專利名稱：植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因系統(tǒng)、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持植物的建立及種子植物無(wú)限生長(zhǎng)能力的利用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)、細(xì)胞工程、基因工程與現(xiàn)代農(nóng)業(yè)、生態(tài)建設(shè)、環(huán)保保護(hù)領(lǐng)域，具體涉及植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因系統(tǒng)、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持植物的建立及種子植物無(wú)限生長(zhǎng)能力的利用方法。
背景技術(shù)：
(一)營(yíng)養(yǎng)體利用植物在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中的作用與地位
植物提供了人類全部的食物、大部分能源(柴)、衣、住、行，以及其它主要、基本的生活品，是人類賴以生存與發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)。種子植物以其器官的性質(zhì)與功能不同，可分為營(yíng)養(yǎng)器官(vegetative organs)的根莖葉與生殖器官(!^productive organs)的花、果實(shí)與種子。植物營(yíng)養(yǎng)器官與生殖器官對(duì)于植物都非常重要，缺一不可，但其作用、地位并非對(duì)稱植物體的營(yíng)養(yǎng)器官的主要任務(wù)與功能是生產(chǎn)、制造有機(jī)物，以維持其本身的生存；而生殖器官的任務(wù)與功能則是消費(fèi)、轉(zhuǎn)化合成的有機(jī)物，進(jìn)行有性繁殖、制造新的生命、保持種的延續(xù)。植物體若沒(méi)有營(yíng)養(yǎng)器官，不可能產(chǎn)生生殖器官，產(chǎn)生有性后代；但是植物體僅有營(yíng)養(yǎng)器官而無(wú)生殖器官則是可以生存、生長(zhǎng)，并且可以生長(zhǎng)得更旺、更好，營(yíng)養(yǎng)體的生產(chǎn)效率更高，雖然不能產(chǎn)生種子，但可以通過(guò)無(wú)性方式，進(jìn)行無(wú)性繁殖。以人們利用植物器官對(duì)象、目的的不同，可將植物分為生殖器官利用植物(麥、稻、 棉、玉米、大豆、花生、油菜等)與營(yíng)養(yǎng)體利用植物(牧草，薯類、糖類、麻類作物，桑、茶、煙， 大部分蔬菜、林木、中藥材等)兩類。但此類概念并不嚴(yán)格、絕對(duì)，例如通常劃歸籽實(shí)體利用植物的黑櫻桃、核桃、梨樹等，實(shí)際上都是優(yōu)良的用材樹，也可劃歸營(yíng)養(yǎng)體植物，或者兼用植物。以糧棉油為代表的生殖器官利用植物對(duì)人類的重要性是不言而喻的；而屬于營(yíng)養(yǎng)體利用植物的菜、薯、糖、麻、絲、茶、煙、藥等農(nóng)產(chǎn)品；木材、薪炭材、漿紙材、橡膠等林產(chǎn)品； 肉、蛋、奶、毛、皮等牧草產(chǎn)品，以及生態(tài)保護(hù)、城鄉(xiāng)綠化用樹種、坪草等占據(jù)著農(nóng)林牧業(yè)產(chǎn)品的半璧江山，直接關(guān)系著人類的生活水平、健康與環(huán)境，其對(duì)于人類的價(jià)值、作用與意義可與糧棉油齊肩。(二)營(yíng)養(yǎng)器官、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)與生殖器官、生殖生長(zhǎng)的關(guān)系
對(duì)于營(yíng)養(yǎng)體利用植物而言，生殖器官的發(fā)生與形成不僅會(huì)消耗大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與能量，而且還嚴(yán)重影響目的產(chǎn)品的產(chǎn)量、質(zhì)量及其社會(huì)、環(huán)境與經(jīng)濟(jì)價(jià)值。牧草、地坪草一旦開花、結(jié)籽，就開始老化，營(yíng)養(yǎng)體就不再生長(zhǎng)、不再鮮嫩與營(yíng)養(yǎng)， 甚至死亡。所以要不斷的剎割、修剪，以便使其持續(xù)保持旺盛的生長(zhǎng)狀態(tài)。甘蔗、甜菜、蘿卜、菠菜、萵苣等植物開花，就會(huì)嚴(yán)重影響其產(chǎn)量、質(zhì)量，甚至完全喪失食用或商品價(jià)值。
紅麻、黃麻、青麻、大麻、苧麻、亞麻等麻類作物一開花，植株就不再長(zhǎng)高，嚴(yán)重制約
著其質(zhì)量與產(chǎn)量。用材林、薪炭林、漿紙林、生態(tài)林、橡膠林等樹種生殖器官的發(fā)生與存在，不僅消耗大量養(yǎng)分與能量，還嚴(yán)重影響其目的產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)體的生產(chǎn)效率、產(chǎn)量。橡膠樹因長(zhǎng)期、反復(fù)無(wú)性繁殖，造成樹體老化，產(chǎn)量大幅度降低，嚴(yán)重困擾著橡膠產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。一般優(yōu)質(zhì)煙草葉數(shù)達(dá)到觀 32片就開花了，中間的商品葉僅為18 20片。因此，利用現(xiàn)有技術(shù)難以提高煙葉片數(shù)量及產(chǎn)量。楊樹、柳樹、懸鈴木是我國(guó)北方的城鄉(xiāng)主要綠化樹種，其果實(shí)、種子(楊柳飛絮、懸鈴木的毛毛雨、花粉過(guò)敏)會(huì)造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染，危害人們的身體健康。采用常規(guī)農(nóng)業(yè)措施，包括進(jìn)一步提高水、肥、光、溫等的作用已無(wú)太大的能力；而激素(包括植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、殺雄劑)、管理(人工修剪、打頂、摘除)等，則需要年年、季季，甚至經(jīng)常、不斷的處理，都不能從根本上解決問(wèn)題，而且需耗費(fèi)大量的時(shí)間、人力、機(jī)械，甚至污染環(huán)境，成本高、效果有限。以常規(guī)育種技術(shù)、雜種優(yōu)勢(shì)利用途徑，以及物理、化學(xué)誘變途徑、染色體倍性育種等都能不同程度的提高這些植物營(yíng)養(yǎng)體產(chǎn)量與質(zhì)量。這是迄今的主流途徑，依然有能力可挖，但進(jìn)展緩慢，沒(méi)有實(shí)質(zhì)性突破。能否建立一套技術(shù)系統(tǒng)使植物營(yíng)養(yǎng)體的產(chǎn)量獲得更大幅度的提高是擺在人類面前、亟待解決的、直接關(guān)系到人們?nèi)祟惖氖称?、健康、能源、材料與環(huán)境等基本問(wèn)題。(三)植物生長(zhǎng)能力的概念及其利用
人們知道，甘蔗、薯類作物、姜、蒜、山藥、地黃以及竹子等通常都是通過(guò)其(塊)根、(塊) 莖繁殖的；蘋果、柑橘等優(yōu)良品種一般都是通過(guò)嫁接繁殖的；葡萄、泡桐、楊、柳、懸鈴木等都是通過(guò)扦插、埋根、壓條等方法繁殖的；而大多數(shù)植物都是可以通過(guò)組織培養(yǎng)繁殖的。這表明，植物體可以持久地保持、延續(xù)下去。但這些現(xiàn)象僅是植物生長(zhǎng)能力的有限體現(xiàn)。對(duì)植物生長(zhǎng)能力及其特性的研究可以追溯到18世紀(jì)中葉。1868年韓士汀(J. von Hanstein)提出了組織原學(xué)說(shuō)(histogen theory) ； 19 年史密特(A. Schmidt)提出了原套-原體學(xué)說(shuō)(tunica — corpustheory)。一個(gè)多世紀(jì)以來(lái)對(duì)植物形態(tài)發(fā)生中有關(guān)極性、對(duì)稱和相關(guān)性，特別是分化和再生，以及植物頂端分生組織的細(xì)胞分裂、組織分化和器官發(fā)生的機(jī)理及其分子生物學(xué)基礎(chǔ)進(jìn)行了詳盡研究，并早有定論植物具有無(wú)限生長(zhǎng)能力。國(guó)際著名植物學(xué)家Lincoln Taiz和Eduardo kiger等著、國(guó)際植物生物學(xué)領(lǐng)域的重要教科書《植物生理學(xué)》中載明“與動(dòng)物發(fā)育不同，植物發(fā)育是一個(gè)持續(xù)進(jìn)行的過(guò)程。 營(yíng)養(yǎng)體的分生組織具有高度重覆性一它們不斷地產(chǎn)生相同或相似的結(jié)構(gòu)，而且它們的活動(dòng)是無(wú)限延續(xù)下去的。這種現(xiàn)象稱為無(wú)限生長(zhǎng)(indeterminate grouth)”。有些研究者則得出植物具有“持續(xù)生長(zhǎng)能力(are capable of continued cellular division)”的結(jié)論。 維基百科在“分生組織”條目下甚至使用了更為肯定的表述方式植物在理論上有著潛在的永生能力“永生能力”(immortality)，而其中的主角是分生組織(http://zh. wikipedia. org/zh-cn/%E5%88%86%E7%94%9F%E7%BB%84%E7%BB%87, http//en. wikipedia. org/wiki/ Meristem)。植物生長(zhǎng)能力的無(wú)限性來(lái)源于植物莖端分生組織特殊的結(jié)構(gòu)、特性與功能。植物莖端存在著來(lái)源于胚胎發(fā)育時(shí)期、具有持續(xù)分生能力的“營(yíng)養(yǎng)莖端分生組織(vegetative apical meristem)”。這是一群自我永續(xù)的細(xì)胞一它的一個(gè)細(xì)胞分裂后形成2個(gè)細(xì)胞，其中一個(gè)保留在原位，使莖端分生組織的體積保持不變；另一個(gè)細(xì)胞進(jìn)一步分裂分化，形成植物地上部分各類不同器官的細(xì)胞組分，其中包括莖、葉、腋芽與花器官的各個(gè)部分。在植物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期，其莖端分生組織處于營(yíng)養(yǎng)分生組織狀態(tài)，可以不斷的產(chǎn)生相同或相似的結(jié)構(gòu)，而且它們的活動(dòng)是無(wú)限延續(xù)下去的，其結(jié)果是莖端分生組織可以持續(xù)不斷產(chǎn)生、形成新的、由節(jié)、葉、腋芽的原基構(gòu)成的葉體節(jié)。形成的葉體節(jié)不斷伸長(zhǎng)，發(fā)育成成熟的節(jié)、葉、腋芽。從而使植物體由低到高、由小到大，持續(xù)生長(zhǎng)。但是，植物的這種“無(wú)限生長(zhǎng)”能力在正常植物中是被程序化的固定在植物的生命周期中了，并不能無(wú)限的持續(xù)下去。當(dāng)植物體發(fā)育到一定階段、在一定的環(huán)境條件下，植物莖端營(yíng)養(yǎng)分生組織就會(huì)被異化為“生殖分生組織(!^productive meristem) ”細(xì)胞，并開始改變生長(zhǎng)發(fā)育的方向，進(jìn)入生殖生長(zhǎng)階段。生殖分生組織經(jīng)分化、發(fā)育成生殖器官花、果實(shí)、種子。在花的形成過(guò)程中會(huì)耗盡所有的未分化的細(xì)胞，終結(jié)了分生能力，因此一旦開花就意味著此生命周期的完成、終結(jié)。植物的“無(wú)限生長(zhǎng)”能力在其生命周期的框架內(nèi)，僅能以“潛在”的形式存在，或以其“有限能力”表現(xiàn)。(四)關(guān)于細(xì)胞致死因子基因或基因裝置
表達(dá)、或代謝物能直接或間接抑制、干擾細(xì)胞基礎(chǔ)代謝、導(dǎo)致細(xì)胞死亡的基因或基因裝置有多種，例如DNA酶、RNA酶、核糖體失活蛋白以及基礎(chǔ)、關(guān)鍵代謝酶基因RNA干擾體等，其中僅核糖核酸內(nèi)切酶酶(RNA酶)就有來(lái)源于擬南芥的RNS1、RNS2、RNS3等、來(lái)源于解淀粉芽孢桿菌的Barnase。擬南芥RNS1、RNS2、RNS3等來(lái)自植物的核糖核酸內(nèi)切酶基因，在植物中應(yīng)用不存在表達(dá)障礙。Barnase為經(jīng)典、優(yōu)良的核糖核酸內(nèi)切酶基因，活性特別強(qiáng)，細(xì)胞中只要有一個(gè)拷貝，就可以導(dǎo)致其宿主細(xì)胞自殺，但該基因的表達(dá)、控制的機(jī)制尚不完全清楚， 其編碼基因單獨(dú)存在于原核生物細(xì)胞時(shí)，會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性，導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡(見核糖核酸酶barnase基因的克隆策略研究宋洪元，丁建剛，宋明西北植物學(xué)報(bào)2005 25 (6))。 這一問(wèn)題長(zhǎng)期誤導(dǎo)、困擾著一些研究者。隨著分子生物學(xué)與基因工程的研究的發(fā)展，已建立了多種可能解決這一難題的途徑。(五)關(guān)于啟動(dòng)子的研究情況
在過(guò)去的相關(guān)研究與文獻(xiàn)中曾使用過(guò)一些與植物生殖生長(zhǎng)相關(guān)基因及其啟動(dòng)子，例如 LFY等，“但隨著研究的深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)，一些過(guò)去被認(rèn)為這些在“花分生組織”和“花序分生組織”中特異表達(dá)的“分生組織特征決定基因”，大部分都不用程度地在“營(yíng)養(yǎng)分生組織”甚至“胚胎發(fā)生”過(guò)程中表達(dá)”?！盁煵荨ⅧP仙花、豌豆、矮牽牛、水稻、松樹等植物中，LFY 類基因的表達(dá)并不局限于花分生組織，而是廣泛地存在于不同發(fā)育階段的莖端分生組織； 更重要的是，后來(lái)的研究表明，即使在擬南芥中，LFY基因?qū)嶋H上在其早期的發(fā)育階段，即在花序分生組織形成之前，已經(jīng)在莖端分生組織中表達(dá)” ；“LFY基因的啟動(dòng)子不僅在種子萌發(fā)后不同階段的莖端分生組織和幼小的器官原基中表達(dá)，而且在早期胚胎發(fā)生過(guò)程中也有表達(dá)”(LFY類基因在莖端分生組織形成及其活動(dòng)中的作用，劉曼北京大學(xué)政學(xué)者論文集 2001 年)。目前，該領(lǐng)域研究已取得重要進(jìn)展，為其應(yīng)用提供了全新概念、方向與選擇。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因系統(tǒng)、公開了一種種子植物無(wú)限生長(zhǎng)能力利用方法、提出了一種營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持植物的建立方法。本發(fā)明建立的種子植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因系統(tǒng)，可以利用植物無(wú)限生長(zhǎng)能力，創(chuàng)造出新型高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)體利用植物一營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持植物；同時(shí)從根本上避免一些植物產(chǎn)生的花粉或果實(shí)等對(duì)人體與環(huán)境所帶來(lái)的危害。(一)種子植物無(wú)限生長(zhǎng)能力利用及其利用技術(shù)途徑與方法 1.種子植物無(wú)限生長(zhǎng)能力利用的目的
植物無(wú)限生長(zhǎng)能力的表現(xiàn)是多方面的，可以從多方面加以利用。對(duì)于植物無(wú)限生長(zhǎng)能力的利用可因利用者目的的不同，以及利用的方式、角度、層次、技術(shù)途徑不同，其產(chǎn)品與結(jié)果也完全不同。例如，果樹的嫁接、馬鈴薯以塊莖繁殖，是其無(wú)限生長(zhǎng)能力的體現(xiàn)。本發(fā)明則是利用種子植物無(wú)限生長(zhǎng)能力，創(chuàng)造營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持植物體，以大幅度的提高營(yíng)養(yǎng)體利用植物的產(chǎn)量、質(zhì)量與生產(chǎn)效率。2.種子植物無(wú)限生長(zhǎng)能力利用的基礎(chǔ)與前提種子植物具有無(wú)限的生長(zhǎng)能力，在本發(fā)明技術(shù)背景部分中已就種子植物存在著無(wú)限生長(zhǎng)能力、這種能力的來(lái)源以及能力展現(xiàn)條件、限制因素與存在狀態(tài)作了較為詳細(xì)的表述。種子植物無(wú)限生長(zhǎng)能力在正常植物中僅能表現(xiàn)為有限生長(zhǎng)能力，或呈現(xiàn)“潛在”狀態(tài)源于種子植物的生命周期，或稱生活史。種子植物的生命周期包括三個(gè)階段1)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，從種子萌發(fā)開始，歷經(jīng)幼苗期、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期，到營(yíng)養(yǎng)體的形態(tài)建成。2)生殖生長(zhǎng)階段，始于莖端營(yíng)養(yǎng)分生組織中生殖分生組織細(xì)胞的出現(xiàn)、形成，歷經(jīng)花器官的分化、生殖細(xì)胞的形成，到花的形成、開放；3)種子生長(zhǎng)階段，從雌、雄配子結(jié)合形成受精卵開始，經(jīng)分裂、 分化、胚的形成、生長(zhǎng)，到種子的成熟、植株的死亡結(jié)束。植物體從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期過(guò)度到生殖生長(zhǎng)期是由于其莖端營(yíng)養(yǎng)分生組織異化為生殖分生組織的結(jié)果。因此，種子植物無(wú)限生長(zhǎng)能力利用的基礎(chǔ)與前提，就是能否有效的阻止?fàn)I養(yǎng)分生組織異化為生殖分生組織，使其不能進(jìn)入生殖生長(zhǎng)階段，進(jìn)而持續(xù)的保持著營(yíng)養(yǎng)分生組織的狀態(tài)。3.種子植物無(wú)限生長(zhǎng)能力利用的技術(shù)途徑與方法
種子植物無(wú)限生長(zhǎng)能力利用從本質(zhì)上就是在莖端營(yíng)養(yǎng)分生組織中建立起一套完善的防止其異化為生殖分生組織的機(jī)制，目前其可行的其技術(shù)途徑有兩個(gè)
1)阻止或干擾營(yíng)養(yǎng)分生組織異化為生殖分生組織關(guān)鍵基因或基因系統(tǒng)的表達(dá)；
2)在營(yíng)養(yǎng)分生組織中建立起生殖分生組織細(xì)胞的識(shí)別與清除機(jī)制，這種細(xì)胞一經(jīng)出現(xiàn)即刻被清除。在上述兩種技術(shù)方案中前一種技術(shù)途徑更為主動(dòng)、積極，但背景復(fù)雜，涉及諸多基因與代謝途徑，在實(shí)施、使用時(shí)存在著許多問(wèn)題(1)很難用一種基因或基因系統(tǒng)去解決如此多的基因問(wèn)題；(2)用多種基因去解決也存在諸多技術(shù)難題；(3)植物的基因都是異質(zhì)的，即使能解決某種植物的問(wèn)題，但往往又缺乏其通用性。后一種技術(shù)途徑實(shí)施的基礎(chǔ)，是將被異化、或已被異化的細(xì)胞具有可以被鑒別、利用的特征、或者標(biāo)記。這些特征可以是細(xì)胞本身的，也可以是人為標(biāo)記的，例如，莖端營(yíng)養(yǎng)分生組織中異化生成的生殖分生組織細(xì)胞有某一特征的基因開始表達(dá)。因此，后一種途徑更為現(xiàn)實(shí)、直接，其效果也更為確切、肯定、徹底。本發(fā)明所稱的種子植物無(wú)限生長(zhǎng)能力利用方法，是采取基因工程技術(shù)手段，打破種子植物正常的生命周期，建立起防止?fàn)I養(yǎng)分生組織異化的生殖分生組織細(xì)胞的清除系統(tǒng)，使其營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)得以持續(xù)保持。4.防止?fàn)I養(yǎng)分生組織異化為生殖分生組織細(xì)胞的基因系統(tǒng)一種子植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因系統(tǒng)該基因系統(tǒng)實(shí)質(zhì)上是在植物莖端營(yíng)養(yǎng)分生組織中出現(xiàn)的生殖分生組織細(xì)胞中，開始表達(dá)啟動(dòng)子控制的細(xì)胞致死因子基因。5.種子植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因系統(tǒng)的作用機(jī)制將營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因系統(tǒng)轉(zhuǎn)入種子植物并整合于核基因組，當(dāng)生殖分生組織細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)分生組織中形成、出現(xiàn)時(shí)，這一基因開始表達(dá)，產(chǎn)生細(xì)胞致死因子，導(dǎo)致該生殖分生組織細(xì)胞自殺；出現(xiàn)一個(gè)，清除一個(gè)；出現(xiàn)多少，清除多少，一個(gè)不留，使莖端分生組織持續(xù)保持著營(yíng)養(yǎng)分生組織狀態(tài)。6.種子植物無(wú)限生長(zhǎng)能力利用最終實(shí)現(xiàn)建立起營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持植物為目標(biāo)的，需要將種子植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因系統(tǒng)轉(zhuǎn)入植物體。(二)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因系統(tǒng)及其組成、結(jié)構(gòu)與核酸序列
在營(yíng)養(yǎng)分生組織中建立生殖分生組織細(xì)胞的清除基因系統(tǒng)，即營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因系統(tǒng)，有兩個(gè)基本的作用1)阻止，或清除生殖器細(xì)胞的技術(shù)途徑；2)阻止，或清除應(yīng)具有高度的時(shí)、空特異性，只能摧毀生殖分生組織細(xì)胞，而不能傷及其它的任何組織、器官。植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因系統(tǒng)應(yīng)包括營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因、以及必要時(shí)設(shè)置的限定或消除其非靶標(biāo)細(xì)胞毒性的基因或基因裝置，其中營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因包括在植物生殖分生組織階段開始表達(dá)的啟動(dòng)子、細(xì)胞致死因子基因與終止子三部分
(1)嚴(yán)格、準(zhǔn)確的在植物生殖分生組織細(xì)胞中開始表達(dá)的啟動(dòng)子啟動(dòng)子表達(dá)的終點(diǎn)與表達(dá)持續(xù)時(shí)間無(wú)限定，可短、可長(zhǎng)，可以持續(xù)到花器官的分化、形成、開放、凋謝，但其具有嚴(yán)格的組織器官與發(fā)育階段特異性，即同時(shí)滿足以下條件①組織器官特異性僅在生殖分生組織細(xì)胞及其分化的生殖器官原基細(xì)胞中表達(dá)，而不在非靶標(biāo)的根、莖、葉與營(yíng)養(yǎng)分生組織細(xì)胞中表達(dá)；②發(fā)育階段特異性僅在生殖分生組織細(xì)胞出現(xiàn)之后及其存續(xù)期間，至遲在生殖器官原基形成之前開始表達(dá)，其中以在生殖分生組織細(xì)胞出現(xiàn)早期開始表達(dá)為佳；不能在其之前的營(yíng)養(yǎng)分生組織細(xì)胞或者更早的早期胚胎發(fā)生過(guò)程中開始表達(dá)；也不能在其生殖器官原基形成之后才開始表達(dá)；③具有適宜的強(qiáng)度，即其啟動(dòng)表達(dá)的細(xì)胞致死因子表達(dá)量足以致死宿主細(xì)胞?；騿?dòng)子的選擇只有上述兩個(gè)時(shí)、空標(biāo)準(zhǔn)，而與其基因本身的功能無(wú)關(guān)，可以是與生殖器官發(fā)育有關(guān)的基因，也完全可以是與生殖器官發(fā)育無(wú)關(guān)的其它基因的啟動(dòng)子，其中包括但不限于擬南芥的AtREMl基因的啟動(dòng)子。從擬南芥基因數(shù)據(jù)庫(kù)中，可以發(fā)現(xiàn)與生殖分生組織有關(guān)的基因大約有731個(gè)(包括重復(fù)的及部分基因片段)，其中AtREMl基因是第一個(gè)定位于擬南芥莖端營(yíng)養(yǎng)分生組織出現(xiàn)的生殖分生組織細(xì)胞中開始表達(dá)的基因，即在營(yíng)養(yǎng)分生組織中央出現(xiàn)有限幾個(gè)細(xì)胞時(shí)，AtREMl基因即在其中開始表達(dá)(Expression of AtREMl is developmentalIy regulated, being first localized in a few central cells of vegetative apical meristems and later expanding to the whole inflorescence meristem， as well as primordia and organs of third and fourthfloral whorls.)。原位雜交與PCR的檢測(cè)結(jié)果顯示，該基因在植株的根、莖、葉與莖端營(yíng)養(yǎng)分生組織中都不表達(dá)，僅在生殖分生組織細(xì)胞中表達(dá)(AtREMl，a member of a new family of B3 domain-containing genes, is preferentially expressed in reproductive meristems. Franco-Zorrilla JM,等 2002 Feb;128(2):418-27.這類基因的發(fā)現(xiàn)提供了生殖分生組織細(xì)胞被識(shí)別特征及其被清除的依據(jù)
①作為被識(shí)別的特征包括表達(dá)產(chǎn)物與表達(dá)的時(shí)、空特異性兩個(gè)方面；
②作為被清除的依據(jù)，是建立在被識(shí)別的基礎(chǔ)之上的，可以將其表達(dá)的時(shí)、空特異性作為特征，標(biāo)記植物。這為識(shí)別、清除植物莖端營(yíng)養(yǎng)分生組織中出現(xiàn)生殖分生組織細(xì)胞，即防止?fàn)I養(yǎng)分生組織異化技術(shù)系統(tǒng)的建立提供了依據(jù)與可能。(2)可致細(xì)胞失活、死亡的基因或基因裝置
植物生殖分生組織細(xì)胞致死基因或基因裝置的選擇，需滿足以下基本條件①其表達(dá)物，或其代謝產(chǎn)物能導(dǎo)致細(xì)胞自殺、死亡；②適用面廣，具有種子植物的通用性；③無(wú)非靶標(biāo)宿主細(xì)胞毒性，或經(jīng)過(guò)對(duì)其編碼序列的修飾、改造，或設(shè)置限制或消除非靶標(biāo)宿主細(xì)胞毒性基因裝置措施后無(wú)此毒性。其表達(dá)、或代謝物能直接或間接抑制、干擾細(xì)胞基礎(chǔ)代謝、導(dǎo)致細(xì)胞失活、死亡的基因或基因裝置有多種，例如DNA酶、RNA酶、真核細(xì)胞核糖體失活蛋白、以及基礎(chǔ)、關(guān)鍵代謝酶基因RNA干擾體等，其中僅核糖核酸內(nèi)切酶酶(RNA酶)就有來(lái)源于擬南芥的RNS1、 RNS2、RNS3等、來(lái)源于解淀粉芽孢桿菌的Barnase。擬南芥RNS1、RNS2、RNS3等來(lái)自植物的核糖核酸內(nèi)切酶基因，在植物中應(yīng)用不存在表達(dá)障礙。一個(gè)優(yōu)選的細(xì)胞致死因子基因是來(lái)源于解淀粉芽孢桿菌的核糖核酸酶Barnase 基因。該基因有兩個(gè)突出的特點(diǎn)，其一是活性特別強(qiáng)一個(gè)細(xì)胞中只要有一個(gè)copy表達(dá)就可以導(dǎo)致細(xì)胞死亡；其二是Barnase有一個(gè)天然的抑制劑基因Barstar，可以控制其對(duì)非靶標(biāo)細(xì)胞的傷害。(3)終止子能在植物中有效終止mRNA的轉(zhuǎn)錄，滿足基因表達(dá)的需要的終止子。一個(gè)優(yōu)選的植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因系統(tǒng)包括由在擬南芥JMSM基因的啟動(dòng)子、 Barnase編碼基因與豌豆rbcs 3A終止子構(gòu)成的基因(AtREMlP-Barnase_3AT，7( V)構(gòu)成的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因和抑制劑基因Barstar。其中，Barstar基因(X15M5. 1 GI 1155006)具有限定或消除Barnase編碼基因非靶標(biāo)細(xì)胞毒性的功能，其來(lái)源于解淀粉芽孢桿菌，全長(zhǎng)474bp。該基因可以在原核生物中表達(dá)，抑制Barnase的細(xì)胞毒性；但其在植物中不能表達(dá)。(三)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持植物株系及其建立技術(shù)途徑與方法
以上述種子植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因系統(tǒng)建立營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持植物的方法，主要包括以下步驟種子植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因系統(tǒng)及其表達(dá)載體的構(gòu)建、基因轉(zhuǎn)化植物、轉(zhuǎn)化體鑒定。將攜帶營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因系統(tǒng)的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入種子植物體的方法或技術(shù)系統(tǒng)已很成熟，簡(jiǎn)單介紹如下
1.載體構(gòu)建在本發(fā)明中，首先應(yīng)依次構(gòu)建出含有上述種子植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因系統(tǒng)的克隆載體、表達(dá)載體。2.目的基因轉(zhuǎn)化植物轉(zhuǎn)入植物體的方法有多種，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法等。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案為農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法，該轉(zhuǎn)化法是先將攜帶目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，利用農(nóng)桿菌侵染植物，將目的基因轉(zhuǎn)入植物，再通過(guò)抗性選擇、分化等程序，最終獲得陽(yáng)性植株。3.轉(zhuǎn)化體的鑒定對(duì)于轉(zhuǎn)化后經(jīng)過(guò)抗性選擇獲得的陽(yáng)性材料，要進(jìn)行不同層次的鑒定，包括組織化學(xué)(⑶S )、DNA水平(Southern分析)、RNA水平(Nouthern )、蛋白質(zhì)水平 (Western),以確認(rèn)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因系統(tǒng)是否真正整合于轉(zhuǎn)化植物的核基因組，是否轉(zhuǎn)錄、表達(dá)。這些對(duì)基因轉(zhuǎn)化體的鑒定方法都已經(jīng)是很成熟的技術(shù)。4.轉(zhuǎn)基因植株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)特性及其它形態(tài)學(xué)的鑒定將經(jīng)過(guò)分子、組織化學(xué)鑒定的轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照材料同時(shí)植于溫室或其它相同的環(huán)境條件下，以觀察其營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)特性、 生殖器官發(fā)生情況及其它形態(tài)學(xué)特性。本發(fā)明具有積極有益的效果
本發(fā)明營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因系統(tǒng)在植物中表達(dá)可使植物持續(xù)保持營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)狀態(tài)，建立起營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持植物，具有諸多的特點(diǎn)與優(yōu)點(diǎn)。1.速生，營(yíng)養(yǎng)體的生產(chǎn)效率高這表現(xiàn)在兩個(gè)層次，其一是營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持植物株系，葉的數(shù)量要較正常植物高得多，葉多光合面積大，總生物量高，這是其速生的物質(zhì)基礎(chǔ)； 其二是營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持植物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)量等于總生物量，營(yíng)養(yǎng)體所占的比率高。2.目的產(chǎn)品質(zhì)量?jī)?yōu)良一般植物營(yíng)養(yǎng)體的速生往往是建立在總生物量并未增加， 而是以降低密度，或營(yíng)養(yǎng)成分為代價(jià)，獲得其體積或重量的增大的基礎(chǔ)上的；而營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持植物的品質(zhì)是建立在總生物量大的物質(zhì)基礎(chǔ)之上的；一般植物發(fā)育到生殖生長(zhǎng)階段之后，莖、葉中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)即會(huì)加速轉(zhuǎn)入生殖器官，導(dǎo)致其莖、葉等營(yíng)養(yǎng)體食用，或經(jīng)濟(jì)性狀品質(zhì)的劣化；而營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持植物因其不會(huì)形成生殖器官，因而不會(huì)發(fā)生其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)移， 所以可以很好的保持著莖、葉等營(yíng)養(yǎng)體的品質(zhì)。3.環(huán)保，無(wú)污染營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持植物無(wú)生殖器官，不會(huì)因花粉(過(guò)敏原)、果(毛)、種 (毛)造成對(duì)人體的危害與環(huán)境的污染。4.生態(tài)安全營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持植物無(wú)生殖器官(包括花序、花、子房、花藥、花粉、果實(shí)、種子)，不會(huì)發(fā)生基因的飄逸與擴(kuò)散，對(duì)生態(tài)安全。5.本發(fā)明所構(gòu)建出的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持植物可以通過(guò)無(wú)性繁殖的方式擴(kuò)大種群，可以保持種優(yōu)良特性這種繁殖方式不會(huì)發(fā)生種的分離或退化，且繁殖的種苗旺盛，生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)。6.本發(fā)明構(gòu)建的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持植物，既不同于野生植物、常規(guī)品種、雜種優(yōu)勢(shì)利用體系中的不育系，也不同于與花形成相關(guān)基因突變導(dǎo)致的畸形花植物體，其命運(yùn)也不同，具體表現(xiàn)在前者遵從常規(guī)植物生命周期的限制；而本發(fā)明所構(gòu)建的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持植物，打破了植物生命周期的限制，使其不進(jìn)入生殖生長(zhǎng)期，可持久的保持著營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)。7.本發(fā)明適用于所有營(yíng)養(yǎng)體利用種子植物，無(wú)論是天然種、農(nóng)家種、優(yōu)良品種，還是具有優(yōu)勢(shì)的雜種。應(yīng)該說(shuō)明，營(yíng)養(yǎng)體利用植物是以人們對(duì)植物營(yíng)養(yǎng)器官的需要作為分類標(biāo)準(zhǔn)的，而大多數(shù)植物的營(yíng)養(yǎng)體與籽實(shí)體對(duì)人都是有價(jià)值的，只是價(jià)值的主次、大小、輕重不同而已。因此，同一種植物因其追求的目的不同，有人將其歸為籽實(shí)體植物，例如玉米，但將其作為青儲(chǔ)飼料時(shí)則歸為營(yíng)養(yǎng)體植物；核桃、櫻桃、梨樹可作為籽實(shí)體植物，但將其作為用材樹時(shí)，則歸為營(yíng)養(yǎng)體植物。8.本發(fā)明基因系統(tǒng)可以應(yīng)用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)、林業(yè)、牧草業(yè)、園林綠化、環(huán)境與生態(tài)保護(hù)、生物能源、生物醫(yī)藥、生物制造與輕化工業(yè)領(lǐng)域的植物，都可以在原來(lái)的基礎(chǔ)上大幅度提高其生產(chǎn)效率、產(chǎn)量、效果與效益。


圖1.為營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因系統(tǒng)(BTg-RBN)結(jié)構(gòu)示意圖
營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因系統(tǒng)(BTg-RBN)全長(zhǎng)2244bp，5'、3'端的酶切位點(diǎn)分別為Nde I、 EcoR I。該基因系統(tǒng)由Barstar基因(BTg 474bp)與營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因(RBN 1745bp)兩個(gè)基因組成；其中營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因由擬南芥JMSM基因啟動(dòng)子AtREMp (918bp) ,Barnase 基因編碼序列(333bp)、3A終止子3AT(478bp)3個(gè)基因片段組成；啟動(dòng)子與編碼基因間的酶切位點(diǎn)為及 !! I，編碼基因與A3終止子之間的酶切位點(diǎn)為fee I。圖2為轉(zhuǎn)BTg-RBN煙草PCR鑒定結(jié)果圖譜
圖中，1、8:DL2000 Marker; 2:陽(yáng)性對(duì)照(+);3:陰性對(duì)照(_) ;4_7 :4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系。PCR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為611bp，與預(yù)期結(jié)果一致。結(jié)論營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因系統(tǒng)已整合于煙草核基因組中。圖3為移栽120天的轉(zhuǎn)BTg-RBN煙草與對(duì)照煙草的對(duì)照?qǐng)D
圖中，1、2轉(zhuǎn)BTg-RBN煙草，3、4為普通煙草(對(duì)照)，頂生花枝上的果實(shí)已經(jīng)成熟，第二茬花已放花；植株的總?cè)~23 M片，下部葉大部分已經(jīng)干枯、脫落，尚存的僅有3 5片， 已開始變黃、老化、下垂。轉(zhuǎn)BTg-RBN煙草1、2與對(duì)照相比，在開花前生長(zhǎng)勢(shì)、株高、葉片數(shù)無(wú)明顯差異；在對(duì)照開始開花后，轉(zhuǎn)BTg-RBN的煙草生長(zhǎng)勢(shì)特別旺盛，整個(gè)植株鮮嫩、生長(zhǎng)速度明顯加快，葉片增多，總?cè)~數(shù)達(dá)40片左右，植株上的可見葉達(dá)20多片，是對(duì)照的4 5 倍左右，且葉片變大、增厚，葉色變深綠。圖4為移栽150天的轉(zhuǎn)BTg-RBN煙草與對(duì)照煙草的對(duì)照?qǐng)D
圖中，1、2、3為轉(zhuǎn)BTg-RBN煙草，4、5、6、7為普通煙草(對(duì)照)。普通煙草高82 87cm， 果實(shí)、種子已成熟，植株在衰亡；轉(zhuǎn)BTg-RBN煙草1、2、3，生長(zhǎng)勢(shì)旺盛，葉片多、大，顏色深綠， 幼嫩；植株加速生長(zhǎng)，已大幅度高于對(duì)照。圖5為移栽190天的轉(zhuǎn)BTg-RBN煙草與對(duì)照煙草的對(duì)照?qǐng)D
圖中，1、4為轉(zhuǎn)BTg-RBN煙草，2、3為普通煙草(對(duì)照);普通煙草高82 87cm，果實(shí)、種子已成熟，植株已干枯、死亡；轉(zhuǎn)BTg-RBN煙草1、4生長(zhǎng)勢(shì)旺盛，葉片已達(dá)70多片，顏色深綠、幼嫩；植株加速生長(zhǎng)，高度已達(dá)170cm左右，為對(duì)照高度的2倍多。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下述實(shí)施例中的試驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法；下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料及試劑，如無(wú)特別說(shuō)明，均購(gòu)自常規(guī)生化試齊Ll商店。實(shí)施例1種子植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因系統(tǒng)(BTg-RBN)的構(gòu)建 (I)Barstar基因的克隆
Barstar基因以PCR合成。模板為淀粉芽孢桿菌核DNA，正、反向引物分別為BTF1 5'-GTCCAATCTGCAGCCGTCCGAGACA -3'，BTRl 5'- CGATTCAGGCGGCTG ATATTCTCCA -3'。
將合成的Barstar基因片段直接插入TaKaRa公司的pMD20_T載體，測(cè)序確認(rèn)，構(gòu)建成pMD20-BTg質(zhì)粒。(2) RBN啟動(dòng)子、編碼序列、終止子片段的克隆
RBN基因由在擬南芥生殖分生組織開始表達(dá)的J基因啟動(dòng)子、Barnase基因編碼序列、3A終止子3個(gè)片段組成。這三個(gè)基因片段全部是利用PCR技術(shù)克隆的?；騿?dòng)子片段序列的來(lái)源為AL161579 (82727_83643bp)，長(zhǎng)919bp ； 5，，3，端的酶切位點(diǎn)分別為歷/2d IIII -Pst I ,BamYi I。PCR模板為擬南芥核DNA ；正、反向引物分別為REMFl 5’ -CGCCTGCAGCACCCCTACTAACTAAATCGATCA- 3’ ；REMRl 5，-CATGGATCCTG TTGAATACACTTCAAAAATCTC-3’ 。Barnase基因編碼片段片段序列的來(lái)源為X12871 (1 _333bp)，長(zhǎng)333bp ;5，、3， 端的酶切位點(diǎn)分別為I.Sac I ；PCR模板為淀粉芽孢桿菌核DNA，正、反向引物分別為BNF1 5’-GGGGGATCCATGGCACAGGTTATCAACACG-3’，BNRl 5’-CCCGAGCTCTTATCTGATTTTTGT AAAGGTCTG-3，。3A終止子片段序列的來(lái)源AF309825 (4248_4717bp)，長(zhǎng)467bp ； 5，、3，端的酶切位點(diǎn)分別為I > EcoR I。PCR模板為豌豆核DNA;正、反向引物分別為3AF1 5’-ACG AGCTCAGTCGATCCAGGCCTCCCAGCTTTC-3’，3AR1 5’-AAGAATTCMAGCCTATACTGTACTTAACTT-3’。以PCR技術(shù)克隆的AtREMl基因啟動(dòng)子、3A終止子分別插入pMD19_T載體，經(jīng)DNA 測(cè)序確認(rèn)。(3) RBN基因部分片段的重組
克隆載體為PUC19質(zhì)粒。分別以相應(yīng)的酶將JiTffiM啟動(dòng)子、3A-Ter從pMD19_T載體中切出，插入同一 PUC19質(zhì)粒的相應(yīng)位點(diǎn)，獲得pUC-AtREMlp-A3. Ter質(zhì)粒。(4)種子植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因系統(tǒng)(BTg-RBN)的構(gòu)建
以pMD20-BTg質(zhì)粒為載體。以BamHl酶切pMD20_BTg質(zhì)粒，補(bǔ)平，再以EcoRl酶切，回收載體片段。以Pstl酶切pUC-AtREMl-A3質(zhì)粒，補(bǔ)平，再以EcoRl酶切，回收AtREMlp_3A. Ter 片段。將 pMD20-BTg 載體片段與 AtREMlp-3A. Ter 片段連接，構(gòu)建成 pND20_BTg-AtREMlp-3A. Ter質(zhì)粒。分別以BamHUacl 酶切 pND20_BTg-AtREMlp-3A. Ter 質(zhì)粒、Barnase 片段，并分別 pND20-BTg-AtREMlp-3A. Ter載體、Barnase片段，進(jìn)行連接，構(gòu)建成營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因系統(tǒng) (pMD20-BTg-RBN)oRBN-BTg基因系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)見附圖1 ；序列見SEQ ID N0:1。實(shí)施例2種子植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因系統(tǒng)(BTg-RBN)植物表達(dá)載體的構(gòu)建
構(gòu)建的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因只有裝入植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入植物體，才能在植物體中呈現(xiàn)功能，發(fā)揮作用。迄今已經(jīng)建立起多種植物掌握表達(dá)載體，并各具特色，如pBI121、pCAMBIA系列等。本實(shí)施例優(yōu)選表達(dá)載體為PCAMBIA3301。該載體帶有根瘤農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA的左、右邊界LB、RB，可以用農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法轉(zhuǎn)化植物；其在植物中的選擇標(biāo)記是Bar。營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因系統(tǒng)RBN. BTg表達(dá)載體的建立，是以Hind III、EcoR I將 RBN-BTg片段從克隆載體中切下來(lái)，插入植物表達(dá)載體pCAMBIA3301質(zhì)粒完成的。實(shí)施例3營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持植物體的鑒定通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)化植物的核基因組是否存在(AtREMl-Barnase-3A)基因片段，或相關(guān)片段來(lái)確認(rèn)的。其鑒定程序同一般轉(zhuǎn)基因植物，所用上、下游引物可分別為RBtF 5，-TTAGTAGGATTCTGGTGTGTGGG-3，；RBtR 5' -TTCGATTTTTAATAGATTCGGTTTT-3，。片段長(zhǎng)度為 611bpAtREMl部分啟動(dòng)子及Barnase編碼序列和3A的部分終止子序列)。對(duì)于栽植后多年才能出現(xiàn)生殖器官的植物，可將經(jīng)過(guò)鑒定的轉(zhuǎn)基因植株材料直接嫁接于成年樹上(并設(shè)對(duì)照)，以最終確定能否產(chǎn)生殖器官、生長(zhǎng)特性及其它形態(tài)學(xué)特性。一般2 3年時(shí)間，即可鑒定出轉(zhuǎn)化植株是否為真正轉(zhuǎn)基因株系，及其它特征。實(shí)施例4營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持煙草的建立
應(yīng)該特別指出的是，雖然下述實(shí)例是以轉(zhuǎn)基因煙草的效果描述本發(fā)明的。但這并不意味著本發(fā)明營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因只能用于生產(chǎn)無(wú)生殖器官煙草。給出以下實(shí)施例的目的是舉例詳細(xì)描述本發(fā)明，而不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明權(quán)利要求保護(hù)范圍的限制。以攜帶植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因的pCAMBIA3301-BTg-RBN質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)化煙草(K326品種)，獲得的轉(zhuǎn)基因株系，見附圖4、5。應(yīng)該特別指出的是，雖然下述實(shí)例是以轉(zhuǎn)基因煙草的效果描述本發(fā)明的。但這絕不意味著本發(fā)明營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因只能用于生產(chǎn)無(wú)生殖器官煙草。給出以下實(shí)施例的目的是舉例詳細(xì)描述本發(fā)明，而不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明待批權(quán)利范圍的限制。以攜帶植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因的pCAMBIA3301-BTg-RBN質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)化煙草(K326品種)，獲得的轉(zhuǎn)基因株系，見附圖4、5。(1)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持植物(煙草)的生長(zhǎng)、發(fā)育特性與形態(tài)描述
在此需要作三點(diǎn)說(shuō)明①煙草品種、來(lái)源及栽培管理轉(zhuǎn)基因煙草及對(duì)照均為K362 ；采用同一批煙草試管苗為材料、同時(shí)通過(guò)轉(zhuǎn)化/組織培養(yǎng)程序獲得的，同時(shí)栽植、同樣管理； ②本實(shí)驗(yàn)是在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的，既不是溫室、田間，也不是人工氣候室，因此，作為對(duì)照的普通煙草的生長(zhǎng)、發(fā)育與正常栽培條件下的有所不同；試驗(yàn)栽培期間為2006年3月12日 2007 年2月10日；③這些特點(diǎn)是以普通煙草作為參照物說(shuō)明的，使用的一些名詞也是借用普通植物的描述方式。( I )在植株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)階段，即植物體生殖生長(zhǎng)開始之前，植株的形態(tài)特征與普通煙草無(wú)異。(II)普通煙草由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)入生殖生長(zhǎng)階段，即生殖分生組織發(fā)生與形成時(shí)期， 是營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持煙草與普通煙草形態(tài)特征出現(xiàn)差異的分界線。(III)普通煙草進(jìn)入生殖生長(zhǎng)后，作為營(yíng)養(yǎng)器官的葉片依次變??；而營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持煙草的營(yíng)養(yǎng)體卻朝著完全相反的方向加速發(fā)展，葉片增加，并逐漸變大、厚；葉片顏色變深綠；莖變粗；生長(zhǎng)勢(shì)旺盛；其高生長(zhǎng)加速，株高達(dá)普通煙草的2倍多。(IV)生長(zhǎng)勢(shì)旺盛、不衰老
普通煙草移栽到花盆后90天左右頂部出現(xiàn)花序，并陸續(xù)開花，150天左右種子成熟， 植株開始衰老、死亡。營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持煙草移栽到花盆后80天左右開始生長(zhǎng)勢(shì)明顯加快，顏色變深，葉片變多、大；150天時(shí)其高度明顯超過(guò)普通煙草，并持續(xù)保持旺盛的生長(zhǎng)狀態(tài)，不衰老，高度近200cm，是對(duì)照的2倍多。(V)株型營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持煙草主莖優(yōu)勢(shì)明顯，以高生長(zhǎng)為主，幾乎沒(méi)有分叉、側(cè)枝。營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持煙草植株的莖、葉、株高等參數(shù)，見表1 ；而普通煙草煙草花序下葉腋萌生新枝，并發(fā)育成新的花序，開花。 表1 營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持煙草植株莖、葉、株高主要參數(shù)
權(quán)利要求
1.一種植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因系統(tǒng)，其特征在于，它包括營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因和必要時(shí)設(shè)置的限定或消除前述基因的非靶標(biāo)細(xì)胞毒性的基因或基因裝置，所述營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因包括1)啟動(dòng)子其表達(dá)的終點(diǎn)與表達(dá)持續(xù)時(shí)間無(wú)限定，但其具有嚴(yán)格的組織器官與發(fā)育階段特異性，即需滿足以下條件①組織器官特異性僅在生殖分生組織細(xì)胞及其分化的生殖器官原基細(xì)胞中表達(dá)，而不在非靶標(biāo)的根、莖、葉與營(yíng)養(yǎng)分生組織細(xì)胞中表達(dá)；②發(fā)育階段特異性僅在生殖分生組織細(xì)胞出現(xiàn)之后至生殖器官原基形成之前期間開始表達(dá)；③具有適宜的強(qiáng)度，即其啟動(dòng)表達(dá)的細(xì)胞致死因子表達(dá)量足以致死宿主細(xì)胞；2)滿足以下條件的細(xì)胞致死因子基因①細(xì)胞致死因子基因的表達(dá)物，或其代謝產(chǎn)物能導(dǎo)致細(xì)胞自殺、死亡；②無(wú)非靶標(biāo)宿主細(xì)胞毒性，或經(jīng)過(guò)對(duì)其編碼序列的修飾、改造，或設(shè)置限制或消除非靶標(biāo)宿主細(xì)胞毒性基因裝置措施后無(wú)此毒性；3)終止子能在植物中有效終止mRNA的轉(zhuǎn)錄，滿足基因表達(dá)的需要的終止子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因系統(tǒng)，其特征在于，所述啟動(dòng)子為擬南芥AtREMl基因的啟動(dòng)子，或具有相同或類似他的與功能的啟動(dòng)子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因系統(tǒng)，其特征在于，所述細(xì)胞致死因子基因的表達(dá)物或其代謝產(chǎn)物為DNA酶，或?yàn)镽NA酶，或?yàn)檎婧松锖颂求w失活蛋白，或?yàn)榛A(chǔ)、關(guān)鍵酶基因的RNA干擾體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因系統(tǒng)，其特征在于，所述非靶標(biāo)宿主細(xì)胞毒性基因?yàn)锽arnase，其對(duì)應(yīng)的限制非靶標(biāo)宿主細(xì)胞毒性的基因?yàn)锽arstar基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因系統(tǒng)，其特征在于，所述終止子為農(nóng)桿菌的NOS-ter、或?yàn)橥愣沟膔bcs 3A終止子。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因系統(tǒng)，其特征在于，所述營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因系統(tǒng)由擬南芥AtREMl基因的啟動(dòng)子、Barnase基因、3A終止子及Barstar基因構(gòu)成， 其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
7.一種以權(quán)利要求6所述的植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因系統(tǒng)建立營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持植物的方法，包括以下步驟種子植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因系統(tǒng)及其表達(dá)載體的構(gòu)建、基因轉(zhuǎn)化植物、 轉(zhuǎn)化體鑒定，其特征在于，在構(gòu)建種子植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因系統(tǒng)的過(guò)程中，先將Barstar 基因置于克隆載體，然后再插入Barnase基因，以保證營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能的完整與正確。
8.—種種子植物無(wú)限生長(zhǎng)能力利用方法，其特征在于，將權(quán)利要求1 6任意一項(xiàng)所述的植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因系統(tǒng)整合于種子植物核基因組，建立起營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持植物，按照既定的組織器官與發(fā)育階段特異性準(zhǔn)確、正確的開始表達(dá)，使莖端分生組織持續(xù)保持營(yíng)養(yǎng)分生組織狀態(tài)，進(jìn)而使植物體無(wú)限制的保持著營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)，即具有以下生長(zhǎng)狀態(tài)1)持續(xù)的保持著營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)狀態(tài)，表現(xiàn)為葉多、莖高、植株生長(zhǎng)速度快、不易衰老，營(yíng)養(yǎng)體生產(chǎn)效率高，品質(zhì)好，頂端優(yōu)勢(shì)強(qiáng)，以高生長(zhǎng)為主；2)持續(xù)的保持著無(wú)生殖器官狀態(tài)，即無(wú)任何的生殖器官，包括花、花粉、果實(shí)、種子。
9.含有權(quán)利要求1 6任意一項(xiàng)所述種子植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因系統(tǒng)的克隆載體。
10.含有權(quán)利要求1 6任意一項(xiàng)所述種子植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因系統(tǒng)的表達(dá)載體。
11.由權(quán)利要求9所述克隆載體或權(quán)利要求10所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
12.如權(quán)利要求11所述的宿主細(xì)胞，其為植物宿主細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因系統(tǒng)、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持植物的建立及種子植物無(wú)限生長(zhǎng)能力利用方法。該營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因系統(tǒng)包括啟動(dòng)子、細(xì)胞致死因子基因和必要時(shí)設(shè)置的限定或消除其非靶標(biāo)細(xì)胞毒性的基因裝置；種子植物無(wú)限生長(zhǎng)能力利用將該基因系統(tǒng)整合于植物核基因組，并按照其既定的組織器官與發(fā)育階段特異性準(zhǔn)確、正確的開始表達(dá)。該營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持基因系統(tǒng)可以有效清除莖端營(yíng)養(yǎng)分生組織中出現(xiàn)的生殖分生組織細(xì)胞，防止?fàn)I養(yǎng)分生組織異化，從而創(chuàng)造出創(chuàng)造出新型高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)體利用植物-營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)保持植物；本發(fā)明可以應(yīng)用于所有營(yíng)養(yǎng)體利用植物，使其在原來(lái)的基礎(chǔ)上大幅度提高營(yíng)養(yǎng)體的生長(zhǎng)速度、生產(chǎn)效率與產(chǎn)量。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102181436SQ201110007888
公開日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月14日
發(fā)明者劉文婷, 杜亞瓊, 楊艷坤, 牛靜勇, 秦天蒼, 鄧士政, 郝曉東, 陳凈植, 陳占寬, 韓書友 申請(qǐng)人:河南天茂生物有限公司