專利名稱：具毒殺植物線蟲活力的生防真菌Gloeotinia的制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于微生物農(nóng)藥技術領域，具體涉及一種毒殺植物寄生線蟲的真菌及其制備方法。
背景技術：
植物寄生線蟲在世界上許多國家和地區(qū)發(fā)生和為害，種類多種多樣。在全球范圍內(nèi)，植物寄生線蟲的發(fā)生與危害隨著農(nóng)林業(yè)的發(fā)展和耕作栽培制度的變化日益嚴重，據(jù) hser統(tǒng)計，到1990年為止全世界已報道發(fā)現(xiàn)植物寄生線蟲207屬4832種(劉維志，段玉璽.2000.植物病原線蟲學.北京中國農(nóng)業(yè)出版社，pl-2)。據(jù)估計，植物寄生線蟲造成世界主要農(nóng)作物的年損失率為12.3%，超過1000億美元，而實際的損失遠遠超過估計，理由是許多線蟲造成的危害因沒有剛間可見癥狀或?；蕴卣鞫匆鹱⒁?Sasser，1986)， 此外，世界范圍內(nèi)對線蟲為害的新發(fā)現(xiàn)還在不斷增加，而且一些更新的農(nóng)業(yè)栽培體制使線蟲問題更加突出，再者，線蟲與其它生物相互作用而對植物產(chǎn)生的直接或間接影響還在急劇增加。在我國主要有根結線蟲、大豆胞囊線蟲、松材線蟲、甘薯莖線蟲等病原線蟲造成嚴重危害，尤其根結線蟲是世界農(nóng)業(yè)上為害最大的一類病原線蟲，病害發(fā)生后，一般減產(chǎn)10% 左右，嚴重的高達 75% 以上，甚至絕收(Whitehead A. G. , 1998. Plant Nematode Control. ISBN0851991882CAB hternational)。目前，植物寄生線蟲的防治仍以化學防治為主，但近年來化學殺線劑的應用浪費大，污染環(huán)境，高毒高殘留，破壞土壤生物區(qū)系等弊端日益為人們所重視(張克勤，何世川，周薇等.1991.真菌和細菌在線蟲生防中的作用及其研究進展.殺蟲微生物.3 55-66)，一些有效的化學殺線劑的應用陸續(xù)受到限制，因此對植物寄生線蟲的生物防治研究自然成為熱點問題。早在60年代Olthof等在觀察食線蟲真菌Arthrobotrys oligospora Fres.捕食線蟲的過程中提出了真菌產(chǎn)生殺線蟲代謝物質的假說。1984年Thorn等發(fā)現(xiàn)高等擔子菌 Pleurotus spp.產(chǎn)生毒素毒殺線蟲，1992年Kwork等證實該毒素為癸烯二酸，至今從高等真菌的次級代謝物中尋找殺線蟲活性物質已成為新的研究熱點。如大黃酚chrysophanol 不僅是普遍的植物新陳代謝物而且也廣泛存在灰綠曲霉(Aspergillus glaucus)、多孢木霉(Trichoderma polysporum)、鹿角毛殼菌(Chaetomium elatum)、豌豆深褐斑菌 (Ascochyta pisi)和蓮點霉屬菌(Phoma spp.)中，大黃素emodin分布也廣可從灰綠曲霉許多擔子菌和地衣等真菌中獲得，它們對根結線蟲有微弱毒性。生物堿phenoxazone首先從血紅密孑Llif Pycnoporus sanguineus中獲得，后來又從虎皮香杏菌Calocybe gambosa 的發(fā)酵菌絲體中分離出對南方根結線蟲M. incognita的ED50為50yg/ml。環(huán)縮肽白僵菌素beauvericin可從球孢白僵菌Beauveria bassiana、玫煙色擬青霉Paecilomyces fumosoroseus和鐮刀屬菌Fusarium spp.中分離得到，發(fā)現(xiàn)它對M. incognita有微弱活性。 1997年，Mayer和Merner等從奧爾類臍菇Omphalotus olearius的發(fā)酵液中分離到一高活性環(huán)十二縮肽物質omphalotin對根結線蟲的ED50為0. 75 μ g/ml,比商品殺線蟲劑阿維菌素更具活性而且無抗菌性、不毒害植物，具有商業(yè)利用前景。
真菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物具有豐富的結構多樣性，因此真菌作為線蟲的生防因子展現(xiàn)出巨大的發(fā)展前景。本發(fā)明正是基于上述理論，以植物寄生線蟲為靶標，尋找具有高效殺線蟲活性物質生防真菌，為進一步研究開發(fā)新型生物殺線蟲劑尋找新的資源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是篩選獲得對植物線蟲具高殺蟲活性的真菌菌株，將菌株按常規(guī)液體發(fā)酵培養(yǎng)后，從中獲取具殺線蟲活性的代謝產(chǎn)物，開發(fā)新的殺線蟲生物農(nóng)藥，其中，所述的植物線蟲是南方根結線蟲Meloidogyne incognita，大豆胞囊線蟲Heterodera glycines 禾口水稻干尖線蟲 Aphelenchoides besseyi。本發(fā)明篩選到的一株具有殺線蟲活性的真菌菌株Snef5是Gloeotinia nematicida,已于2011年1月M日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC No. 4549。Snef5是在利用選擇性培養(yǎng)基分離白僵菌過程中發(fā)現(xiàn)的一種與白僵菌相伴生的特殊真菌，該菌株分離于吉林省遼源市采集的被白僵菌侵染的繭蛹上，而且這種真菌對植物線蟲具有良好殺線蟲活性，因此被深入研究其發(fā)酵及其對靶標線蟲的毒殺作用。本發(fā)明涉及真菌菌株Snef5或其代謝物具有殺線蟲活性物質，可用于植物寄生線蟲的生物防治，特別是根結線蟲的防治。為了更詳細地進一步闡明而不是為了限制本發(fā)明， 給出了下列實施例。
具體實施例方式本發(fā)明還涉及用于防治植物寄生線蟲的真菌代謝物，是由本發(fā)明的真菌Snef5經(jīng)過常規(guī)的液體發(fā)酵培養(yǎng)后提取制備的。本發(fā)明的真菌菌株Snef5通過試管斜面菌種培養(yǎng)后，再經(jīng)擴大發(fā)酵培養(yǎng)來制備，然后對發(fā)酵培養(yǎng)后的代謝產(chǎn)物進行殺線蟲活性試驗，確定其對線蟲的作用。實施例1 菌株Snef5的培養(yǎng)Snef5的單菌落接種到試管斜面的瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基配方為PSA培養(yǎng)基馬鈴薯200g、蔗糖20g、瓊脂17g、水1000ml，28°C培養(yǎng)7d，獲得試管斜面菌種。再將試管斜面菌種接種到150mL三角瓶(每瓶裝50mL)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為含(NH4)2SO4 3. 67g、KCl 0. 96g、FeSO4 0. 02g、K2HPO4 0. 64g、MgSO4 · 5H20 1. 04g、蔗糖 28. 3g、蒸餾水 1000ml, pH 為 7. 2，25°C 28°C下，搖床轉速以 150r · mirT1 200r · mirT1、 發(fā)酵16 。培養(yǎng)好的發(fā)酵液用濾紙經(jīng)布氏漏斗抽濾，去除菌絲體，獲得濾液中的殺線蟲活性物質。將發(fā)酵濾液配成不同的倍數(shù)進行殺線蟲藥效試驗。實施例2 菌株Snef5的殺線蟲活性測定將發(fā)酵濾液在原液的基礎上依次稀釋為2X、5X、10X、20X、50X，分別對大豆胞囊線蟲J2、南方根結線蟲J2和水稻干尖線蟲進行殺線蟲活性試驗。在經(jīng)滅菌的特制的貝氏小皿內(nèi)中加入稀釋2X的試驗用發(fā)酵液各lmL，以加ImL無菌水作為對照，然后分別向處理和對照中各加入大豆胞囊線蟲、南方根結線蟲或水稻干尖線蟲約100條，放入25°C培養(yǎng)箱中，24h和4 分別記錄線蟲死亡率，計算校正死亡率即為殺線蟲藥效。每處理重復3次。
權利要求
1.一種具有殺線蟲活性的生防真菌Snef5，其特征在于該菌株為Gloeotinia nematicida,已于2011年1月M日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo. 4549。
2.權利要求1所述的菌株Snef5斜面菌種的制備方法，其特征在于培養(yǎng)基配方馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂17g，水1000ml，25°C培養(yǎng)7d，獲得試管斜面菌種。
3.權利要求1所述的菌株Snef5具殺線蟲活性液體發(fā)酵液的制備方法，其特征在于液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方(NH4) 2804 3. 67g，KCl 0. 96g，F(xiàn)eSO4 0. 02g, K2HPO4 0. 64g，MgSO4 · 5H20 1. 04g，蔗糖 28. 3g，蒸餾水 1000ml，25 °C 28 °C，搖床轉速 150r · mirT1 200r · mirT1，發(fā)酵16他，培養(yǎng)好的發(fā)酵液用濾紙經(jīng)布氏漏斗抽濾，去除菌絲體，獲得濾液中的殺線蟲活性物質。
4.一種殺線蟲制劑，其特征在于包含有效量的權利要求1所述的真菌或權利要求3 所述的菌株發(fā)酵濾液作為活性成分。
5.權利要求1所述的真菌或權利要求3所述的真菌發(fā)酵濾液在植物寄生線蟲生物防治中的應用。
6.根據(jù)權利要求5所述的應用，其特征在于所述的植物寄生線蟲為根結線蟲 Meloidogynespp.、大豆胞囊線蟲 Heterodera glycines 禾口水禾酉干尖線蟲 Aphelenchoides besseyi。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株具毒殺植物線蟲作用的真菌的培養(yǎng)方法及其代謝物制備方法，屬于微生物農(nóng)藥技術領域。本發(fā)明涉及的真菌菌株Snef5為Gloeotinia nematicida，已于2011年1月24日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)大屯路，郵編100101)，保藏號為CGMCC No.4549。該真菌菌株Snef5的分類地位是子囊菌門Ascomycota，子囊菌綱Ascomycetes，柔膜菌目Helotiales，絲核菌科Sclerotiniaceae，Gloeotinia屬真菌。通過液體發(fā)酵培養(yǎng)制備，其代謝產(chǎn)物對植物寄生線蟲中的重要病原線蟲包括根結線蟲、大豆胞囊線蟲和水稻干尖線蟲具有很高毒力，殺線蟲效果明顯，具良好的應用開發(fā)前景。
文檔編號A01N63/04GK102250775SQ20111004924
公開日2011年11月23日 申請日期2011年3月2日 優(yōu)先權日2011年3月2日
發(fā)明者劉彬, 朱曉峰, 段玉璽, 王媛媛, 趙迪, 陳立杰 申請人:沈陽農(nóng)業(yè)大學