰接的啟動子部分。因此，嵌合基因可以包含從不同來源得到的調(diào)節(jié)序列和編碼序列，或包含從相同來源得到的但以與自然發(fā)現(xiàn)不同的方式安排的調(diào)節(jié)序列和編碼序列?！稗D(zhuǎn)基因”是指通過轉(zhuǎn)化引入到基因組中并且穩(wěn)定地維持的基因。轉(zhuǎn)基因可以包括例如與有待轉(zhuǎn)化的特定植物的基因異源或者同源的基因。另外，轉(zhuǎn)基因可以包含插入生物體中的天然基因。轉(zhuǎn)基因可以是嵌合基因。術(shù)語“內(nèi)源基因”是指在生物體的基因組中在其天然位置中的天然基因?！巴鈦怼被蚴侵刚５卦谒拗魃矬w中未發(fā)現(xiàn)的，但通過基因轉(zhuǎn)移引入到該生物體中的基因。如在此使用的“表達盒”是指能夠指導(dǎo)特定核苷酸序列在適當(dāng)?shù)乃拗骷毎斜磉_的DNA序列，包括可操作地連接到可操作地連接到終止信號上的感興趣的核苷酸序列上的 啟動子。它還典型地包括核苷酸序列正確翻譯所要求的序列。編碼區(qū)通常對感興趣的蛋白進行編碼，但也可以對感興趣的功能性RNA進行編碼，例如在正義或反義方向上的反義RNA或未翻譯的RNA。包含感興趣的核苷酸序列的表達盒可以是嵌合的，是指它的組分中至少一項相對于它的其他組分中的至少一項是異源的。“內(nèi)含子”是指DNA的插入部分，它幾乎僅出現(xiàn)在真核基因內(nèi)，但是在基因產(chǎn)物中它不被翻譯成氨基酸順序。通過稱為剪接的過程從未成熟的mRNA中去除內(nèi)含子(該過程留下外顯子不受影響)從而形成一種mRNA。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“內(nèi)含子”的定義包括對從靶基因得到的內(nèi)含子的核苷酸序列進行修飾，其條件是該修飾的內(nèi)含子不顯著地減少其關(guān)聯(lián)的5’調(diào)節(jié)序列的活性?！巴怙@子”是指攜帶針對蛋白或它的一部分的編碼碼序列的DNA的部分。通過插入的非編碼序列(內(nèi)含子)將外顯子分開。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“外顯子”的定義包括對從靶基因得到的外顯子的核苷酸序列進行修飾，其條件是該修飾的外顯子不顯著地減少其關(guān)聯(lián)的5’調(diào)節(jié)序列的活性?；虻谋磉_或過表達涉及基因的轉(zhuǎn)錄和mRNA翻譯成前體或成熟蛋白。“反義抑制”是指生產(chǎn)能夠抑制靶蛋白表達的反義RNA轉(zhuǎn)錄本?！斑^表達”是指在轉(zhuǎn)基因生物體中生產(chǎn)超出在正?；蚍寝D(zhuǎn)化生物體中生產(chǎn)水平的基因產(chǎn)物?！肮惨种啤笔侵干a(chǎn)能夠抑制相同或基本類似的外來或外源基因的表達或轉(zhuǎn)錄本積累的正義RNA轉(zhuǎn)錄本。該共抑制的機制可以是在DNA水平(如DNA甲基化)、在轉(zhuǎn)錄水平、或在轉(zhuǎn)錄后水平。術(shù)語“組成型啟動子”是指在所有或較多發(fā)育階段在植物的所有或大多數(shù)組織中有活性的啟動子。與分類為組成型的其他啟動子一樣，表達絕對水平的一些改變可以存在于不同組織或階段中。在此，術(shù)語“組成型啟動子”或“組織依賴性的”可互換地使用。當(dāng)與核酸相聯(lián)系使用時，術(shù)語“分離的”是指被鑒定并且與至少一種污染物核酸分開的核酸序列，在其天然來源中它通常與該污染物核酸相關(guān)聯(lián)。分離的核酸以與它在自然界中發(fā)現(xiàn)所處的不同形式或設(shè)置存在。相反地，未分離的核酸，例如以這種狀態(tài)發(fā)現(xiàn)的DNA和RNA，它們以自然形式存在。分離的核酸可以在轉(zhuǎn)基因植物中并且仍然被認為是“分離的”。在此術(shù)語“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“核酸序列”和“核酸片段” / “分離的核酸片段”可互換地使用。這些術(shù)語包括核苷酸序列等。多核苷酸可以是單鏈或雙鏈RNA或DNA的聚合物，該聚合物任選地包含合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基。處于DNA聚合物形式的多核苷酸可以包括cDNA、基因組DNA、合成DNA、或其混合物的一種或多種區(qū)段。通過以下一個單字母指示來提及核苷酸(通常以它們的5’單磷酸鹽形式發(fā)現(xiàn)):“A”為腺苷酸或者脫氧腺苷酸(分別用于RNA或DNA)，“C ”為胞苷酸或者脫氧胞苷酸，“G”為鳥苷酸或脫氧鳥苷酸，“U”為尿苷酸，“T”為脫氧胸苷酸，“R”為嘌呤類(A或G)，“Y”為嘧啶類(C或T)，“K”為G或Τ，“H”為A或C或Τ，“I”為肌苷，并且“N”為任何核苷酸?！爱愒春怂崞巍笔侵覆慌c本發(fā)明的合成植物啟動子序列一起天然出現(xiàn)的序列。當(dāng) 該核苷酸序列是與該啟動子序列異源時，對于該植物宿主而言它可以是同源的、或天然的、或異源的、或外來的。如在此使用的術(shù)語“基本上類似”是指這些核酸片段，其中在一個或多個核苷酸堿基中的改變不影響該核酸片段調(diào)節(jié)基因表達或產(chǎn)生某一表型的能力。該術(shù)語也指本發(fā)明核酸片段的修飾，例如相對于初始未修飾片段不顯著地改變所獲得的核酸片段的功能特性的一個或多個核苷酸的缺失或插入。因此應(yīng)當(dāng)理解的是(如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所應(yīng)當(dāng)理解的)本發(fā)明包括多于這些具體示例的序列?！?’非編碼序列”是指位于編碼序列下游的DNA序列并包括多聚腺苷化識別序列以及編碼能夠影響mRNA加工或基因表達的調(diào)節(jié)信號的其他序列。多聚腺苷化信號通常特征為將多聚腺苷酸束(polyadenylic acid tracts)添加到mRNA前體的3’末端上。Ingelbrecht et al. Plant Celll :671-680 (1989)舉例說明了不同 3’ 非編碼序列的用途?！稗D(zhuǎn)化”是指將一種核酸片段轉(zhuǎn)移到宿主生物的基因組中，導(dǎo)致基因穩(wěn)定地遺傳。含有這些轉(zhuǎn)化的核酸片段的宿主生物稱為“轉(zhuǎn)基因”生物?！八矔r表達”是指常見報告基因例如葡糖醛酸糖苷酶(⑶S)、熒光蛋白基因GFP,ZS-YELLOffl N1、AM_CYAN1、DS_RED在其中通過轉(zhuǎn)化方法暫時地引入轉(zhuǎn)基因的宿主生物的選定的某些細胞類型中的臨時表達。在此使用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的，并在Sambrook，J.et al.In Molecular Cloning:A Laboratory Manual;2nd ed. ;Cold Spring HarborLaboratory Press:Cold Spring Harbor, N. Y. 1989 (下文 “Sambrook et al.1989，，)或 Ausubelj F. M. Brent, R. Kingston, R. E. Moore, D. D. Seidmanj J. G. Smith, J. A. andStruhlj K. Eds. ;In Current Protocols in Molecular Biology;John Wiley and Sons:NewYork，1990 (下文 “Ausubel et al. 1990”)中更全面地說明?！癙CR”或“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”是用于合成大量特異性DNA片段的一種技術(shù)，由一系列重復(fù)循環(huán)組成(Perkin Elmer Cetus Instruments，Norwalk，Conn.)。典型地，將雙鏈DNA加熱變性，在低溫下使與目標(biāo)片段的3’邊緣互補的兩個引物退火，并且然后在中間溫度下延伸。這三個連續(xù)步驟的一組構(gòu)成一個循環(huán)。
具體實施方式
在此披露的合成植物啟動子核苷酸序列和方法在調(diào)節(jié)任何異源核酸序列在宿主植物中表達方面是有用的，從而改變植物的表型。表型的多種改變是令人感興趣的包括但不限于改變植物中的脂肪酸組成、改變植物的氨基酸含量、改變植物的病原體防御體系等。這些結(jié)果可以通過提供在植物中異源產(chǎn)物的表達或內(nèi)源產(chǎn)物增加的表達來實現(xiàn)?？商娲兀@些結(jié)果可以通過提供在植物中一種或多種內(nèi)源產(chǎn)物，特別地酶或輔因子的降低表達來實現(xiàn)。這些改變導(dǎo)致轉(zhuǎn)化植物表型的改變。感興趣的基因反映了涉及作物開發(fā)那些的商業(yè)市場以及興趣。感興趣的作物和市場改變，以及當(dāng)發(fā)展中國家對國際市場開放時，也將出現(xiàn)新的作物和技術(shù)。此外，隨著我們對農(nóng)學(xué)特征和性狀(如產(chǎn)量和雜種優(yōu)勢)的理解增加，因此選擇用于轉(zhuǎn)化的基因也將改變。轉(zhuǎn)基因(也稱為異源基因)的種類包括例如，但不限于，對重要的農(nóng)學(xué)性狀、昆蟲耐受性、疾病耐受性、除草劑耐受性、不育性、顆?；蚍N子特征進行編碼的基因，以及商業(yè)產(chǎn)品。通常地，感興趣的基因包括涉及油、淀粉、碳水化合物或營養(yǎng)物代謝的那些以及影響種子大小、 植物發(fā)育、植物生長調(diào)節(jié)、以及產(chǎn)量提高的那些。植物發(fā)育和生長調(diào)節(jié)也涉及植物不同部分(例如花、種子、根、葉和枝)的發(fā)育和生長調(diào)節(jié)。其他商業(yè)上令人希望的性狀是提供冷、熱、鹽、以及干旱耐受性的基因和蛋白。疾病和/或昆蟲耐受性基因可以編碼針對具有較大產(chǎn)量阻礙作用害蟲的耐受性，像例如炭疽病、大豆花葉病毒，大豆胞囊線蟲、根結(jié)線蟲、褐色葉斑病(brown leafspot)、霜霉病、紫斑病(purple seed stain)、種子腐敗(seed decay)、以及通常由真菌腐霉菌(Pythium sp.)、疫霉菌(Phytophthora sp.)、絲核菌(Rhizoctonia sp·)、間座殼菌(Diaporthe sp.)引起的幼苗病，由細菌丁香假單胞菌大豆致病變種(Pseudomonassyringae pv. Glycinea)所引起的細菌性枯萎病。提供昆蟲耐受性的基因包括，例如，蘇云金芽孢桿菌毒蛋白基因(U. S. Pat. Nos. 5，366,892 ;5，747,450 ;5，737,514 ;5，723，756 ；5，593，881 ;和 Geiser et al (1986)Gene48:109);外源凝集素類(lectins) (Van Dammeet al. (1994)Plant Mol. Biol. 24:825);植物性殺蟲蛋白類(vegetative insecticidalproteins) (VIP3C, U. S. Pat. No. 7，378，493)等。除草劑耐受性性狀可以包括對作用是抑制乙酰乳酸合酶(ALS)作用的除草劑(尤其是磺酰脲型除草劑)的耐受性進行編碼的基因(例如含有導(dǎo)致這樣耐受性的突變的乙酰乳酸合酶ALS基因，具體地是S4和/或HRA突變)。ALS-基因突變體編碼對除草劑氯磺隆(chlorosulfuron)的耐受性。草甘膦乙酰轉(zhuǎn)移酶(GAT)是來自地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)的一種N-乙酰轉(zhuǎn)移酶，通過基因改組對它進行優(yōu)化用于對廣譜除草齊U (草甘膦)進行乙?；?，這形成了在轉(zhuǎn)基因植物中草甘膦耐受性新機制的基礎(chǔ)(Castleet al. (2004) Science304，1151-1154)。其他除草劑耐受性性狀，包括但不限于，EPSPS(U. S. Pat. No. 6，248，076),Bar(U. S. Pat. No. 6，025，545)、和 HPPDCU. S. Pat. No. 7，312，379)對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言顯然是可以使用的。本發(fā)明包括用至少一種有利的轉(zhuǎn)基因來轉(zhuǎn)化受體細胞。可以使用截然不同的轉(zhuǎn)基因編碼載體亦或結(jié)合了兩個或多個基因編碼序列的一個單個載體在一個單個轉(zhuǎn)化事件中提供兩種或多種轉(zhuǎn)基因。根據(jù)需要可以使用任何說明的任何兩種或多種轉(zhuǎn)基因，例如提供除草劑、昆蟲、疾病(病毒、細菌、真菌和線蟲)或干旱耐受性，油的數(shù)量和質(zhì)量的那些，或增加產(chǎn)量或營養(yǎng)品質(zhì)的那些?？梢詫Ρ景l(fā)明的合成植物啟動子序列進行修飾用來提供該異源核苷酸序列一定范圍的組成型表達水平。因此，可以利用少于整個合成植物啟動子區(qū)域，并且保持驅(qū)動該編碼序列表達的能力。然而，應(yīng)當(dāng)認識到可以通過缺失這些合成植物啟動子序列的部分來降低該mRNA的表達水平。因此，如本說明書舉例說明的，與SEQ ID NO 3具有80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或 99% 一致性的SEQ IDNO :3片段仍然可以起作用。本發(fā)明包含的還有本發(fā)明合成植物啟 動子的功能等效物，即在嚴格條件下雜交到SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、或SEQ ID NO :9中的任何一個上的核苷酸序列。嚴格雜交是在65° C，優(yōu)選地60° C，并最優(yōu)選55° C的溫度下在包含O. 1%SDS的兩倍濃度(2X)的檸檬酸鹽緩沖鹽水(SSC)中完成的，緊接著在相同溫度下但是用具有降低的SSC濃度的緩沖液沖洗載體(support)。這類降低濃度的緩沖液典型地是包含O. 1%SDS的十分之一濃度的SSC(0. IX SSC)，優(yōu)選包含O. 1%SSC的O. 2X SSC,并且最優(yōu)選包含O. 1%SDS的一半濃度的SSC (O. 5XSSC)。
實施例實施例I.將病毒增強子元件與植物組分結(jié)合用來產(chǎn)生合成植物啟動子為了在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的大豆中表達合成燕麥(Avena sativa) 4_輕苯丙酮酸二氧酶(cAvHPro)，通過PCR或直接DNA合成來產(chǎn)生病毒轉(zhuǎn)錄和翻譯的增強子以及最小啟動子，并且通過標(biāo)準(zhǔn)DNA限制性消化(restriction digestion)和連接反應(yīng)來結(jié)合。將包含限定組分eFMV (SEQ ID NO :l)、eTMV (SEQ ID NO :2)、花椰菜花葉病毒35S增強子區(qū)(e35S)以及最小啟動子(pr35SCMP :夜香樹黃曲葉病毒(Cestrum Yellow Leaf Curl virus)TATA盒基序；無CAAT 35S近端啟動子序列)的合成植物啟動子結(jié)合用來產(chǎn)生SEQ ID NO :3。隨后，通過用DNA限制酶XhoI消化來對SEQ ID NO 3進行修飾用來去除限定組分e35S、pr35SCMP(包括該TATA盒基序)，緊接著通過標(biāo)準(zhǔn)連接反應(yīng)用來產(chǎn)生SEQ ID NO :4。通過將從擬南芥泛素啟動子獲得的第一個內(nèi)含子(iUBQ3)(以一個Bgl II (5-初始末端(prime end))和BamHI (3-初始末端)DNA片段形式)連接到BamHI位點上再次對SEQ ID NO 3進行修飾，用來產(chǎn)生SEQ ID N0:5。最后，通過將擬南芥組成型啟動子(prAC26)的一個1092個堿基對的DNA片段(以一個Bgl II (5-初始末端)和BamHI (3-初始末端)的形式)連接到BamHI位點上來對SEQ ID NO :3進行修飾，用來產(chǎn)生SEQ ID NO :6。隨后將包括包含SEQ ID :3、SEQID 4,SEQ ID :5或SEQ ID :6的單個合成植物啟動子、cAvHPPD編碼區(qū)和NOS終止子(tNOS)的完成的基因盒連接到包含用于大豆轉(zhuǎn)化實驗適當(dāng)?shù)倪x擇性標(biāo)記的二元載體上。表I指示在上面所述合成植物啟動子的子元件的安排。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地識別可以適合使用的其他子元件。表I.在用于大豆的合成植物啟動子中子元件的5’至3’安排。
權(quán)利要求
1.一種在植物細胞中起作用的合成植物啟動子，其中該合成植物啟動子的5’末端是來自玄參花葉病毒的一種增強子或來自煙草花葉病毒的一種增強子，并且其中當(dāng)該5’末端是來自玄參花葉病毒的增強子時，該合成植物啟動子的3’末端是來自煙草花葉病毒的增強子，或者當(dāng)該5’末端是來自煙草花葉病毒的增強子時，該3’末端是來自玄參花葉病毒的增強子。
2.如權(quán)利要求I所述的合成植物啟動子，其中，一種可任選的Kosak序列延伸超過該合成植物啟動子的3’末端。
3.如權(quán)利要求I所述的合成植物啟動子，其中該來自玄參花葉病毒的增強子包含SEQID NO :I并且該來自從煙草花葉病毒的增強子包含SEQ ID NO :2。
4.如權(quán)利要求3所述的合成植物啟動子，其中該合成植物啟動子包含SEQID N0:3。
5.如權(quán)利要求3所述的合成植物啟動子，其中該合成植物啟動子包含SEQID N0:4。
6.如權(quán)利要求3所述的合成植物啟動子，其中該合成植物啟動子包含SEQID N0:5。
7.如權(quán)利要求3所述的合成植物啟動子，其中該合成植物啟動子包含SEQID N0:6。
8.如權(quán)利要求3所述的合成植物啟動子，其中該合成植物啟動子包含SEQID N0:7。
9.如權(quán)利要求3所述的合成植物啟動子，其中該合成植物啟動子包含SEQID N0:8。
10.如權(quán)利要求3所述的合成植物啟動子，其中該合成植物啟動子包含SEQID N0:9。
11.一種構(gòu)建在植物中起作用的合成植物啟動子的方法，該方法包括以下步驟 a)獲得來自玄參花葉病毒的一種增強子和來自煙草花葉病毒的一種增強子，以及可任選地一種或多種選自下組的核苷酸序列，其組成為增強子類、啟動子類、外顯子類、內(nèi)含子類、Kozak序列類、以及其他調(diào)節(jié)序列類； b)可操作地連接該來自玄參花葉病毒的增強子、該一種或多種可任選的核苷酸序列、以及該來自煙草花葉病毒的增強子，因此產(chǎn)生在植物中起作用的合成植物啟動子，其中該合成植物啟動子的5’末端是來自玄參花葉病毒的增強子或來自煙草花葉病毒的增強子，并且其中當(dāng)所述5’末端是來自玄參花葉病毒的增強子時，該合成植物啟動子的3’末端是來自煙草花葉病毒的增強子，或者當(dāng)所述5’末端是來自煙草花葉病毒的增強子時，該合成植物啟動子的3’末端是來自玄參花葉病毒的增強子，并且其中該一種或多種可任選的核苷酸序列定位在這些增強子之間。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中該來自玄參花葉病毒的增強子包含SEQID N01并且該來自煙草花葉病毒的增強子包含SEQ IDNO :2。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其中步驟(b)的產(chǎn)物包含SEQIDNO :3。
14.如權(quán)利要求11所述的方法，其中步驟(b)的產(chǎn)物包含SEQIDNO :4。
15.如權(quán)利要求11所述的方法，其中步驟(b)的產(chǎn)物包含SEQIDNO :5。
16.如權(quán)利要求11所述的方法，其中步驟(b)的產(chǎn)物包含SEQIDNO :6。
17.如權(quán)利要求11所述的方法，其中步驟(b)的產(chǎn)物包含SEQIDNO :7。
18.如權(quán)利要求11所述的方法，其中步驟(b)的產(chǎn)物包含SEQIDNO :8。
19.如權(quán)利要求11所述的方法，其中步驟(b)的產(chǎn)物包含SEQIDNO :9。
20.一種在植物、植物細胞或植物組織中表達異源基因的方法，包括 a)根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法構(gòu)建一種合成植物啟動子； b)可操作地將該合成植物啟動子連接到該異源基因上，由此產(chǎn)生一種表達盒，其中該表達盒在植物、植物細胞或植物組織中起作用；以及 C )產(chǎn)生包含該表達盒的植物、植物細胞或植物組織，或者其一部分，其中該異源基因被表達。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中該異源基因包含對除草劑耐受性性狀進行編碼的一種核苷酸序列。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中對除草劑耐受性性狀進行編碼的該核苷酸序列包含對HPro耐受性進行編碼的一種核苷酸序列。
23.如權(quán)利要求20所述的方法，其中該合成植物啟動子被操縱用來優(yōu)化表達。
24.如權(quán)利要求20所述的方法，其中該合成植物啟動子被操縱用來降低表達。
25.如權(quán)利要求20所述的方法，其中該合成植物啟動子被操縱用來增加表達。
26.如權(quán)利要求20所述的方法，其中該植物、植物細胞、或植物組織或者其一部分是一種單子葉植物。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中該植物、植物細胞、或植物組織或者其一部分是玉米。
28.如權(quán)利要求20所述的方法，其中該植物、植物細胞、或植物組織或者其一部分是一種雙子葉植物。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中該植物、植物細胞、或植物組織或者其一部分是大豆。
30.一種選擇雄性不育植物的方法，包括 a)構(gòu)建包含可操作地連接到異源基因上的合成植物啟動子的一種表達盒，其中該合成植物啟動子的5’末端包含SEQ ID NO :1或SEQ IDNO :2，并且其中當(dāng)該5’末端是SEQ IDNO 1時，該合成植物啟動子的3’末端包含SEQ ID NO :2，或者當(dāng)該5’末端是SEQ ID NO 2時，該合成植物啟動子的3’末端是SEQ ID NO :1，并且其中該合成植物啟動子在植物細胞中起作用； b)產(chǎn)生包含該表達盒的植物、植物細胞、或植物組織或者其一部分，其中該異源基因被過表達，并且其中這樣的過表達導(dǎo)致雄性不育；以及 c)選擇這些雄性不育植物。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中該合成植物啟動子是選自下組，其組成為SEQIDNO 4 和 6。
32.如權(quán)利要求30所述的方法，其中該異源基因包含對除草劑耐受性性狀進行編碼的一種核苷酸序列。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中對除草劑耐受性性狀進行編碼的該核苷酸序列包含對HPro耐受性進行編碼的一種核苷酸序列。
34.一種選擇雜合植物的方法，包括 a)構(gòu)建包含可操作地連接到異源基因上的合成植物啟動子的一種表達盒，其中該合成植物啟動子的5’末端包含SEQ ID NO :1或SEQ IDNO :2，并且其中當(dāng)該5’末端是SEQ IDNO 1時該合成植物啟動子的3’末端包含SEQ ID NO :2，或者當(dāng)該5’末端是SEQ ID NO 2時，該合成植物啟動子的3’末端是SEQ ID NO :1，并且其中該合成植物啟動子在植物細胞中具有功能；b)產(chǎn)生包含該表達盒的植物、植物細胞、或植物組織，或者其一部分，其中在這些純合植物中該異源基因被過表達，并且其中這樣的過表達誘導(dǎo)了基因沉默；以及 c)選擇雜合植物。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中該合成植物啟動子是選自下組，其組成為SEQIDNO :4 和 6。
36.如權(quán)利要求34所述的方法，其中該異源基因包含對除草劑耐受性性狀進行編碼的一種核苷酸序列。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中對除草劑耐受性性狀進行編碼的該核苷酸序列包含對HPro耐受性進行編碼的一種核苷酸序列。
全文摘要
在植物中(in planta)對轉(zhuǎn)基因表達的控制取決于影響mRNA轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄和翻譯兩者的基因元件。本發(fā)明描述了來自四種不同植物病毒的DNA元件的組合，這些元件在轉(zhuǎn)基因植物中作為mRNA轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄激活子和翻譯增強子起作用。
文檔編號A01H5/00GK102724866SQ201080060642
公開日2012年10月10日 申請日期2010年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月5日
發(fā)明者J·D·希普斯金德 申請人:先正達參股股份有限公司