專利名稱：蘋果早期預(yù)選培育新品種技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
當(dāng)前國內(nèi)外蘋果育種一般采用雜交育種和芽變育種，特點是按形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)選擇，但蘋果是個雜合體，遺傳背景十分復(fù)雜，不易研究，而樹體形態(tài)構(gòu)成易受外界環(huán)境和病蟲害的影響，另外蘋果是多年生樹種，生長周期長，成年樹各類組織器官生長發(fā)育的習(xí)性，特性，在幼樹很難斷定大大增加了育種工作難度。因此，國內(nèi)外的許多學(xué)者對蘋果的早期預(yù)選尤其是矮生習(xí)性預(yù)選十分關(guān)注。早在二十世紀(jì)60年代K · 0 · Lapins等就開始對蘋果的矮生習(xí)性及其遺傳作了廣泛研究，但由于形態(tài)標(biāo)志的不穩(wěn)定性，嚴重影響研究工作進展。本項發(fā)明于1979年起研究蘋果生長習(xí)性的同工酶標(biāo)志。據(jù)報道過氧化物酶同工酶與生長密切相關(guān)， 在本項研究中發(fā)現(xiàn)過氧化物酶同工酶E9帶與蘋果矮生習(xí)性相關(guān)密切，因此將E9帶作為矮生型蘋果的矮生習(xí)性標(biāo)志。1984年，經(jīng)專家鑒定確認“過氧化物酶同工酶作為1 2年生矮生型蘋果實生苗的預(yù)選指標(biāo)”，1988年獲得農(nóng)業(yè)部科學(xué)技術(shù)進步三等獎，。1990年在23 屆國際園藝會上發(fā)表三篇論文后，受到同行專家好評，并應(yīng)“Acta Horticaturae”雜志的約稿，連載了三篇論文。為了研究矮生型蘋果同工酶標(biāo)志在育種中的應(yīng)用，于1992年、1993年間選用熟期不同的普通型和矮生型或短枝型等不同類的栽培品種，組配成不同類型的組合。對其實生苗用同工酶標(biāo)志早期預(yù)選與常規(guī)選育相結(jié)合的方法，進行系統(tǒng)選育，至1996年獲得的一批熟期早，以短枝結(jié)果為主的不同樹形的優(yōu)良株系，以后重點對果實的色澤、品質(zhì)方面進一步選育。2010年8月20日，經(jīng)專家鑒定通過8個品系，一致認為早熟優(yōu)質(zhì)的品系是難得的優(yōu)良品系，宜在黃河故道等地擴大試種，發(fā)揮其早熟優(yōu)勢作用。(二)本項發(fā)明的目的1、本項發(fā)明的目的之一是矮生類型(包括矮生、半矮生、緊湊型、短枝型具有矮化特點的)品種，是當(dāng)前國內(nèi)外生產(chǎn)發(fā)展方向。建立矮生型蘋果早期預(yù)選技術(shù)，提高效率， 加快育種進度，是本項發(fā)明目的。2、本項發(fā)明的目的之二是選擇矮生(重點是半矮生、緊湊、短枝型)，早熟，優(yōu)質(zhì)的蘋果新品種。3、本項發(fā)明的目的之三是建立蘋果早期預(yù)選與常規(guī)選育相結(jié)合的選育程序，以提高選擇效率，減少選擇的隨意性，加快育種進度。(三)本項發(fā)明的主要內(nèi)容1、矮生型蘋果的同工酶標(biāo)志同工酶標(biāo)志的可靠性、穩(wěn)定性，適用廣，是決定早期預(yù)選程序成功的關(guān)鍵，因此，①要求方法簡易，取樣不傷害整株，操作簡便，重復(fù)性好，并規(guī)定嚴格的操作程序和取樣標(biāo)準(zhǔn)；②要求本項同工酶標(biāo)志適用于蘋果屬的22個種的不同類型品種，砧木，雜種實生苗；③要求本項指標(biāo)遺傳性穩(wěn)定可靠。2、蘋果早期預(yù)選與常規(guī)選育相結(jié)合的選育程序是本發(fā)明的核心。本項發(fā)明采用普通型的和矮生型的，早、中、晚熟期不同的栽培品種25個，組配成60個雜交組合。對由當(dāng)年實生苗，進行早期預(yù)選、淘汰大批不具有同工酶標(biāo)志的實生苗，對具有同工酶標(biāo)志的實生苗進行常規(guī)選育。在3畝地上，不到十年內(nèi)，選育獲得一批早熟，高產(chǎn)，優(yōu)質(zhì)的新品系。
(四)本項發(fā)明的優(yōu)點與效果1、方法快速簡便。采用淀粉凝膠電泳技術(shù)，每天可分析大量樣品；2、取樣不傷害整株，取當(dāng)年實生苗主莖伸長區(qū)皮層或葉片50 lOOmg，原有的實生苗能繼續(xù)發(fā)枝生長，不影響下一步常規(guī)選育。3、同工酶標(biāo)志的廣泛性1985 1987年間，對蘋果種質(zhì)資源22個種的212個類型，不同砧木類型95個，栽培品種88個，共395個單株，同工酶標(biāo)志與矮生習(xí)性相關(guān)分析結(jié)果，其準(zhǔn)確率在86. 14%左右，具有一定的普遍性。4、同工酶標(biāo)志，遺傳性穩(wěn)定性。根據(jù)由88個不同生長習(xí)性的栽培品種砧木組配成不同類型的雜交組合1 個，用同工酶分析了 7987株當(dāng)年生實生苗，結(jié)果表明，同工酶標(biāo)志——E9帶是受二對互補基因控制，遺傳性穩(wěn)定，不受樹齡、砧木、栽培地域的影響。5、早期預(yù)選與常規(guī)選育相結(jié)合的選育程序。育種周期短、效率高，僅根據(jù)60個雜交組合經(jīng)本程序選擇后，中選16個組合，組合中選率為27%，由1535株實生苗，中選19個優(yōu)良品系，單株中選率為1. 4%。本項發(fā)明的蘋果選育程序，能顯著地提高選擇效率，加快了育種進度，對蘋果育種具有重大意義。(五)詳述本項發(fā)明的實施例1、淀粉凝膠電泳不同的酶蛋白分子由于帶電量、帶電性質(zhì)不同，在以淀粉凝膠為支持物的電場中移動的方向、速度不同。于是不同酶蛋白分子移動速度不同，出現(xiàn)不同的分離條帶。用過氧化物酶底物染色，即能顯示不同的過氧化物酶同工酶條帶。蘋果樹體的不同器官、組織、細胞過氧化物酶同工酶種類不同，不同品種生長發(fā)育習(xí)性不同，過氧化物酶同工酶的種類也不一樣。因此，能將不同生長習(xí)性的品種有效的分離開來，矮生型蘋果持有特殊標(biāo)志帶，E9 酶帶，即過氧化物酶的一種，它只存在于蘋果莖伸長區(qū)的皮層或相應(yīng)的葉片中。本發(fā)明以此為矮生型同工酶標(biāo)志帶。淀粉凝膠電泳方法①制膠稱取12g水解馬鈴薯淀粉，倒入500ml三角瓶內(nèi)，加入IOOml凝膠緩沖液， 邊加熱，邊搖動，至淀粉完全溶解呈透明狀，開始沸騰，立即用500 600mmHg的負壓，抽氣， 除去凝膠中的氣泡。隨后倒入事先準(zhǔn)備好的模子里(圖la)，趁熱蓋上一塊滌綸薄膜和玻璃板，壓一重物，冷卻1.5 2.0小時，即可進樣。②制樣稱取蘋果實生苗莖伸長區(qū)或相應(yīng)部位的葉片50 lOOmg，加樣品緩沖液 0. 25 0. 5ml，制取勻漿上清液。③進樣如圖(Ib)所示，用梳子在凝膠負極端4 6cm處切點樣口。用新華3號濾紙片蘸上酶粗提液，插入凝膠切口里，蓋上滌綸膜，玻璃板，即可電泳④電泳按圖2所示，將電極緩沖液倒入電泳槽，沒過檔板孔，將進好樣的凝膠放在電泳槽上，二端搭好紗布，浸入電極液，蓋上滌綸玻璃板，接通電源。電泳是在1 5°C條件下進行，通穩(wěn)恒電流，每厘米保持2mA，電泳4 6小時。⑤切膠電泳完畢后，將凝膠放同制膠的模子里，底下再墊一塊1 2mm厚的玻璃板，用金屬細絲橫向切割膠板，每切下一塊膠板，置于染色缸內(nèi)。⑥染色0. 5mol/L醋酸緩沖液，PH7. 050ml，聯(lián)苯胺50mg ；3% H2O2IO滴，將電泳后的膠片，浸沒在染色液中，室溫下立即顯蘭色譜帶，30mim后用自來水沖洗過夜，顯橘紅色，照相保存。2、同工酶標(biāo)志的穩(wěn)定性、可靠性①同工酶標(biāo)志的可靠性矮生型同工酶標(biāo)志在蘋果屬內(nèi)具有普遍性意義，蘋果屬不同種不同類型的矮生習(xí)性與同工酶標(biāo)志關(guān)系密切，根據(jù)蘋果屬17個種不同類型資源分析表明，其矮生習(xí)性與同工酶標(biāo)志一致、準(zhǔn)確率為90.0%;分析了 41個不同類型的矮化砧，其矮生性(矮化作用)與具有同工酶標(biāo)志一致，準(zhǔn)確率為85. 37% ；分析了 51個不同類型栽培品種，其矮生習(xí)性與具有同工酶標(biāo)志一致，其準(zhǔn)確性為81. 85%。平均值為86. 14%。表明矮生型同工酶標(biāo)志在蘋果屬內(nèi)具有廣泛的適用性。②同工酶標(biāo)志生物學(xué)穩(wěn)定性矮生型同下酶標(biāo)志不受樹齡、樹體發(fā)育時期的影響。 由國光、金冠、富士、紅星、新紅星，短枝元帥等栽培品種組配成七個雜交組合，樹齡分別在 7 13年，分別分析比較，其母樹新梢利萌蘗皮層或相應(yīng)部位葉片中的同工酶標(biāo)志帶，共 446株。結(jié)果母樹新梢與其萌蘗中的同工酶標(biāo)志完全一致，不受樹體發(fā)育時期的影響；分析了由國光X元帥158組合的2年齡和2 3個月齡實生苗；富士 X新紅星組合的2年齡、6年齡和2 3個月齡實生苗；國光X短枝元帥組合的2年齡、5年齡和2 3個月齡實生苗。結(jié)果2 3個月齡實生苗的同工酶標(biāo)志與之相應(yīng)的2 6年生幼樹的同工酶標(biāo)志完全一致。分析了由國光XM7、國光XM8 二個組合，共64株，從2月齡開始至3年齡，每年定株分析觀察2次，結(jié)果每個單株從2月齡開始至3年齡，其新梢皮層或相應(yīng)部位葉片中同工酶標(biāo)志完全一致，表明，二個月齡實生苗就可以進行早期預(yù)選，不受樹齡和發(fā)育期的影響。矮生型同工酶標(biāo)志不受砧木的影響，將玫瑰紅、新紅星、煙青、金矮生、紅星、富士品種分別嫁接在M7，匪106、匪111、M27等不同類型根砧上；將國光、金冠、紅冠、富士、紅星品種分別嫁接在MM104、MM106、MM111、M2、M4、M5、M9、]\C6、M27等22個以山定子，茶果為根砧的中間砧上，組成48個中間砧/根砧組合；將新紅星、紅星、煙青、金矮生、矮紅高接在紅冠大樹上。結(jié)果所有不同品種接穗的同工酶標(biāo)志與原品種一樣，不受根砧、中間砧、高接的影響。③同工酶標(biāo)志的遺傳性穩(wěn)定性以39個親本品種相互進行雜交，回交、正反交組配成58個組合，獲得3515個Fl代雜交種實生苗，作同工酶標(biāo)志分離分析，結(jié)果具有同工酶標(biāo)志的實生苗可能有AABB、AaBB、AaBb、AABb四種基因型，而沒有同工酶標(biāo)志帶的實生苗可能有AAbb、Aabb、aaBb、aaBB、aabb五種基因型。結(jié)果，查明了 39個親本同工酶標(biāo)志的基因型。為進一步證明同工酶標(biāo)志的遺傳規(guī)律，采用88個栽培品種，相互組配成1 個雜交組合，其中普通型X普通型的有38個組合，普通型X矮生型的有63個組合，矮生型X矮生型的有27個組合，共獲得7987株實生苗，由這些Fl代實生苗同工酶標(biāo)志的分離結(jié)果證明， 蘋果實生苗中同工酶標(biāo)志(E9)是受A_B_ 二對互補基因控制，遺傳性穩(wěn)定。3、選擇效果①矮生性1986、1987年果茶所比較鑒定結(jié)果，具有同工酶標(biāo)志的135_1、35_3、 41-6、66-11、61-18、22-62秋矮生(5 9年生)等優(yōu)良品系的枝類比、新梢長度，節(jié)間長度并與秋矮生相比。結(jié)果平均短枝數(shù)、中枝數(shù)、長枝數(shù)比例分別為59. 4^^24.43^^16.8%, 平均新梢長為42. 63cm，平均節(jié)間長為1. 42cm枝類比例，新梢長度，節(jié)間長度都與秋矮生相近。表明具有同工酶標(biāo)志，這些品系、品種都具有顯著的矮生習(xí)性。同樣又鑒定了具有同工酶標(biāo)志的雜種實生苗O 3年齡)160株，結(jié)果短、中、長枝比例分別為75. 61%,21. 29%, 3. 10%，平均新梢長度為16. 63cm，平均節(jié)間長為1. 25cm，這些具有同工酶標(biāo)志的實生苗其枝類比，新梢長、節(jié)間長，符合矮生習(xí)性標(biāo)準(zhǔn)。上述試材，都是先經(jīng)常規(guī)選育后再用同工酶標(biāo)志篩選材料。下面用同工酶標(biāo)志早期預(yù)選后對矮生習(xí)性選擇效果由60個雜交組合，1535株實生苗，2 3個月齡，經(jīng)同工酶早期預(yù)選后，再經(jīng)常規(guī)選擇獲得的具有同工酶標(biāo)志的16個組合20個單株系，其特性都具有短枝習(xí)性，短枝比在60 80%之間，以短枝結(jié)果為主，坐果率高。用同工酶標(biāo)志早期預(yù)選對提高矮生習(xí)性的中選率是有效的。②早熟性以選擇早熟性為主要目標(biāo)，由35個熟期不同的親本，組配成晚X晚組合16個，晚X中組合25個，晚X早組合6個，中X早組合5個，中X中組合8個，共60 個組合。獲得雜種實生苗1535株，經(jīng)同工酶早期預(yù)選后，再按常規(guī)選育程序繼續(xù)選擇，最后中選16個組合，68個單株，這些單株在2-3年齡即始花結(jié)果，其中有中X早組合的1株，熟期60天，晚X早組合的30株，熟期80-95天，晚X中組合的18株，熟期90-120天，晚X 晚組合；16株熟期95 105天；其余3株熟期在150-160天。用同工酶標(biāo)志早期預(yù)選能提高早熟性單株的中選率。③選擇效率同工酶標(biāo)志早期預(yù)選與常規(guī)選育相結(jié)合的程序研究，開始于1992 年，1993年間，以39個親本組配成60個組合的雜交種子，1993年播種并進行同工酶早期預(yù)選，以后又按形態(tài)指標(biāo)選擇，經(jīng)1994年嚴格篩選，選擇植株健壯，枝短葉肥，色濃綠，芽飽滿，無病蟲害的單株306株，1996 1997年間始花結(jié)果，精選16個組合，68個品質(zhì)優(yōu)良單株。至1999年決選獲得優(yōu)良組合8個，株系22個，組合選擇效率為13%，單株選擇效率為 1. 4%。采用同工酶標(biāo)志與常規(guī)選育相結(jié)合的程序，僅在7年內(nèi)，在3畝苗圃地上，完成了 60 個雜交組合，1535株實生苗的全部選擇過程，并取得了良好的選擇效果。采用本項選育程序確實能顯著地提高蘋果選育進度，并能節(jié)省資源。4、選擇程序建成由同工酶標(biāo)志早期預(yù)選與常規(guī)選育相結(jié)合的高效選擇程序(圖 3)，專項試驗證明其特點是目標(biāo)明確，選擇效率高，周期短，進度快，能提高資源利用率。試驗結(jié)果如下①親本的選擇與組配選用豐產(chǎn)水平高，適應(yīng)性廣，綜合抗性強的當(dāng)?shù)刂鬏d品種， 如富士等；選用符合育種目標(biāo)要求的，豐產(chǎn)性好的早熟種質(zhì)，矮生習(xí)性種質(zhì)，開花結(jié)果習(xí)性優(yōu)良的種質(zhì)，綜合抗性強的種質(zhì)，選用目標(biāo)性狀遺傳力強的種質(zhì)等。共選擇39個親本材料， 共組配成60個雜交組合，其中有富士系為親本的雜交組合占20. 3%，晚熟種為親本的雜交組合占38. 9%，中熟種為親本的雜交組合占32. 2 %，早熟種為親本的雜交組合占8. 4%，獲得雜交種子7137粒，1992 1993年間育成雜交種實生苗1535株，予編號，掛牌。②早期預(yù)選按照矮生型同工酶標(biāo)志的要求，對2 3月令實生苗進行早期預(yù)選， 淘汰沒有同工酶標(biāo)志實生苗，占40-50%，對具有同工酶標(biāo)志的實生苗，進入常規(guī)選育階段。③常規(guī)選育1993 1994年間對具有同工酶標(biāo)志的實生苗進行系統(tǒng)選育，先是淘汰有野生性狀的單株，如枝條下垂、長有刺、蔓生、葉片弱小、植株生長不端正的、有病蟲害的單株，選擇植株健壯、枝條短粗、葉片肥大、色綠、芽大、飽滿，植株生長端正，無病蟲害的單株306株，并嫁接與八棱海棠，M26，高接于大樹，觀察生長開花習(xí)性。
1995-1997年間，中選的306株優(yōu)良株系陸續(xù)開花結(jié)果，根據(jù)開花結(jié)果習(xí)性，果實大小、色澤、品質(zhì)、口味等性狀，選中了 16個組合，68個優(yōu)良單株。A、中熟X早熟組合41有1個單株，95年始花結(jié)果15個，96年結(jié)果99個，6月下旬成熟，熟期65天，特早熟。B、晚熟X早熟有3個組合，30個單株，其中組合M，有20個單株，95年結(jié)果30 個，96年結(jié)果157個，品質(zhì)優(yōu)良，7月中下成熟，熟期80-90天；組合22，有2個單株，95年始花結(jié)果1個，96年開花結(jié)果12個，果大、色紅，6月底成熟，熟期75天。組合37，有8個單株，96年始花結(jié)果22個，果大、色紅，7月底成熟，熟期95天。C、晚熟X中熟7個組合，18個單株。其中組合10，有6個單株，95年結(jié)果2個， 96年結(jié)果M個，全紅、濃香，7月初成熟，熟期70天；組合21，有6個單株，95年結(jié)5個果， 96年結(jié)51個果，紅色，7月上成熟，熟期75天；組合33，有3個單株，96年結(jié)17個果，全紅， 8月中下成熟。還有組合18、31、25、23，各中選1株。D、晚熟X晚熟，5個組合，19個單株，其中組合6，有9個單株，95年結(jié)2個果，96 年結(jié)34個果，全紅，8月中成熟，熟期115天；組合32，有6個單株，95年結(jié)5個果，96年結(jié) 78個果，全紅，8月中成熟，熟期105天；組合56，有2個單株，綠色、多汁、優(yōu)質(zhì)，8月上成熟， 熟期105天。還有組合30、29，晚熟，熟期150 160天。1998 1999年間，根據(jù)豐產(chǎn)性、穩(wěn)產(chǎn)性及耐貯性進行最后決選，要求單株產(chǎn)量在 6kg以上，高產(chǎn)單株產(chǎn)量16kg以上，果實品質(zhì)優(yōu)良，耐貯運的單株，共入選22個株系，99年移栽到生產(chǎn)地。2004年平均單株產(chǎn)量62. 95kg，變幅50-72. 55、早熟優(yōu)質(zhì)蘋果新品系按照早期預(yù)選與常規(guī)選育相結(jié)合的程序，育成的早熟優(yōu)質(zhì)新品系，有香苑1號、香苑2號、香苑3號、香苑5號、香苑6號、香苑7號、香苑8號、香苑12號等20多個優(yōu)良品系， 其前列八個品系已通過專家鑒定。


圖1，為制備淀粉凝膠制膠模具圖； 圖2，為電泳槽裝置圖3，為同工酶早期預(yù)選與常規(guī)選擇相結(jié)合的選育程序簡圖。 圖4，為緩沖液配方圖。
權(quán)利要求
1.前序部分本發(fā)明主題是蘋果早期預(yù)選培育新品種技術(shù)，其特點是用同工酶標(biāo)志 (E9帶)對蘋果雜種實生苗早期預(yù)選與常規(guī)選擇育種程序相比，選擇效率高、進度快。
2.特征部分本項發(fā)明的特征是1、蘋果早期預(yù)選的同工酶標(biāo)志(E9)與蘋果矮生習(xí)性密切相關(guān)，測試操作簡便、可靠性高，穩(wěn)定性好，遺傳性穩(wěn)定，測試準(zhǔn)確率為1.4%，適于蘋果屬不同種、品種，不同栽培條件，具有一定普遍性。2、蘋果實生苗同工酶早期預(yù)選與常規(guī)選擇相結(jié)合的選擇程序，能減少選擇的隨意性， 提高選擇效率，加快育種進度。`3、同工酶早期預(yù)選與常規(guī)選擇相結(jié)合的專項試驗證明由60個雜交組合，1535株實生苗，經(jīng)同工酶預(yù)選后，組合中選率達13. 0%，單株中選率為1. 4%，明顯高于常規(guī)選擇效率。本項發(fā)明專利要求，包括前序部分和特征部分特點是A.雜種實生苗同工酶早期預(yù)選標(biāo)志(E9)；B.雜種實生苗同工酶早期預(yù)選與常規(guī)選擇相結(jié)合的選育程序。
全文摘要
本項發(fā)明矮生型蘋果(包括矮生、半矮生、短枝型及具有矮化作用，矮化潛力)同工酶早期預(yù)選與常規(guī)選育相結(jié)合的選育程序。同工酶標(biāo)志可靠性高、穩(wěn)定性強，準(zhǔn)確率高(86.14％)用以對當(dāng)年生雜種實生苗進行早期預(yù)選，能提高選擇效率，加快育種進度。能在短期內(nèi)獲得大量優(yōu)良單株。同工酶早期預(yù)選專項試驗是對60個雜交組合1535株實生苗，采用本發(fā)明的選育程序，能顯著加快選育進度，提高選擇效率，單株中選率1.2％，在十多年內(nèi)育成了20多個優(yōu)良株系。其中8個品系已通過專家鑒定。這對蘋果育種程序的改進具有重要意義。
文檔編號A01H1/04GK102342244SQ20111002769
公開日2012年2月8日 申請日期2011年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月26日
發(fā)明者唐秀芝 申請人:唐秀芝