專利名稱：一種防治蔬菜卵菌病的芽孢桿菌及生物制劑與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于屬生物農藥技術領域，特別涉及一種防治蔬菜卵菌病的芽孢桿菌及生物制劑與應用。
背景技術：
蔬菜是我國重要的出口創(chuàng)匯農產品，栽培面積僅占總耕地面積的13%左右，但年均總產值達8000多億元，年均出口創(chuàng)匯達60億美元。蔬菜病害已成為制約蔬菜產業(yè)的重大問題，其中卵菌病害給蔬菜生產造成嚴重的損失，蔬菜卵菌病害主要包括辣椒疫病、黃瓜疫病、黃瓜霜霉病、大白菜霜霉病等，全國范圍內四種蔬菜卵菌病害年損失近幾百億元。我國蔬菜卵菌病害對常規(guī)化學藥劑普遍產生抗性，導致防效下降，施藥量增加，殘留量加重。因此，開發(fā)生物殺線蟲劑具有十分重要的意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術的缺點與不足，提供一種防治蔬菜卵菌病的芽孢桿菌。本發(fā)明的另一目的在于提供一種防治蔬菜卵菌病的生物制劑，該生物制劑含有上述防治蔬菜卵菌病的芽孢桿菌。本發(fā)明的再一目的在于提供所述防治蔬菜卵菌病的生物制劑的制備方法和應用。本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn)一種防治蔬菜卵菌病的芽孢桿菌 (Bacillus sp.)，名稱為芽孢桿菌PPRI 78，于2010年12月27日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為 CCTCC NO =M 2010365 ；所述細菌PPRI 78形態(tài)及生理生化特性單個細胞(0. 6 0. 8) X O. 2 3. 0) μ m，無莢膜，周生鞭毛，革蘭氏陽性菌，芽孢(0.7 0. 9) X (1.0 1.4) μ m，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，需氧菌?？衫玫鞍踪|、木糖、 果糖、蔗糖、葡萄糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。所述細菌PPRI 78 的 16S rDNA 序列在 GeneBank 與 Bacillus sp. DYJL30 比對，同源率100%，系統(tǒng)發(fā)育樹與Bacillus sp. DYJL30聚為一枝，但其形態(tài)有一定的差異；所述芽孢桿菌PPRI 78根據其形態(tài)、生理生化特征及16S rDNA序列分析，故命名為 Bacillus sp. PPRI 78 ；一種防治蔬菜卵菌病的生物制劑，含有上述芽孢桿菌PPRI 78；所述防治蔬菜卵菌病的生物制劑還含有固體粉劑；所述的固體粉劑的粒徑優(yōu)選小于1毫米；所述的固體粉劑優(yōu)選滑石、高嶺土、膨潤土、硅藻土、陶土或麩皮中的至少一種；所述防治蔬菜卵菌病的生物制劑的制備方法，包括以下步驟將芽孢桿菌 Bacillus sp. PPRI 78菌體與固體粉劑混和得到。所述防治蔬菜卵菌病的生物制劑的制備方法，優(yōu)選包括以下步驟
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(1)菌種活化在滅菌的NA培養(yǎng)基中接入芽孢桿菌PPRI 78進行搖瓶培養(yǎng)；搖瓶培養(yǎng)條件如下 30°C，轉速為170 200轉/min、培養(yǎng)時間為8 16小時；得到活化的菌種；NA培養(yǎng)基的組成為每升含有牛肉膏3g、酵母膏l(xiāng)g、蛋白胨5g、葡萄糖10g，水定容至 IOOOmL, pH 為 7. 2 7. 4 ；(2)菌體的大量繁殖發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)基為LA培養(yǎng)基，發(fā)酵的條件如下裝液量為發(fā)酵罐體積的70%，培養(yǎng)基滅菌后接種步驟(1)得到的活化的菌種，接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的5 10%，泡敵量為體積百分比0. 05 0. 1 %，初始pH為7. 0 7. 2，發(fā)酵溫度28 30°C、發(fā)酵培養(yǎng)12 36小時，期間分別取樣鏡檢菌體數(shù)，菌體老化前停止發(fā)酵；LA培養(yǎng)基的組成為每升含有玉米淀粉3g、大豆蛋白粉15g、玉米漿25g、 MnSO4O. 030ang、K2HP043g、KH2PO4 1. 5g、MgS04 0. 5g、FeS04 0. lg、CaC03lg，水定容至 IOOOmL, ρΗ7· 0 ；(3)防治蔬菜卵菌病的生物制劑的制備將步驟(2)得到的發(fā)酵液離心，得到菌體；將菌體與固體粉劑進行混和，然后干燥至水分相對濕度小于質量百分比10%、粉碎，得到防治蔬菜卵菌病的生物制劑。步驟(1)中所述的搖瓶培養(yǎng)的條件更優(yōu)選為搖瓶裝液量為搖瓶體積的1/5，觀 30°C，轉速為170 200轉/min、培養(yǎng)時間為8 16小時；步驟(2)中所述離心的條件優(yōu)選為轉速為15000 20000rpm，溫度為25 30°C;步驟(3)中所述的菌體與所述的固體粉劑優(yōu)選按質量百分比5%進行混合；步驟(3)中所述的固體粉劑的粒徑優(yōu)選小于1毫米步驟(3)中所述的固體粉劑優(yōu)選滑石、高嶺土、膨潤土、硅藻土、陶土或麩皮中的至少一種；步驟(3)中所述的干燥是流化床干燥；流化床干燥的優(yōu)選溫度為50 70°C ；所述防治蔬菜卵菌病的生物制劑的使用方法可以是拌種或淋施，也可以是噴霧；所述防治蔬菜卵菌病的生物制劑的使用時期可以是蔬菜種子期，苗期和成株期。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術具有如下的優(yōu)點及效果本發(fā)明的制備方法有效地促進了芽孢桿菌PPRI 78的增殖。本發(fā)明通過對芽孢桿菌PPRI 78進行深層液體發(fā)酵，獲得大量的菌體；收集菌體與相應的固體粉劑制備成粉劑。 本發(fā)明具有原料成本低，生產工藝先進等特點，所制成的防治蔬菜卵菌病的生物制劑對蔬菜卵菌病害防治效果達到70 75%，無毒，安全，環(huán)保。
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例1(1)細菌的分離采用平皿稀釋法分離采自廣東廣州市天河區(qū)五山的菜地土壤的細菌，將土壤樣品用無菌水稀釋成10_6、IO-7,10_8、10_9、10_1Q梯度濃度，NA固體培養(yǎng)基(牛肉膏3g、酵母膏l(xiāng)g、 蛋白胨5g、葡萄糖10g，瓊脂18g，水定容至1000mL，pH為7. 2 7. 4)滅菌后倒入9cm平皿中(每皿約15mL)，用移液管每濃度移取0. Iml放入每皿中，用涂布棒均勻涂布，每濃度重復10皿，30-32°C下培養(yǎng)M-30h后，選取每皿生長10-30個細菌菌落的平皿進行挑取，無菌操作抑制NA試管斜面，30-32 °C培養(yǎng)M_30h后保存?zhèn)溆谩?2)防治蔬菜卵菌病的細菌的篩選將步驟(1)分離得到的細菌進行篩選，采用對峙培養(yǎng)法。將滅菌好的V8固體培養(yǎng)基(V8固體培養(yǎng)基組分為美國進口 V8蔬菜汁lOOmL，CaCO3O. 2g，瓊脂18g，水定容至IOOOmL) 倒入9cm的平皿中(每皿約15mL)，冷卻后，將生長的好的辣椒疫霉菌(辣椒抗疫病鑒定方法初探，天津農業(yè)科學，2010，16 (5) =100-103)和黃瓜疫霉病菌FR-58 (新型殺菌劑氟嗎啉對黃瓜疫霉病菌細胞壁主要組分合成及分布的影響.高等學?；瘜W學報，2007, ) 658-662)的瓊脂塊(6mm)放在平皿，2648°C培養(yǎng)24h后，將分離得到的細菌用移植環(huán)挑取后點在距病菌瓊脂塊3cm處，2648°C培養(yǎng)培養(yǎng)7 后，觀察辣椒疫霉菌和黃瓜疫霉病菌的生長情況。如細菌對病菌有抑制作用，則有明顯的抑菌帶；如細菌對病菌無抑制作用，則無抑菌帶。篩選得到一株對辣椒疫霉菌和黃瓜疫霉病菌具有明顯的抑制作用的細菌，其對辣椒疫霉菌和黃瓜疫霉病菌的抑菌帶寬度分別為1.6cm和1.5cm生防菌，命名為細菌PPRI 78。實施例2細菌PPRI 78的分類鑒定(1)形態(tài)及生理生化特征采用NA培養(yǎng)基平皿，將細菌PPRI 78通過稀釋平皿法和劃線法進行純化，與32 35°C條件下用NA培養(yǎng)基(牛肉膏3g、酵母膏l(xiāng)g、蛋白胨5g、葡萄糖10g，水定容至IOOOmL, pH為7. 2 7. 4)培養(yǎng)1 Mh，并進行革蘭氏染色及菌體形態(tài)和菌落特征觀察；參照張紀忠(1990)的方法進行需氧試驗、碳源利用試驗、吲哚試驗。單個細胞(0.6 0.8) X O. 2 3.0) μ m，無莢膜，周生鞭毛，革蘭氏陽性菌，芽孢 (0. 7 0. 9) X (1. 0 1. 4) μ m，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，菌落表面粗糙不透明， 污白色或微黃色，需氧菌，可利用蛋白質、木糖、果糖、蔗糖、葡萄糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。(2) 16S rDNA 序列分析采用細菌通用16S rRNA 擴增引物序列 27F(5，-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3，)、 1492R(5，-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，)擴增16S rRNA基因片段，擴增產物由英濰捷基(上海)貿易有限公司測序后，將所測的16SrDNA序列(如下所示)與GenBank數(shù)據庫中所有已測定的原核生物16S rDNA序列進行比較。該菌株的16S rDNA序列在GeneBank與BaciIlus sp. DYJL30比對，同源率100%，系統(tǒng)發(fā)育樹與Bacillus sp. DYJL30聚為一枝，但其形態(tài)有一定的差異。1tggctcctaaaggttacctcaccgacttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggc61ggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcga121ttccagcttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccgaactgagaacag atttgtggga181ttggcttaacctcgcggtttcgctgccctttgttctgtccattgtagcacgtgtgtagcc241caggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccgg301cagtcaccttagagtgcccaactgaatgctggcaactaagatcaagggttgcgctcgttg
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1381gagcaagctcccatctgtccgctcgacttgca 根據生理生化特征以及16S rDNA序列分析，可知該菌株屬于芽孢桿菌，將其命名為芽孢桿菌Bacillus sp.PPRI 78，于2010年12月27日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心 (CCTCC，湖北武漢大學內)，保藏編號為CCTCC NO :M2010365o實施例3芽孢桿菌PPRI 78生物制劑制備(1)菌種的活化配制NA培養(yǎng)基(每升的組成為牛肉膏3g、酵母膏l(xiāng)g、蛋白胨 5g、葡萄糖10g，水定容至1000mL，pH為7. 2 7. 4)后，每個規(guī)格為500mL的三角瓶中裝NA 培養(yǎng)基IOOmL, 121滅菌15min。冷卻后接入芽孢桿菌PPRI 78 (平板上的培養(yǎng)菌1環(huán))，放入搖床內發(fā)酵培養(yǎng)，溫度^°C，轉速為200轉/min、培養(yǎng)時間為16小時，得到活化的菌液；(2)種子液的準備應用100L的發(fā)酵罐進行發(fā)酵，發(fā)酵液為LA培養(yǎng)基(每升的組成為玉米淀粉 3g、大豆蛋白粉 15g、玉米漿 25g、MnS04 0 . 0 3 08mg, K2HPO4 3g、KH2PO4 1. 5g、 MgSO4 0. 5g, FeSO4 0. lg、CaCO3 lg，水定容至 IOOOmL, ρΗ7· 0)，裝液量為 70L，將步驟(1)得到的活化的菌液5L接種至100L發(fā)酵罐，泡敵量(體積百分比)為0. 05%，初始ρΗ為7. 2， 發(fā)酵溫度30°C、發(fā)酵培養(yǎng)M小時；(2)菌體的大量繁殖應用1000L生物發(fā)酵罐發(fā)酵進行發(fā)酵，發(fā)酵液為LA培養(yǎng)基， 裝液量為700L，接種步驟( 得到的活化的菌種70L，泡敵量(體積百分比)為0. 05%，初始ρΗ為7. 2，發(fā)酵溫度30°C、發(fā)酵培養(yǎng)36小時，期間分別取樣鏡檢菌體數(shù)，菌體尚未老化；(3)生物制劑制備將發(fā)酵液于室溫、20000rpm進行離心，獲得的菌體與粒徑小于 1毫米的固體粉劑(由滑石、高嶺土和膨潤土按質量比1 1 1混合而得)進行混和，菌體含量占質量百分比5%，然后流化床干燥，流化床干燥的條件是溫度不高于70°C，干燥至水分相對濕度小于質量百分比10%、粉碎，得到防治蔬菜卵菌病的生物制劑。實施例4
獲得的菌體防治蔬菜卵菌病的生物制劑的效果實驗測定(1)試驗生物制劑實施例3獲得的生物制劑，菌體含量為SXlO^cfu/g。(2)辣椒疫霉病菌游動孢子懸浮液將辣椒疫霉病菌接種至V8培養(yǎng)液(V8蔬菜汁 10%, CaCO3 0.02%，水定容至IOOOmL)中，沈 培養(yǎng)5 7天，過濾菌絲得到孢子懸浮液，用血球計數(shù)板計數(shù)并稀釋至濃度800cfu/mL。(3)溫室實驗在溫室培養(yǎng)辣椒苗，待辣椒苗長至3片葉左右時，用實施例2獲得的芽孢桿菌PPRI 78生物制劑1 800待測液噴施葉片，以甲霜靈可濕性粉劑為陽性對照 (CKl)、清水噴霧為陰性對照(CD)。噴施4-6小時后用辣椒疫病菌，游動孢子懸浮液(濃度為800cfU/mL)進行接種，28-30°C培養(yǎng)3-4天后調查葉發(fā)病率，計算防治效果，結果如表 1所示。表IPrai 78防治辣椒疫病效果
權利要求
1.一種防治蔬菜卵菌病的芽孢桿菌(Bacillus sp.)，其特征在于名稱為芽孢桿菌 PPRI 78，于2010年12月27日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO =M 2010365。
2.一種防治蔬菜卵菌病的生物制劑，其特征在于含有如權利要求要求1所述的芽孢桿菌 PPRI 78。
3.如權利要求2所述的防治蔬菜卵菌病的生物制劑，其特征在于所述防治蔬菜卵菌病的生物制劑還含有固體粉劑。
4.如權利要求3所述的防治蔬菜卵菌病的生物制劑，其特征在于所述的固體粉劑的粒徑小于1毫米。
5.如權利要求3所述的防治蔬菜卵菌病的生物制劑，其特征在于所述的固體粉劑為滑石、高嶺土、膨潤土、硅藻土、陶土或麩皮中的至少一種。
6.權利要求2 5任一項所述防治蔬菜卵菌病的生物制劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟將芽孢桿菌PPRI 78菌體與固體粉劑混和得到。
7.如權利要求6所述防治蔬菜卵菌病的生物制劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)菌種活化在滅菌的NA培養(yǎng)基中接入芽孢桿菌PPRI 78進行搖瓶培養(yǎng)；搖瓶培養(yǎng)條件如下28 30°C，轉速為170 200轉/min、培養(yǎng)時間為8 16小時；得到活化的菌種；NA培養(yǎng)基的組成為每升含有牛肉膏3g、酵母膏l(xiāng)g、蛋白胨5g、葡萄糖10g，水定容至 IOOOmL, pH為7. 2 7. 4 ；⑵菌體的大量繁殖發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)基為LA培養(yǎng)基，發(fā)酵的條件如下裝液量為發(fā)酵罐體積的70%，培養(yǎng)基滅菌后接種步驟(1)得到的活化的菌種，接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的5 10%，泡敵量為體積百分比0. 05 0. 1 %，初始pH為7. 0 7. 2， 發(fā)酵溫度觀 30°C、發(fā)酵培養(yǎng)12 36小時，期間分別取樣鏡檢菌體數(shù)，菌體老化前停止發(fā)酵；LA培養(yǎng)基的組成為每升含有玉米淀粉3g、大豆蛋白粉15g、玉米漿25g、MnSO4 0. 0308mg、K2HPO4 3g、KH2PO4 1. 5g、MgSO4 0. 5g、FeSO4 0. lg、CaCO3Ig,水定容至 lOOOmL， pH7. 0 ；(3)防治蔬菜卵菌病的生物制劑的制備將步驟( 得到的發(fā)酵液離心，得到菌體；將菌體與固體粉劑進行混和，然后干燥至水分相對濕度小于質量百分比10%、粉碎，得到防治蔬菜卵菌病的生物制劑。
8.如權利要求7所述防治蔬菜卵菌病的生物制劑的制備方法，其特征在于步驟(1) 中所述的搖瓶培養(yǎng)的條件為搖瓶裝液量為搖瓶體積的1/5，28 30°C，轉速為170 200轉 /min、培養(yǎng)時間為8 16小時；步驟O)中所述離心的條件為轉速為15000 20000rpm，溫度為25 30°C ；步驟(3)中所述的菌體與所述的固體粉劑優(yōu)選按質量百分比5%進行混合；步驟(3)中所述的干燥為流化床干燥，溫度為50 70°C。
9.權利要求2 5任一項所述防治蔬菜卵菌病的生物制劑的應用，其特征在于所述防治蔬菜卵菌病的生物制劑的使用方法為拌種、淋施或噴霧。
10.權利要求2 5任一項所述防治蔬菜卵菌病的生物制劑的應用，其特征在于所述防治蔬菜卵菌病的生物制劑的使用時期為蔬菜種子期、苗期和/或成株期。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種防治蔬菜卵菌病的芽孢桿菌及生物制劑與應用。該名稱為芽孢桿菌PPRI 78，于2010年12月27日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NOM2010365。將芽孢桿菌PPRI 78進行深層液體發(fā)酵，獲得大量的菌體，將菌體與固體粉劑混合，即可得到防治蔬菜卵菌病的生物制劑。該生物制劑成本低，對蔬菜卵菌病害防治效果達到70～75％，無毒，安全，環(huán)保。
文檔編號A01N63/02GK102154179SQ20111003041
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月28日 優(yōu)先權日2011年1月28日
發(fā)明者李培謙, 林壁潤, 沈會芳, 潘群英, 蒲小明 申請人:廣東省農業(yè)科學院植物保護研究所