專利名稱：利用半胱氨酸蛋白酶增強(qiáng)植物介導(dǎo)的昆蟲rna干擾的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和植物學(xué)領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及一種利用半胱氨酸蛋白酶增強(qiáng)植物介導(dǎo)的昆蟲RNA干擾的方法。
背景技術(shù)：
在農(nóng)業(yè)上，蟲害問題一直是影響農(nóng)作物產(chǎn)量的一個(gè)重要因素。人們每年要投入大量的人力、物力來抑制蟲害，以提高作物產(chǎn)量。
隨著農(nóng)業(yè)害蟲對(duì)農(nóng)藥的抗性增加，以及出于保護(hù)環(huán)境和可持續(xù)性發(fā)展的考慮，迫切需要新的抗蟲方法的出臺(tái)。轉(zhuǎn)基因抗蟲植物的出現(xiàn)緩解了這一矛盾，為農(nóng)業(yè)的發(fā)展作出了重大貢獻(xiàn)，如轉(zhuǎn)基因抗蟲大豆，Bt抗蟲棉等。然而，目前已陸續(xù)有研究報(bào)道，隨著時(shí)間的推移，各種轉(zhuǎn)基因抗蟲植物的抗性正在下降，以前大規(guī)模罕見的蟲害現(xiàn)象又開始死灰復(fù)燃。 因此，迫切需要找到新的方法，開發(fā)出新型的轉(zhuǎn)基因抗蟲植物，以有效地和/或特異性地對(duì)抗植物的病蟲害。
發(fā)明人此前開發(fā)出了一種利用RNA干擾機(jī)制、以植物作為載體來抑制昆蟲生長(zhǎng)的方法(專利申請(qǐng)?zhí)?00610119029. 7，該專利申請(qǐng)全文納入本文作為參考)。該方法將包含正向和反向昆蟲基因(或片段)序列導(dǎo)入到植物內(nèi)，在植物中表達(dá)昆蟲基因的dsRNA，當(dāng)昆蟲在取食了轉(zhuǎn)基因植物后，體內(nèi)的靶基因通過RNA干擾途徑被抑制，從而使害蟲的生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制。由于可以根據(jù)某種昆蟲某個(gè)特定基因的序列設(shè)計(jì)專一的dsRNA，這一技術(shù)能夠有選擇地抑制昆蟲特定基因的表達(dá)，從而為開發(fā)更有效和更安全的轉(zhuǎn)基因抗蟲植物開辟了新方向(Mao等人，2007)。RNA干擾效率和有效的靶基因是這一技術(shù)得以應(yīng)用的關(guān)鍵。
然而，仍然需要進(jìn)一步改進(jìn)來提高昆蟲對(duì)諸如dsRNA分子的吸收，從而提高RNA干擾的作用。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)以上問題，本發(fā)明人經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，植物半胱氨酸蛋白酶能夠增強(qiáng)昆蟲中腸對(duì)諸如dsRNA分子、棉酚等大分子的通透性。因此，其與植物介導(dǎo)的昆蟲RNA干擾技術(shù)相結(jié)合能顯著加強(qiáng)植物介導(dǎo)的昆蟲RNA干擾作用。
本發(fā)明的第一個(gè)方面提供了一種利用半胱氨酸蛋白酶增強(qiáng)植物介導(dǎo)的昆蟲RNA 干擾的方法，所述植物的細(xì)胞內(nèi)已轉(zhuǎn)入了表達(dá)昆蟲基因dsRNA的構(gòu)建物，所述方法包括將表達(dá)植物半胱氨酸蛋白酶的構(gòu)建物轉(zhuǎn)入所述植物的細(xì)胞、組織或器官中。
本發(fā)明提供了一種利用半胱氨酸蛋白酶增強(qiáng)植物介導(dǎo)的昆蟲RNA干擾的方法，所述方法包括將表達(dá)昆蟲基因dsRNA的構(gòu)建物以及表達(dá)植物半胱氨酸蛋白酶的構(gòu)建物轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞、組織或器官中，從而在植物細(xì)胞、組織或器官中表達(dá)出所述植物半胱氨酸蛋白酶以及昆蟲基因的dsRNA。
優(yōu)選的，所述的植食性昆蟲是鱗翅目昆蟲。
本發(fā)明另一方面提供了一種提高植物抗蟲性的方法，所述方法包括將表達(dá)昆蟲基因dsRNA的構(gòu)建物以及表達(dá)植物半胱氨酸蛋白酶的構(gòu)建物轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞、組織或器官中， 從而在植物細(xì)胞、組織或器官中表達(dá)出所述植物半胱氨酸蛋白酶以及昆蟲基因的dsRNA。
本發(fā)明另一方面提供了一種植物細(xì)胞，所述的植物細(xì)胞中含有表達(dá)昆蟲基因 dsRNA的構(gòu)建物以及表達(dá)植物半胱氨酸蛋白酶的構(gòu)建物。
本發(fā)明還有一個(gè)方面提供了含有上述植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物、其組織或其后代。
本發(fā)明另一方面提供了一種生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法以及用該方法獲得的轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物具有改善的抗蟲性，該方法包括使轉(zhuǎn)入了表達(dá)昆蟲基因dsRNA的構(gòu)建物的親本植物與轉(zhuǎn)入了表達(dá)植物半胱氨酸蛋白酶的構(gòu)建物的親本植物雜交，篩選并獲得所述昆蟲基因dsRNA和所述植物半胱氨酸蛋白酶共同表達(dá)的植物后代。
本發(fā)明另一方面提供了一種轉(zhuǎn)基因植物、其組織或其后代，其含有權(quán)利要求9-11 任一項(xiàng)所述的植物細(xì)胞。
本發(fā)明的另一方面提供了一種生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述轉(zhuǎn)基因植物具有改善的抗蟲性，該方法包括將表達(dá)昆蟲基因dsRNA的構(gòu)建物以及表達(dá)植物半胱氨酸蛋白酶的構(gòu)建物轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞、組織或器官中，使所述植物細(xì)胞、組織或器官再生成植株。
本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)可從下文的詳細(xì)描述和實(shí)施例得知。


圖1顯示了 (ihCP與CABM307的序列一致性分析，結(jié)果顯示(ihCP與CAB54307在核苷酸和蛋白水平存在微小差異。圖IA是(ihCP與CAB54307在核苷酸水平上的比對(duì)(開放閱讀框)。方框部分代表兩者的差異部分。圖IB表示(ihCP與CAB54307在蛋白水平上的比對(duì)。標(biāo)注有“*”代表兩者的保守部分。
圖2顯示了 (ihCP和AtCP導(dǎo)入細(xì)菌中的表達(dá)。圖2A是所用載體的示意圖，其中利用T7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Venues，GhCP或AtCP融合蛋白的表達(dá)。圖2B是分別提取表達(dá)Venues， (ihCP和AtCP的細(xì)菌總蛋白，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳的結(jié)果，其中Mark表示蛋白分子標(biāo)記， 單位KD為千道爾頓。
圖3表明通過棉鈴蟲中腸中棉酚濃度的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)(ihCP和AtCP能夠增強(qiáng)棉鈴蟲對(duì)棉酚的通透性。圖3A 將表達(dá)Venus或(ihCP的E. coli細(xì)胞分別與人工飼料混合，選取生長(zhǎng)一致的3齡棉鈴蟲分成兩組，分別喂以上述人工飼料。進(jìn)食兩天后，移至含有0. 棉酚濃度的人工飼料，繼續(xù)培養(yǎng)一天。用間苯三酚染色，檢測(cè)中腸細(xì)胞內(nèi)的棉酚含量。圖3A中左側(cè)柱表示Venus,右側(cè)柱表示GhCP。圖3B 將表達(dá)Venus或AtCP的E. coli細(xì)胞分別與人工飼料混合，進(jìn)行與圖3A中類似的昆蟲飼喂試實(shí)驗(yàn)后，用間苯三酚染色，檢測(cè)中腸細(xì)胞內(nèi)的棉酚含量。圖3B中左側(cè)柱表示Venus，右側(cè)柱表示AtCP。
圖4是實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)GSTl在棉鈴蟲中腸的轉(zhuǎn)錄本。圖4A顯示了昆蟲飼喂實(shí)驗(yàn)示意圖。圖4B顯示RT-PCR檢測(cè)進(jìn)食野生型擬南芥Col-O (淺色)或轉(zhuǎn)基因擬南芥 AtdsGSTl (深色)兩天后昆蟲中腸GSTl相對(duì)于內(nèi)標(biāo)ACT的表達(dá)量。圖4C顯示進(jìn)食轉(zhuǎn)基因擬南芥AtdsGSTl相對(duì)于進(jìn)食野生型擬南芥Col-O的幼蟲中GSTl的比例(進(jìn)食轉(zhuǎn)基因擬南芥AtdsGSTl幼蟲中GSTl的表達(dá)量/進(jìn)食野生型擬南芥Col-O幼蟲中GSTl的表達(dá)量)。圖中=Venus 在飼喂擬南芥之前，先用表達(dá)Venus的E. coli細(xì)胞與人工飼料混合，喂養(yǎng)生長(zhǎng)一致的3齡棉鈴蟲兩天做預(yù)處理AhCP 用表達(dá)(ihCP代替Venus的E. coli細(xì)胞，進(jìn)行預(yù)處理；AtCP 用表達(dá)AtCP代替Venus的E. coli細(xì)胞，進(jìn)行預(yù)處理。
圖5表示將(ihCP導(dǎo)入擬南芥中表達(dá)。圖5A是載體構(gòu)建示意圖；圖5B是RT-PCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)基因擬南芥At(ihCP中(ihCP的轉(zhuǎn)錄本，其中泳道5為陰性對(duì)照。
圖6表示通過ATChCP飼養(yǎng)的棉鈴蟲對(duì)棉酚的通透性增強(qiáng)；在進(jìn)食dsGST， dsCYP6AE14植物組織后，RNAi的效果更加明顯。圖6A 選取生長(zhǎng)一致的3齡棉鈴蟲分成兩組，分別喂以野生型擬南芥(Col-O)或轉(zhuǎn)基因擬南芥ATChCP(ATChCP)。兩天后，移至含有 0. 棉酚濃度的人工飼料，繼續(xù)培養(yǎng)一天。用間苯三酚染色，檢測(cè)中腸細(xì)胞內(nèi)的棉酚含量。 圖6B =RT-PCR檢測(cè)進(jìn)食野生型擬南芥Col-O或轉(zhuǎn)基因擬南芥AtdsCYP6AE14兩天后棉鈴蟲中腸CYP6AE14相對(duì)與內(nèi)標(biāo)ACT的表達(dá)量。WT 用Col-O喂養(yǎng)三齡生長(zhǎng)一致的棉鈴蟲幼蟲兩天，分成兩組，一組繼續(xù)進(jìn)食Col-O (淺色)，一組轉(zhuǎn)移至AtdsCYP6AE14 (深色)繼續(xù)培養(yǎng)兩天后CYP6AE14的表達(dá)。AtGhCP 用At(ihCP喂養(yǎng)三齡生長(zhǎng)一致的棉鈴蟲幼蟲兩天后，分成兩組，進(jìn)行類似的飼喂實(shí)驗(yàn)后CYP6AE14的表達(dá)。圖6C 用AtdsGSTl代替AtdsCYP6AE14，進(jìn)行圖6B所述飼喂實(shí)驗(yàn)，RT-PCR分析棉鈴蟲中腸GSTl的相對(duì)表達(dá)。
圖7顯示了 35S: :GhCP4與dsGIP轉(zhuǎn)基因棉花雜交后代的鑒定。RT-PCR檢測(cè)Fl代中GhCP4, dsGIP, NPTII的表達(dá)水平，CK為R15。黑框顯示為35S: :GhCP4/dsGIP共表達(dá)。
圖8 顯示 dsGIP，;35S: :GhCP4,35S: :(ihCP4/dsGIP 棉花對(duì)棉鈴蟲的抗性，其中 A 二齡棉鈴蟲分四組，每組36頭，分別飼喂Rl5，dsGIP, 35S: :GhCP4，35S: :GhCP4/dsGIP棉葉，檢測(cè)飼喂5天，8天后的體重。B 二齡棉鈴蟲分別進(jìn)食R15，dsGIP，35S: :GhCP4，35S: :GhCP4/ dsGIP棉葉5天。
圖 9 顯示幼蟲對(duì) Rl5，dsGIP，35S: :GhCP4，35S: :GhCP4/dsGIP 棉葉的消耗量，其中二齡幼蟲在進(jìn)食不同的棉葉5天，轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的R15，dsGIP，35S: :GhCP4,35S: :GhCP4/ dsGIP新鮮棉葉一天后，測(cè)定棉葉被消耗的量。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明第一方面提供了一種利用半胱氨酸蛋白酶增強(qiáng)植物介導(dǎo)的昆蟲RNA干擾的方法，其特征在于，所述方法包括將表達(dá)昆蟲基因雙鏈RNA(dsRNA)的構(gòu)建物以及表達(dá)植物半胱氨酸蛋白酶的構(gòu)建物轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞、組織或器官中，從而在植物細(xì)胞、組織或器官中表達(dá)出所述植物半胱氨酸蛋白酶以及昆蟲基因的dsRNA。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述昆蟲基因是昆蟲生長(zhǎng)必需的基因，或在特定條件下(如在有農(nóng)藥、或植物抗毒素等存在或誘導(dǎo)的情況下)能影響昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育的基因。在一個(gè)更優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述昆蟲基因是在昆蟲的胃或腸中表達(dá)的基因。更佳地，所述昆蟲基因是在昆蟲的胃或腸中特異性表達(dá)或高表達(dá)的基因。
本發(fā)明對(duì)所采用的昆蟲基因沒有特別的限制。為了能夠使昆蟲在服食所述的植物后受到抑制，所述昆蟲基因通常為昆蟲生長(zhǎng)必需的基因或在特定條件下能影響昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育的基因。如本文所用，所述的“昆蟲生長(zhǎng)必需的基因”為在昆蟲的生長(zhǎng)、發(fā)育、代謝、繁殖過程中發(fā)揮重要作用的基因(也稱為“昆蟲生長(zhǎng)的重要基因”)。所述基因的低表達(dá)或不表達(dá)將導(dǎo)致昆蟲的生長(zhǎng)、發(fā)育、代謝、繁殖等過程產(chǎn)生異常，甚至導(dǎo)致昆蟲的死亡。在用于本發(fā)明時(shí)，所述的昆蟲生長(zhǎng)必需的基因是全長(zhǎng)基因或基因片段。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，本發(fā)明優(yōu)選的昆蟲基因的片段的長(zhǎng)度至少為50bp，比如可以是6(^ 、8(^ 、10(^ 、20(^ 、50(^ 、lOOObp。當(dāng)然也可以采用全長(zhǎng)基因。所述的特定條件比如在有農(nóng)藥或植物抗毒素存在等的情況下。由于昆蟲通過口服植物來攝入所述的SiRNA，因此，所述昆蟲基因優(yōu)選地為在昆蟲的胃或腸中高表達(dá)的基因。選擇在昆蟲的胃或腸中高表達(dá)的基因可以一定程度地避免昆蟲其它組織或器官的基因的SiRNA在行使干擾作用時(shí)，受到昆蟲體內(nèi)各種屏障的影響(如被阻斷或降解)。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的昆蟲基因選自(但不局限于)P450基因 (GIP)、谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因(GSTl)、CYP6AE14基因。
如本文所用，術(shù)語“RNA干擾(RNA interference, RNAi) ”是指一些小的雙鏈RNA 可以高效、特異地阻斷體內(nèi)特定基因的表達(dá)，促使mRNA降解，誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型，其也稱為RNA干預(yù)或者干涉。RNA干擾是高度特異的在mRNA水平上的基因沉默機(jī)制。術(shù)語“小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA) ”是指一種短片段雙鏈RNA分子， 能夠以同源互補(bǔ)序列的mRNA為靶目標(biāo)降解特定的mRNA，這個(gè)過程就是RNA干擾途徑(RNA interference pathway)。在本發(fā)明中，所述的RNA干擾的基本原理是以植物作為媒介，通過轉(zhuǎn)基因的方法讓植物體內(nèi)表達(dá)昆蟲基因(全長(zhǎng)或部分)的雙鏈RNA(dsRNA)，在植物體內(nèi)加工形成高豐度的siRNA，當(dāng)昆蟲取食這種轉(zhuǎn)基因植物的同時(shí)也攝入了大量的siRNA，所述的siRNA在進(jìn)入昆蟲體內(nèi)后能夠抑制所述昆蟲基因在昆蟲體內(nèi)的表達(dá)，干擾昆蟲正常的生長(zhǎng)發(fā)育甚至引起昆蟲的死亡，從而降低昆蟲對(duì)植物的取食。因此，本發(fā)明另一方面提供了一種提高植物抗蟲性的方法，所述方法包括將表達(dá)昆蟲基因dsRNA的構(gòu)建物以及表達(dá)植物半胱氨酸蛋白酶的構(gòu)建物轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞、組織或器官中，從而在植物細(xì)胞、組織或器官中表達(dá)出所述植物半胱氨酸蛋白酶以及昆蟲基因的dsRNA。
在一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述的表達(dá)昆蟲基因dsRNA的構(gòu)建物為雙鏈，并且其正鏈或負(fù)鏈含有以下式I結(jié)構(gòu) Seq 正向-X-Seq 反向式 I 式中， Seq正自為昆蟲基因的正向序列或片段，其中所述片段的長(zhǎng)度至少為50bp ； Seqfi^1為跟^q1自基本上互補(bǔ)的序列或片段，其中所述片段的長(zhǎng)度至少為50bp ；X 為位于^q1自和自之間的間隔序列，并且所述間隔序列與Sec^^^P Seqfi^1F互補(bǔ)。所述構(gòu)建物能在植物細(xì)胞、組織或器官中表達(dá)形成式II所示的昆蟲基因的dsRNA，并在植物體內(nèi)被加工成siRNA。

權(quán)利要求
1.一種利用半胱氨酸蛋白酶增強(qiáng)植物介導(dǎo)的昆蟲RNA干擾的方法，所述植物的細(xì)胞內(nèi)已轉(zhuǎn)入了表達(dá)昆蟲基因dsRNA的構(gòu)建物，其特征在于，所述方法包括將表達(dá)植物半胱氨酸蛋白酶的構(gòu)建物轉(zhuǎn)入所述植物的細(xì)胞、組織或器官中。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述昆蟲基因是昆蟲生長(zhǎng)必需的基因，或在特定條件下能影響昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育的基因。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物選自雙子葉植物、單子葉植物、 或裸子植物。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的昆蟲選自植食性昆蟲。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物半胱氨酸蛋白酶選自棉花半胱氨酸蛋白酶或擬南芥半胱氨酸蛋白酶。
6.如權(quán)利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述植物半胱氨酸蛋白酶選自(1)SEQID NO :1或SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，或(2)與SEQID NO :1或SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列有50%以上同源性且具有SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列相同生物活性的蛋白酶。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)昆蟲基因dsRNA的構(gòu)建物為雙鏈， 并且其正鏈或負(fù)鏈含有以下式I結(jié)構(gòu)Seq正向_X_Seq反向 ζ I式中，Seq1^1為昆蟲基因的正向序列或片段，其中所述片段的長(zhǎng)度至少為50bp ； Seqfi^1為跟^q1自基本上互補(bǔ)的序列或片段，其中所述片段的長(zhǎng)度至少為50bp ； X為位于Seqg之間的間隔序列，并且所述間隔序列與不互補(bǔ)。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，該方法還包括使所述植物的細(xì)胞、組織或器官再生成植株。
9.一種植物細(xì)胞，其特征在于，所述的植物細(xì)胞中含有表達(dá)昆蟲基因dsRNA的構(gòu)建物以及表達(dá)植物半胱氨酸蛋白酶的構(gòu)建物。
10.如權(quán)利要求9所述的植物細(xì)胞，其特征在于，所述植物半胱氨酸蛋白酶選自棉花半胱氨酸蛋白酶或擬南芥半胱氨酸蛋白酶。
11.如權(quán)利要求10所述的植物細(xì)胞，其特征在于，所述的植物選自雙子葉植物、單子葉植物、或裸子植物。
12.一種提高植物抗蟲性的方法，其特征在于，所述方法包括將表達(dá)昆蟲基因dsRNA的構(gòu)建物以及表達(dá)植物半胱氨酸蛋白酶的構(gòu)建物轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞、組織或器官中。
13.一種轉(zhuǎn)基因植物、其組織或其后代，其特征在于，其含有權(quán)利要求9所述的植物細(xì)胞。
14.如權(quán)利要求13所述的轉(zhuǎn)基因植物、其組織或其后代，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因植物、其組織或其后代是植物種子。
15.一種生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述轉(zhuǎn)基因植物具有改善的抗蟲性，該方法包括使轉(zhuǎn)入了表達(dá)昆蟲基因dsRNA的構(gòu)建物的親本植物與轉(zhuǎn)入了表達(dá)植物半胱氨酸蛋白酶的構(gòu)建物的親本植物雜交，篩選并獲得所述昆蟲基因dsRNA和所述植物半胱氨酸蛋白酶共同表達(dá)的植物后代。
16.一種生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述轉(zhuǎn)基因植物具有改善的抗蟲性，該方法包括將表達(dá)昆蟲基因dsRNA的構(gòu)建物以及表達(dá)植物半胱氨酸蛋白酶的構(gòu)建物轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞、組織或器官中，使所述植物細(xì)胞、組織或器官再生成植株。
17.用權(quán)利要求15或16所述的方法獲得的轉(zhuǎn)基因植物。
全文摘要
本發(fā)明提供了利用半胱氨酸蛋白酶增強(qiáng)植物介導(dǎo)的昆蟲RNA干擾的方法，該方法是將表達(dá)昆蟲基因dsRNA的構(gòu)建物以及表達(dá)植物半胱氨酸蛋白酶的構(gòu)建物轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞、組織或器官中，從而在植物細(xì)胞、組織或器官中表達(dá)出所述植物半胱氨酸蛋白酶以及昆蟲基因的dsRNA。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102191267SQ20111005953
公開日2011年9月21日 申請(qǐng)日期2011年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月11日
發(fā)明者陳曉亞, 毛穎波, 薛學(xué)義, 林芝萍, 王凌健 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院