專利名稱：自交不結(jié)實海雀稗秋水仙素誘導(dǎo)體細胞突變體的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種自交不結(jié)實海雀稗秋水仙素誘導(dǎo)體細胞突變體的篩選方法，屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，專用于海雀稗秋水仙素誘變育種。背景技術(shù)：
海雀稗(/^1Spay腫 Vaginatum 0. Swartz)是禾本科{Graminea)黍族(Paflicea)雀稗屬 iPaspalumL.)的多年生草本植物，源產(chǎn)于非洲和美洲，可作為草坪、飼料和改良鹽堿地的優(yōu)良草種(解新明，盧小良.海雀稗種質(zhì)資源的優(yōu)良特性及其利用價值[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2004，25 (增刊11):64 67 ；陳小紅.海濱雀稗草坪的特性和養(yǎng)護管理技術(shù)[J].上海農(nóng)業(yè)科技，2007(4) 111)。海雀稗(Paspalum Vagina turn)為自交不親和的有性二倍體(Esp inoza, F. and C. L. Quarin. Cytoembryology of Paspalum chaseanum and sexual diploid biotypes of two apomictic Paspalum species [J]. Austral. J. Botany 1997,45 :871_877),由于同一屬內(nèi)不同種之間雜交不能產(chǎn)生有活力的種子或種子萌發(fā)率只有10%左右(Carpenter，J. A. Production and use of seed in seashore paspalum. J. Austral. Instit. Agri. Sci.， 1958，24 :252-256)，常規(guī)育種工作進展緩慢。以胚性愈傷組織為材料，通過秋水仙素誘導(dǎo)篩選體細胞突變體被認為是一種有效的育種新途徑，但海雀稗秋水仙素誘導(dǎo)體細胞突變體篩選方法國內(nèi)外未見正式報道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用自交不結(jié)實海雀稗秋水仙素誘導(dǎo)體細胞突變體的篩選方法，其以幼穗離體培養(yǎng)獲得的顆粒狀愈傷組織為材料，以秋水仙素為誘變劑，研究不同濃度和處理時間對愈傷組織生長、分化和植株再生的影響，通過再生植株盆栽或大田結(jié)實性調(diào)查，以收獲種子、播種出苗長成植株為獲得體細胞突變體的評價標準，建立海雀稗秋水仙素誘變體細胞突變體的篩選方法。技術(shù)方案
自交不結(jié)實海雀稗秋水仙素誘導(dǎo)體細胞突變體的篩選方法，包括
1)材料
選用海雀稗幼穗為外植體，以幼穗誘導(dǎo)產(chǎn)生的白色或淡黃色顆粒狀愈傷組織為供體材
料；
2)培養(yǎng)基
基本培養(yǎng)基由MS無機鹽、B5有機成分組成，添加蔗糖30g/L ； 愈傷組織繼代培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基附加2，4-二氯苯氧乙酸2.0 mg/L，6-芐基氨基嘌呤 0. 05mg/L,瓊脂條 16g/L ；
愈傷組織分化培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基附加6-芐基氨基嘌呤2.0 mg/L，瓊脂條8g/L; 上述培養(yǎng)基在高壓滅菌前用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)PH值至5. 8 ；
3)方法
將白色或淡黃色顆粒狀愈傷組織在繼代培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)20cT25d，轉(zhuǎn)入添加500^1000 mg/L秋水仙素的愈傷組織繼代培養(yǎng)基中，24h后轉(zhuǎn)移到愈傷組織分化培養(yǎng)基，在光照條件下培養(yǎng)35cT45d，綠苗和綠芽再轉(zhuǎn)到附加6-芐基氨基嘌呤2.0 mg/L的分化培養(yǎng)基上繼續(xù)生長，具有完整3片葉的再生植株移栽至大田或盆缽，經(jīng)過一個冬季春化作用后， 至第2年成熟期，檢查結(jié)實性獲得種子，在氣溫20°C以上時播種于裝土的盆缽或大田，正常發(fā)芽長成具有完整根、莖、葉的植株；
離體培養(yǎng)條件培養(yǎng)室溫度為26°C 28°C，光照強度為2000 Lux，光照時間為16h/d。 其中秋水仙素濃度優(yōu)選為1000 mg/L。有益效果
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點和積極效果
本發(fā)明以自交不結(jié)實海雀稗胚性愈傷組織為材料，經(jīng)秋水仙素誘變獲得的再生植株， 通過人工檢查成熟期結(jié)實率，獲得了一批能自交結(jié)實的體細胞突變體再生植株。發(fā)芽試驗表明，收獲的種子均能發(fā)芽成苗。本發(fā)明具有操作簡便、周期短和重復(fù)選擇效率高的優(yōu)點。四

圖1海雀稗顆粒狀愈傷組織圖2體細胞突變體結(jié)實的種子圖3體細胞突變體種子盆栽植株五具體實施方式
1.材料與方法 1. 1試驗材料
海雀稗品種"Adalayd，，QPaspalum Vaginatum 0. Swartz c. v. Adalayd) , 20 世紀末從美國夏威夷引進我國，2006年江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院從杭州白云草業(yè)研究所有限公司引進。 以幼穗誘導(dǎo)產(chǎn)生的顆粒狀愈傷組織為材料(梁流芳，佘建明，吳瑛瑛，等.海雀稗幼穗離體培養(yǎng)植株再生[J]·草地學(xué)報，2008，16 (6) 590-593.)。1. 2培養(yǎng)基
基本培養(yǎng)基由MS無機鹽、Β5有機成分組成，添加蔗糖30g/L ； 愈傷組織繼代培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基附加2，4-二氯苯氧乙酸2.0 mg/L，6-芐基氨基嘌呤 0. 05mg/L,瓊脂條 16g/L ；
愈傷組織分化培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基附加6-芐基氨基嘌呤2.0 mg/L，瓊脂條8g/L; 生根培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基附加吲哚乙酸0. 5mg/L,瓊脂條8g/L ； 上述培養(yǎng)基在高壓滅菌前用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)PH值至5. 8飛.0 ； 1. 3方法
選擇顆粒狀胚性愈傷組織在愈傷組織繼代培養(yǎng)基上進行20d 25d的增殖培養(yǎng)，接種到添加0、250、500、1000、2000、3000 mg/L秋水仙素的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，24h、48h、72h 后轉(zhuǎn)入愈傷組織分化培養(yǎng)基，在光照條件下培養(yǎng)35cT45d，綠苗和綠芽再轉(zhuǎn)到附加6-芐基氨基嘌呤2.0 mg/L的分化培養(yǎng)基上繼續(xù)生長，具有完整3片葉的再生植株移栽至大田或盆缽，經(jīng)過一個冬季春化作用后，至第2年成熟期，檢查結(jié)實性、獲得種子，在氣溫20°C以上時播種于裝土的盆缽或大田，正常發(fā)芽長成具有完整根、莖、葉的植株。離體培養(yǎng)條件培養(yǎng)室溫度為26°C 28°C，光強為2000 Lux，光照時間為16h/d。
結(jié)果
2. 1秋水仙素處理對愈傷組織生長的影響
挑取在愈傷組織繼代培養(yǎng)基上增殖培養(yǎng)20d 25d的白色或淡黃色顆粒狀愈傷組織， 接種到添加0、250、500、1000、200011^/1秋水仙素濃度的愈傷組織繼代培養(yǎng)基中2411、4811和 72h后，轉(zhuǎn)入不含秋水仙素的分化培養(yǎng)基中。生長30cT35d時統(tǒng)計結(jié)果表明(見表1)，愈傷組織的褐化率均隨秋水仙素處理濃度的升高而升高，愈傷組織的褐化率平均值秋水仙素濃度彡500mg/L時比0、250mg/L提高38. 42% ；秋水仙素處理濃度為500mg/L和1000mg/L，處理時間為72h比24h和48h的愈傷組織的褐化率平均值提高15. 51%和8. 70%。
表1不同秋水汕素處理下海雀捭胚性愈傷組織掲化率(%)
權(quán)利要求
1.自交不結(jié)實海雀稗秋水仙素誘導(dǎo)體細胞突變體的篩選方法，其特征在于，1)材料選用海雀稗幼穗為外植體，以幼穗誘導(dǎo)產(chǎn)生的白色或淡黃色顆粒狀愈傷組織為供體材料；2)培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基由MS無機鹽、B5有機成分組成，添加蔗糖30g/L ； 愈傷組織繼代培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基附加2，4-二氯苯氧乙酸2.0 mg/L，6-芐基氨基嘌呤 0. 05mg/L,瓊脂條 16g/L ；愈傷組織分化培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基附加6-芐基氨基嘌呤2.0 mg/L，瓊脂條8g/L; 上述培養(yǎng)基在高壓滅菌前用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)PH值至5. 8飛.0 ；3)方法將白色或淡黃色顆粒狀愈傷組織在繼代培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)20cT25d，轉(zhuǎn)入添加 500 1000 mg/L秋水仙素的愈傷組織繼代培養(yǎng)基中，24h后轉(zhuǎn)移到愈傷組織分化培養(yǎng)基， 在光照條件下培養(yǎng)35cT45d，綠苗和綠芽再轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上繼續(xù)生長，具有完整3片葉的再生植株移栽至大田或盆缽，經(jīng)過一個冬季春化作用后，至第2年成熟期，檢查結(jié)實性獲得種子；離體培養(yǎng)條件培養(yǎng)室溫度為26°C 28°C，光強為2000 Lux，光照時間為16h/d。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自交不結(jié)實海雀稗秋水仙素誘導(dǎo)體細胞突變體的篩選方法， 其特征在于秋水仙素誘變濃度為1000mg/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種自交不結(jié)實海雀稗秋水仙素誘導(dǎo)體細胞突變體的篩選方法，屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。海雀稗顆粒狀愈傷組織在愈傷組織繼代培養(yǎng)基上增殖培養(yǎng)20d～25d，轉(zhuǎn)到添加500~1000g/L秋水仙素的愈傷組織繼代培養(yǎng)基中誘變培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)35d~40d，綠苗和綠芽再轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上繼續(xù)生長，具有3張完整葉的再生植株移栽至大田或盆缽，移栽第2年成熟期，檢查結(jié)實性獲得可自交結(jié)實的體細胞突變體植株，收獲的種子播種后能100%發(fā)芽長成具有完整根、莖、葉的植株，并能正常分蘗和成坪。本發(fā)明適用于海雀稗新品種選育，具有操作簡便、周期短和選擇效率高的優(yōu)點。
文檔編號A01H4/00GK102177849SQ20111007414
公開日2011年9月14日 申請日期2011年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月28日
發(fā)明者劉智微, 吳娟子, 周和鋒, 常盼盼, 許映君, 鐘小仙 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院