專利名稱：紅葉南天竹組織培養(yǎng)體系中內(nèi)生菌的去除方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物栽培技術(shù)領(lǐng)域，具體為紅葉南天竹組織培養(yǎng)體系中內(nèi)生菌的去除方法。
背景技術(shù)：
紅葉南天竹為小檗科Berberidaceae南天竹屬Nandirm的一個(gè)栽培新品種，是浙江森禾種業(yè)股份有限公司從南天竹栽培群體中選育出來的。紅葉南天竹為常綠灌木，植株高約80cm，叢生而少分枝，枝葉濃密，樹形緊湊，節(jié)間短縮，只有普通南天竹的1/10，10個(gè)莖節(jié)的長(zhǎng)度只有5cm，而普通南天竹一節(jié)約8-lOcm ；葉片為二回三小葉復(fù)葉，葉片先端鈍尖， 基部楔形，全緣，薄革質(zhì)，長(zhǎng)3-5cm，寬1. 5-2cm，總?cè)~柄1. 5-3cm。紅葉南天竹喜半蔭，強(qiáng)光下也能正常生長(zhǎng)，喜溫暖氣候，肥沃、濕潤(rùn)排水良好的土壤；冬季陽(yáng)光直射到的葉片全部變紅，秋天稍遇冷空氣，葉色便由綠色轉(zhuǎn)為鮮紅色，持續(xù)至翌年初春。紅葉南天竹冬季整株葉色呈現(xiàn)鮮艷的中國(guó)紅，具興旺發(fā)達(dá)之寓意；春、夏、秋三季葉色深綠色，和諧舒適。是優(yōu)良的觀葉地被和色塊樹種，觀賞效果醒目。適于華東地區(qū)應(yīng)用；該區(qū)域冬季可觀賞的露地栽培樹種比較少，色彩艷麗的耐寒樹種更少，紅葉南天竹是理想的新選擇，市場(chǎng)開發(fā)潛力巨大。紅葉南天竹植株本身分支稀少、莖節(jié)短縮，可用的扦插莖段十分有限，常規(guī)的扦插育苗法繁殖周期長(zhǎng)、繁殖率極低，只有組培技術(shù)是其快速繁殖的有效途徑；但在實(shí)踐過程中觀察到，部分生長(zhǎng)正常、無菌的組培苗在繼代后，培養(yǎng)基內(nèi)的苗基部附近總會(huì)出現(xiàn)云霧暈開狀的污染，并且隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，污染狀況逐漸加重，影響到組培苗的增殖、生長(zhǎng)與生根，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致植株死亡。這種現(xiàn)象為紅葉南天竹本身攜帶的內(nèi)生菌所致。由于不能預(yù)見內(nèi)生菌污染的發(fā)生時(shí)間，并且其最初表現(xiàn)憑借肉眼很難分辨，容易在繼代過程中交叉污染，大大限制組培苗的增殖速度，加劇了生產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)。通過調(diào)查一些企業(yè)與科研院所，證實(shí)了內(nèi)生菌現(xiàn)象的普遍存在。內(nèi)生菌問題是紅葉南天竹工廠化組培快繁體系建立中亟待攻克的技術(shù)障礙。查閱目前公開發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)資料，均未提及此現(xiàn)象。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種紅葉南天竹組織培養(yǎng)體系中內(nèi)生菌的去除方法的技術(shù)方案，該去除方法有效、簡(jiǎn)便易行，加速了組培苗的增殖速度。所述的紅葉南天竹組織培養(yǎng)體系中內(nèi)生菌的去除方法，其特征包括以下步驟
1)從紅葉南天竹處于增殖狀態(tài)的組培苗中，挑選在培養(yǎng)基內(nèi)的基部存在云霧狀暈開的內(nèi)生菌污染的植株，暈開的部分尚未擴(kuò)展到培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)基未明顯變色的組培苗；
2)在超凈工作臺(tái)上，用滅菌的鑷子將挑選出的組培苗從瓶中取出，放置在無菌的不銹鋼盤中，用滅菌刀片將苗先端0. 8-1. 5cm的部分切下，切下的部分不碰觸到苗基部，放置在另一個(gè)無菌不銹鋼盤中剝?nèi)∏o尖；
3)切下剝好莖尖先端0.2-0. 5cm的部分，迅速接入添加40-60 mg-Γ1芐基青霉素鉀鹽或1. 2-1. 8 g-r1 50%多菌靈可濕性粉劑的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)；
4)培養(yǎng)55d-65d后，將長(zhǎng)于0. 4-0. 6 cm幼嫩枝條切割成0. 5-1. Ocm的莖段轉(zhuǎn)接入增殖培養(yǎng)基，莖段能夠正常增殖，形成的幼嫩枝條性狀表現(xiàn)正常即可。所述的紅葉南天竹組織培養(yǎng)體系中內(nèi)生菌的去除方法，其特征在于步驟2)中苗先端切下部分的長(zhǎng)度為1. 0-1. 2cm。所述的紅葉南天竹組織培養(yǎng)體系中內(nèi)生菌的去除方法，其特征在于步驟3)中莖尖先端切下部分的長(zhǎng)度為0. 3-0. km，芐基青霉素鉀鹽的濃度為50-55 mg·!/1，或50%多菌靈可濕性粉劑的濃度為1. 2-1. 4 g·!/1。所述的紅葉南天竹組織培養(yǎng)體系中內(nèi)生菌的去除方法，其特征在于步驟4)中培養(yǎng)60d后，將長(zhǎng)于0. 5-0. 55 cm幼嫩枝條切割成0. 6-0. 8cm的莖段轉(zhuǎn)接入增殖培養(yǎng)基。所述的青霉素G-K為芐基青霉素鉀鹽。所述的紅葉南天竹組織培養(yǎng)體系中內(nèi)生菌的去除方法，對(duì)感染內(nèi)生菌組培苗的判斷方法簡(jiǎn)單，實(shí)施有效、簡(jiǎn)便易行，內(nèi)生菌的去除率達(dá)到90%，其組培苗能夠正常增殖，形成的幼嫩枝條性狀表現(xiàn)正常，增殖系數(shù)正常，無玻璃化現(xiàn)象，得到的紅葉南天竹品質(zhì)優(yōu)良，具有廣闊的應(yīng)用前景。本申請(qǐng)文件中涉及的百分含量除另有說明外，均指重量百分含量。
具體實(shí)施例方式現(xiàn)結(jié)合本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。1)從紅葉南天竹處于增殖狀態(tài)的組培苗中，挑選在培養(yǎng)基內(nèi)的植株基部存在云霧狀暈開的內(nèi)生菌污染，暈開的部分尚未擴(kuò)展到培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)基未明顯變色的組培苗；
2)在超凈工作臺(tái)上，用滅菌的鑷子將挑選出的組培苗從瓶中取出，放置在無菌的不銹鋼盤中，用滅菌刀片將苗先端Icm的部分切下，切下的部分不要碰觸到苗基部，放置在另一個(gè)無菌不銹鋼盤中剝?nèi)∏o尖；
3)切下剝出莖尖先端0.3cm的部分，迅速接入添加50 mg-Γ1青霉素G-K或1. 5 g-Γ1 50%多菌靈可濕性粉劑的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)；
4)培養(yǎng)過程中可觀察到莖尖形成愈傷組織，分化出若干不定芽，培養(yǎng)60d后，將長(zhǎng)于 0. 5cm幼嫩枝條切割成0. 5cm的莖段轉(zhuǎn)接入增殖培養(yǎng)基，莖段能夠正常增殖，形成的幼嫩枝條性狀表現(xiàn)正常，增殖系數(shù)正常，無玻璃化現(xiàn)象。在上述去除方法中
所述的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的配方為MS培養(yǎng)基中添加0. 5-1. Smg-L"1 BA、0. 05-0. ISmg-L"1 IBA, 2-5%蔗糖和0. 5-0. 8%瓊脂制成，至培養(yǎng)基pH為5. 8-6. 0止。所述的增殖培養(yǎng)基配方為MS培養(yǎng)基中添加1. 0-2. 0 mg-Γ1 BA、0. 05-0. 15 mg·!/1、 2-5%蔗糖和0. 5-0. 8%瓊脂制成，至培養(yǎng)基pH為5. 8-6. 0止。所述的BA為6-芐氨基嘌呤，IBA為吲哚丁酸。步驟2)中苗先端切下部分的長(zhǎng)度為0. 8cm、1. 2cm或1. 5cm ；
步驟3)中莖尖先端切下部分的長(zhǎng)度為0. 2cm、0. 4cm或0. 5cm,青霉素G-K的濃度為 ^mg'L^.eOmg'r1 或 551^.171 ；50% 多菌靈可濕性粉劑的濃度為 1. 24 g'L^Ul. 6
g'L-\l. Sg-L"1 ；50%多菌靈可濕性粉劑是指多菌靈的含量為50% ；步驟4)中培養(yǎng)時(shí)間為55d、62d或65d，切割成莖段的長(zhǎng)度為0. 5cm、0. 6cm、1. Ocm ； 其它步驟同上，也能取得本發(fā)明所述的有益效果。以下結(jié)合相應(yīng)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。試驗(yàn)1.將含有內(nèi)生菌組培苗的莖尖切下接種至添加不同濃度的青霉素G-K(芐基
青霉素鉀鹽)誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，并設(shè)立對(duì)照，結(jié)果見表1。
表1 添加青霉素G-K對(duì)內(nèi)生菌的影響表
權(quán)利要求
1.紅葉南天竹組織培養(yǎng)體系中內(nèi)生菌的去除方法，其特征包括以下步驟1)從紅葉南天竹處于增殖狀態(tài)的組培苗中，挑選在培養(yǎng)基內(nèi)的基部存在云霧狀暈開的內(nèi)生菌污染的植株，暈開的部分尚未擴(kuò)展到培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)基未明顯變色的組培苗；2)在超凈工作臺(tái)上，用滅菌的鑷子將挑選出的組培苗從瓶中取出，放置在無菌的不銹鋼盤中，用滅菌刀片將苗先端0. 8-1. 5cm的部分切下，切下的部分不碰觸到苗基部，放置在另一個(gè)無菌不銹鋼盤中剝?nèi)∏o尖；3)切下剝好莖尖先端0.2-0. 5cm的部分，迅速接入添加40-60 mg-Γ1芐基青霉素鉀鹽或1. 2-1. 8 g-r1 50%多菌靈可濕性粉劑的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)；4)培養(yǎng)55d-65d后，將長(zhǎng)于0.4-0. 6 cm幼嫩枝條切割成0. 5-1. Ocm的莖段轉(zhuǎn)接入增殖培養(yǎng)基，莖段能夠正常增殖，形成的幼嫩枝條性狀表現(xiàn)正常即可。
2.如權(quán)利要求1所述的紅葉南天竹組織培養(yǎng)體系中內(nèi)生菌的去除方法，其特征在于步驟2)中苗先端切下部分的長(zhǎng)度為1. 0-1. 2cm。
3.如權(quán)利要求1所述的紅葉南天竹組織培養(yǎng)體系中內(nèi)生菌的去除方法，其特征在于步驟3)中莖尖先端切下部分的長(zhǎng)度為0. 3-0.如m，芐基青霉素鉀鹽的濃度為50-55 mg-Γ1, 或50%多菌靈可濕性粉劑的濃度為1. 2-1. 4 g·!/1。
4.如權(quán)利要求1所述的紅葉南天竹組織培養(yǎng)體系中內(nèi)生菌的去除方法，其特征在于步驟4)中培養(yǎng)60d后，將長(zhǎng)于0. 5-0. 55 cm幼嫩枝條切割成0. 6-0. 8cm的莖段轉(zhuǎn)接入增殖培養(yǎng)基。
全文摘要
紅葉南天竹組織培養(yǎng)體系中內(nèi)生菌的去除方法，屬于植物栽培技術(shù)領(lǐng)域。其特征在于包括以下步驟1)從紅葉南天竹處于增殖狀態(tài)的組培苗中，挑選出培養(yǎng)基內(nèi)的苗基部存在內(nèi)生菌感染的組培苗；2)在超凈工作臺(tái)上，將存在內(nèi)生菌的組培苗取出，切下先端，剝?nèi)∏o尖；3)將剝?nèi)〉那o尖接種至添加殺菌物質(zhì)的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上；4)培養(yǎng)一段時(shí)間后，將莖尖分化出的不定芽切下，轉(zhuǎn)接入增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，組培苗表現(xiàn)正常，無內(nèi)生菌污染的現(xiàn)象即可。上述去除方法，內(nèi)生菌的去除率達(dá)到90%，得到的紅葉南天竹品質(zhì)優(yōu)良，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102172223SQ20111007221
公開日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2011年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月24日
發(fā)明者杜三峰, 王越, 范文鋒, 邵春榮, 鄭勇平 申請(qǐng)人:浙江森禾種業(yè)股份有限公司