專利名稱：一種離體葉片鑒定棉花黃萎病的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于棉花抗病育種技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種離體葉片鑒定法鑒定植物病害技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明具體涉及一種離體葉片鑒定棉花黃萎病的方法，為作物抗病育種提供抗性材料的早期快速鑒定。
背景技術(shù)：
棉花黃萎病是棉花最重要的病害之一，危害嚴(yán)重，而且棉花黃萎病菌致病力變異性強(qiáng)，在與寄主協(xié)同進(jìn)化的過程中，由于病菌異核現(xiàn)象和生態(tài)環(huán)境差異的影響，常出現(xiàn)生理分化，出現(xiàn)新的致病類型，因此摸清我國主要植棉區(qū)棉花黃萎病的致病力分化情況，尋求一 種快速準(zhǔn)確的棉花抗黃萎病鑒定技術(shù)是當(dāng)今棉花抗病育種的迫切要求，對我國棉花的可持續(xù)發(fā)展有著重要的意義。 張興華，田紹仁等人在棉花抗棉鈴蟲室內(nèi)生物學(xué)測定中對棉葉活力保鮮技術(shù)進(jìn)行了研究，采用透明的聚丙烯塑料盒內(nèi)填聚氨酯人造海綿加水做培養(yǎng)基，不僅保鮮而且能保持棉葉的生命活力，而且保證了棉鈴蟲抗性測定的準(zhǔn)確性(馬麗華，李春花，棉花抗棉鈴蟲性室內(nèi)生物測定新方法，中國棉花，實(shí)用技術(shù)，1998,25(7) 27-36)受此啟發(fā)，以棉葉保鮮技術(shù)為基礎(chǔ)對棉花抗黃萎病鑒定技術(shù)進(jìn)行了探索，以試探是否可以通過離體葉片接菌的方式進(jìn)行抗病鑒定。筆者稱之為離體葉片鑒定法，即在大田中，取棉株果枝上的成熟葉片，經(jīng)消毒、清洗以及干燥后，葉柄蘸菌，在保鮮盒中離體培養(yǎng)并觀察棉苗發(fā)病情況的一種棉花抗黃萎病鑒定方法。通過此方法，不僅可以同時(shí)測定多個(gè)菌系對同一單株的致病力情況，而且能夠進(jìn)行抗性遺傳的相關(guān)研究，在棉花育種單位具有應(yīng)用推廣價(jià)值。因此，一旦此方法成熟，將作為一種快速、準(zhǔn)確的鑒定技術(shù)應(yīng)用于棉花黃萎病鑒定中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種快速、簡便和靈敏度高的離體葉片鑒定棉花黃萎病的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種離體葉片鑒定棉花黃萎病的方法，包括如下步驟I)將冰箱中試管保存的保藏號為CCTCC NO M2011095的大麗輪枝菌6SY2-37轉(zhuǎn)移至盛有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，之后將培養(yǎng)皿放在恒溫箱中進(jìn)行活化，活化溫度為25°C，活化時(shí)間為10-15d，取一直徑約4mm的菌塊放入盛有50ml Czapek’ s培養(yǎng)基的三角瓶中，于25°C下振蕩培養(yǎng)5-6d;2)將步驟I)的病菌培養(yǎng)物用雙層紗布過濾，在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)孢子數(shù)，用無菌水將孢子調(diào)至5 X IO6個(gè)/ml的孢子懸浮液；3)透明的聚乙烯保鮮盒經(jīng)濃度75%的酒精消毒后，用無菌水沖洗2次，然后放入已裁剪好的海綿加水作為培養(yǎng)基；4)從大田取棉株果枝上的成熟葉片作為外植體，在超凈工作臺上用濃度75%的酒精消毒，無菌水沖洗3-4次，然后放在滅菌的濾紙上，待水分被吸干后，葉柄蘸菌，浸入保藏號為CCTCC NO M2011095的大麗輪枝菌6SY2-37，菌液濃度為5 X IO6個(gè)/ml的大麗輪枝菌6SY2-37孢子懸浮液中l(wèi)_2s后立即取出，直立插入海綿切口處，葉間距為2-3cm，最后放置在25°C條件下的溫室中進(jìn)行離體培養(yǎng)，IOd后觀察棉花葉片發(fā)病情況。其中步驟I)中所述的 Czapek’ s 培養(yǎng)基配方為FeS040. 02g/L，NaN032g/L，MgS04lg/L，KCllg/L，KH2P04lg/L，蔗糖 30g/L ；pH6. 0 ;補(bǔ)充蒸餾水至 1L。申請人:從湖北省沙洋縣感染棉花黃萎病的棉株上分離得到一株專用于離體葉片鑒定棉花黃萎病的大麗輪枝菌6SY2-37 (Verticillium dahliae 6SY2-37)，于2011年3月25日送交湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏號為CCTCC NO M2011095o本發(fā)明的其中一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是利用本發(fā)明的保鮮盒中進(jìn)行葉片離體培養(yǎng)時(shí)，盒底部的海綿吸足了水分，為葉片根系的正常發(fā)育提供了充足的水分，也為葉片發(fā)病提供了適宜的濕度。另外，保鮮盒為透明的聚乙烯盒，葉片在其內(nèi)部可以得到充足的光照，保證了葉片能正常進(jìn)行光合作用，進(jìn)而產(chǎn)生養(yǎng)分為棉葉自身提供生命動力，所以葉片能長時(shí)間保鮮，保鮮時(shí)間可達(dá)到30d以上，保鮮時(shí)間超過了抗病鑒定所需時(shí)間(一般15-20d)，為離體葉片抗病鑒定奠定了基礎(chǔ)，因此可用此法進(jìn)行抗病材料的早期快速鑒定。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，一株棉株可以同時(shí)接種不同的菌株，如可同時(shí)接種不同致病力、不同菌系的菌株，來研究棉花品種對不同黃萎病菌的抗性，進(jìn)而研究生理小種分化，可實(shí)現(xiàn)育種材料鑒定的靈活性。另外，離體葉片鑒定法無需準(zhǔn)備大量的滅菌土和塑料缽，可實(shí)現(xiàn)無土化，簡單易操作，較適合大批量抗病材料的鑒定與篩選。


圖I.離體葉片病情分級標(biāo)準(zhǔn)。葉片發(fā)病癥狀及病情分級標(biāo)準(zhǔn)見圖I :葉片接菌IOd后，開始陸續(xù)出現(xiàn)黃萎病的癥狀，15-20d普遍發(fā)病。一般是葉片的邊緣葉肉先開始變黃，之后病癥慢慢擴(kuò)展整個(gè)葉片，但也有部分葉片在邊緣部位和內(nèi)部同時(shí)出現(xiàn)黃色斑點(diǎn)狀，之后變成焦枯狀。圖2.離體葉片根系發(fā)育情況。圖2顯示空白對照和其它接菌處理的葉片，在7d后陸續(xù)萌發(fā)生根。30d后，空白對照的葉片發(fā)育正常，根系發(fā)達(dá)，最長的根長可達(dá)14cm。接菌處理的葉片也萌發(fā)發(fā)達(dá)的根系，但與空白對照相比相對較短，最短根長為2cm。調(diào)查結(jié)果顯示，孢子濃度越大，葉片萌發(fā)生根的速度越慢，這可能與孢子濃度有關(guān)，濃度越大，毒素的濃度越大，毒素對葉柄的愈傷組織有毒副作用，抑制其萌發(fā)生根。圖3.離體葉片病原菌分離結(jié)果。其中圖3A :未發(fā)病葉片對照；圖3B :發(fā)病葉片分離出的菌的菌落形態(tài)；圖3C :菌絲形態(tài)；圖3D :黑色的微菌核；圖3E :分生孢子形態(tài))分別取發(fā)病和未發(fā)病的葉片進(jìn)行病原菌的分離，分離結(jié)果見圖3。圖3A為未發(fā)病葉片對照，沒有分離出任何菌(見圖3A)。圖3B顯示，所分離出的菌落形態(tài)為中間呈黑色，外圍是白色的菌絲，顯微鏡下觀察菌絲呈輪枝狀(見圖3C)，菌絲部分膨大產(chǎn)生黑色的微菌核(見圖3D)，分生孢子呈卵圓形(見圖3E)。由此可判定該菌為大麗輪枝菌，即分離出的菌為所接的黃萎病菌，進(jìn)而證明了葉片所表現(xiàn)的癥狀為黃萎病的癥狀。圖4.不冋品種抗性鑒定效果。圖中圖左兩列為感病品種鄂棉24，圖右兩列為抗病品種銀瑞361。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I一、試驗(yàn)材料、海綿規(guī)格為27X 18X Icm(商品)；保鮮盒為普通聚乙稀塑料盒(商品)規(guī)格為30 X 20 X 10cm。鄂棉24(湖北省農(nóng)作物品種審定委員會審定的常規(guī)棉花品種，由湖北省黃岡市農(nóng)科院選育并提供種子，該品種已經(jīng)公開推廣，參見網(wǎng)址http: //baike. baidu. com/view/2089471, htm),銀瑞361 (抗蟲棉常規(guī)品種，山東省德州市銀瑞棉花研究所和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所聯(lián)合選育，在中國推廣應(yīng)用，該品種的種子由中國農(nóng)科院棉花研究所提供，未公開推廣的品種。見網(wǎng)址http://www. foodsl. com/content/409310/)。其中鄂棉24在生產(chǎn)上表現(xiàn)感病，銀瑞361在生產(chǎn)上具有一定抗病性。所用菌種為為本發(fā)明人自己分離篩選的鑒定棉花黃萎病的專用菌株大麗輪枝菌6SY2-37(保藏號為CCTCC NO M2011095)由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室提供的強(qiáng)致病力的落葉型菌株。篩選方法2007年10月從湖北省沙洋縣鄂雜棉10號采集的棉花黃萎病病株，采用升汞和酒精表面消毒法進(jìn)行分離。將病株枝條洗凈、切段，在超凈工作臺中用無菌水清洗2-3次,再用70%的酒精消毒30s，無菌水清洗3-5次。然后用0. I %的升汞消毒2min，用無菌水清洗3-5次，用剪刀剪成小塊放入PDA培養(yǎng)基中，25°C恒溫培養(yǎng)3_4d，進(jìn)行病原菌鑒定、菌種保存?zhèn)溆?。采用稀釋平板法對菌株進(jìn)行單孢分離。在培養(yǎng)15d的PDA平板上，用2_3mL的無菌水洗孢子，制成孢子懸浮液，經(jīng)5層擦鏡紙過濾菌絲后，在顯微鏡下用血球記數(shù)板觀察，將濃度稀釋為4X IO6個(gè)/mL，取0. Iml置入水瓊膠培養(yǎng)基平板上，均勻散開，培養(yǎng)皿底面劃成小方格，置24-25°C溫箱中12-24小時(shí)后鏡檢，選取方格內(nèi)只有單個(gè)孢子的做好標(biāo)記，然后按無菌操作挑取方格內(nèi)培養(yǎng)基，移入PDA平板上，長出的菌落即為單孢菌系，移入試管斜面，保存?zhèn)溆?。根?jù)病原菌菌落的培養(yǎng)性狀，形態(tài)特征，以及大麗輪枝菌分生孢子梗輪支狀、每輪有3 4分枝，含黑色的微菌核等特征，對分離的菌株進(jìn)行鑒定。菌種鑒定工作參照魏景超《真菌鑒定手冊》上海科學(xué)技術(shù)出版社，1979版介紹的方法。大麗輪枝菌6SY2-37的生物學(xué)特征分生孢子長卵圓形，單細(xì)胞極少分隔，大小為2. 3 9. IX I. 5 3. Oum0分生孢子梗輪枝狀，每輪有3 4分枝，全長110 130um，分枝大小13. 8 21. 4 X 2. 3 2. 7um，梗基部無色透明，菌落生長無色菌絲體，生長較長時(shí)間菌絲變褐色，有隔膜直徑2 4um。菌絲體常呈膨脹狀，可由單根菌絲或數(shù)根菌絲芽殖形成菌核。不同地區(qū)棉花大麗輪枝菌微菌核形成的數(shù)量、大小和性狀有明顯的差異。將棉花大麗輪枝菌6SY2-37在PDA培養(yǎng)基上活化，25°C黑暗生長7-10d后。取直徑約4mm的菌塊放入盛有50ml Czapek’ s培養(yǎng)基的三角瓶中，25°C下振蕩培養(yǎng)5_6d。然后，將病菌培養(yǎng)物用雙層紗布過濾。顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)孢子數(shù)，稀釋并配制成所需孢子濃度。將分離得到的大麗輪枝菌6SY2-37，于2011年3月25日送交湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏號為CCTCC NO :M2011095。離體葉片鑒定棉花黃萎病方法的試驗(yàn)設(shè)計(jì)①載體的準(zhǔn)備取潔凈的規(guī)格為27 X 18 X Icm的海綿，每塊海綿用剪刀剪出20個(gè)4X Icm的縫口，每排4個(gè)，共5排，并讓海綿充分吸水(滅菌后的自來水)，放入用75%酒精消過毒的30 X 20 X IOcm的保鮮盒內(nèi)備用。②試驗(yàn)材料的準(zhǔn)備
大田取樣，取棉株果枝上的成熟葉片(葉柄長0. 5cm)。③接菌(大麗輪枝菌6SY2-37)試驗(yàn)同時(shí)考慮浸菌時(shí)間和孢子濃度兩因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。浸菌時(shí)間設(shè)3個(gè)處理l-2s ;30min和lh。孢子濃度設(shè)3個(gè)梯度5 X 106、I X IO7和2 X IO7個(gè)/ml。每個(gè)處理中，鄂棉24和銀瑞361各取10片真葉。一個(gè)保鮮盒一個(gè)處理，共10個(gè)處理(含I個(gè)空白對照)浸菌時(shí)將葉柄全部浸在大麗輪枝菌6SY2-37孢子液中，之后將葉片豎直插入海綿的切口處。保鮮盒用蓋子密封。放在溫室中，溫度設(shè)定在25°C，IOd后觀察發(fā)病情況。④病情分級以發(fā)病部位面積占整個(gè)葉片面積的百分比進(jìn)行病情分級，共分5個(gè)等級0、1、2、
3、4。0級未發(fā)?。?級25%以下；2級25% 50%;3級50% 75%;4級75%以上。⑤發(fā)病葉片的病菌分離驗(yàn)證由于葉片離體鑒定容易污染，為了驗(yàn)證表現(xiàn)病狀的葉片是否由黃萎病菌引起的，取發(fā)病的葉片進(jìn)行分離，看是否能分離出大麗輪枝菌。分離方法為(1)取發(fā)病的葉片，在發(fā)病部位和未發(fā)病部位的連接處，取5塊8_X 4mm的葉片；(2)先用I % NaClO3消毒Imin,之后用升汞消毒10-15S，再用無菌水沖洗；(3)用滅過菌的吸水紙吸去多余的水分；(4)將葉片放入PDA培養(yǎng)基上。7d后觀察菌落、菌絲、微菌核和孢子形態(tài)，對所分離的菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。二、試驗(yàn)結(jié)果①空白對照和其它接菌處理的葉片，在7d后陸續(xù)萌發(fā)生根。孢子濃度越大，葉片萌發(fā)生根的速度越慢，這可能與孢子濃度有關(guān)，濃度越大，毒素的濃度越大，毒素對葉柄的愈傷組織有毒副作用，抑制其萌發(fā)生根。30d后，空白對照的葉片發(fā)育正常，根系發(fā)達(dá)，最長的根長可達(dá)14cm。②接菌后18d，在所設(shè)的不同處理中(空白對照除外)，對感病品種鄂棉24的病指進(jìn)行方差分析。分析結(jié)果顯示，同一濃度不同浸菌時(shí)間梯度之間沒有顯著差異，同一浸菌時(shí)間不同濃度梯度之間沒有顯著差異。說明在所設(shè)的9個(gè)處理中，發(fā)病情況與浸菌時(shí)間和浸菌濃度無關(guān)，故進(jìn)行抗病鑒定時(shí)，可選任意處理進(jìn)行鑒定。建議選用浸菌時(shí)間l_2s、浸菌濃度5X IO6個(gè)/ml這一組合。因?yàn)樗脻舛鹊?，菌量相對較少，配制方便；另外浸菌時(shí)間短，簡單易操作。③適宜的調(diào)查時(shí)期為接菌后15-20d。在這個(gè)時(shí)期葉片普遍發(fā)病，抗感品種區(qū)分明顯。
⑤從發(fā)病的葉片上分離得到的菌進(jìn)行了形態(tài)學(xué)鑒定，其從菌落上來看，菌落中間呈現(xiàn)黑色(微菌核)，外圍是白色的菌絲，顯微鏡下觀察菌絲呈輪枝狀，分生孢子呈卵圓形，由此可判定分離得到的菌為所接的大麗輪枝菌，進(jìn)而證明了葉片所表現(xiàn)的癥狀為黃萎病的癥狀。本發(fā)明用SPSS16. 0對鄂棉24和銀瑞361不同處理的病指進(jìn)行方差分析見表I所
/Jn o表I.不同處理鄂棉24和銀瑞361病指方差分析
權(quán)利要求
1.一種離體葉片鑒定棉花黃萎病的方法，其特征包括如下步驟 1)將冰箱中試管保存的保藏號為CCTCCNO :M2011095的大麗輪枝菌6SY2-37轉(zhuǎn)移至盛有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，之后將培養(yǎng)皿放在恒溫箱中進(jìn)行活化，活化溫度為25°C，活化時(shí)間為10-15d，取一直徑約4mm的菌塊放入盛有50ml Czapek’ s培養(yǎng)基的三角瓶中，于25°C下振蕩培養(yǎng)5-6d ； 2)將步驟I)的病菌培養(yǎng)物用雙層紗布過濾，在 顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)孢子數(shù)，用無菌水將孢子調(diào)至5 X IO6個(gè)/ml的孢子懸浮液； 3)透明的聚乙烯保鮮盒經(jīng)濃度75%的酒精消毒后，用無菌水沖洗2次，然后放入已裁剪好的海綿加水作為培養(yǎng)基； 4)從大田取棉株果枝上的成熟葉片作為外植體，在超凈工作臺上用濃度75%的酒精消毒，無菌水沖洗3-4次，然后放在滅菌的濾紙上，待水分被吸干后，葉柄蘸菌，浸入保藏號為CCTCC NO M2011095的菌液濃度為5 X IO6個(gè)/ml的大麗輪枝菌6SY2-37孢子懸浮液中l(wèi)-2s后立即取出，直立插入海綿切口處，葉間距為2-3cm，最后放置在25°C條件下的溫室中進(jìn)行離體培養(yǎng)，IOd后觀察棉花葉片發(fā)病情況。
其中 步驟 I)中所述的 Czapek，s 培養(yǎng)基配方為=FeSO4O. 02g/L, NaN032g/L, MgSO41g/L,KCllg/L，KH2P04lg/L，蔗糖 30g/L ；pH6. 0 ;補(bǔ)充蒸餾水至 1L。
2.一株專用于離體葉片鑒定棉花黃萎病的大麗輪枝菌6SY2-37，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其保藏號為CCTCC NO :M2011095。
3.權(quán)利要求2所述的菌株在離體葉片鑒定棉花黃萎病中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于棉花抗病育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種離體葉片鑒定棉花黃萎病的方法。其步驟如下1)將保存的大麗輪枝菌6SY2-37轉(zhuǎn)移至盛有PDA的培養(yǎng)皿中，置于25℃下活化10-15d，取菌塊至Czapek’s培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)5-6d；2)病菌培養(yǎng)物過濾，調(diào)至5×106個(gè)/ml的孢子懸浮液；3)聚乙烯保鮮盒消毒，以海綿加水作培養(yǎng)基；4)以棉花成熟葉片作外植體，消毒，置滅菌的濾紙上，葉柄蘸菌，浸入5×106個(gè)/ml的大麗輪枝菌6SY2-37菌液1-2s后立即取出，將所述的葉片直立插入海綿切口處，葉間距為2-3cm，25℃離體培養(yǎng)，10d后觀察棉花葉片發(fā)病情況。本發(fā)明的方法快速、靈敏度高、簡單易操作，較適合大批量抗病材料的鑒定與篩選。
文檔編號A01G1/00GK102726177SQ20111008315
公開日2012年10月17日 申請日期2011年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月1日
發(fā)明者史認(rèn)輝, 惠慧, 郝荷荷, 郭小平 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)