專利名稱：一種福建山櫻花體細(xì)胞胚胎發(fā)生方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物培育技術(shù)，涉及一種福建山櫻花體細(xì)胞胚胎發(fā)生方法。
背景技術(shù)：
福建山櫻花、Cerasus campanulata Maxim.)隸屬于薔薇科(Rosaceae)李亞科 (Prunusoidea)櫻屬(Cerasus)，又名緋寒櫻、福建櫻、山櫻桃、鐘花櫻、結(jié)櫻桃等，落葉喬木，高達(dá)15m;樹(shù)皮灰褐色或黑褐色，粗糙不開(kāi)裂，質(zhì)地堅(jiān)韌、橫向剝落。葉紙質(zhì)，卵形，橢圓狀卵形或卵狀矩圓形，長(zhǎng)壙9cm，寬2. 5^3. 5cm，先端漸尖，基部近圓形或微帶心形，邊緣有銳而細(xì)的單或微重鋸齒。有一對(duì)紅色腺體，單葉螺旋狀互生，重鋸齒緣(雙重鋸齒緣)，揉碎具有杏仁味；托葉線形，細(xì)裂狀。每年冬末春初開(kāi)花，先花后葉，花呈下垂性開(kāi)展，腋出，單生或3飛朵形成傘房花序，花梗細(xì)長(zhǎng)，有腺毛，花萼鐘形，花瓣桃紅色、緋紅色或暗紅色，先端呈凹形，半開(kāi)狀，雄蕊多數(shù)。通常11月能見(jiàn)花蕾，冬末初春開(kāi)花，盛花期1月下旬至2月下旬?；ê蠼Y(jié)卵形至橢圓形核果，至4飛月間果實(shí)成熟，果長(zhǎng)約1.5cm，成熟時(shí)深紅色，果小但可食，內(nèi)藏一粒種子；福建山櫻花在土質(zhì)疏松的紅壤、黃壤中生長(zhǎng)良好，在干旱瘠薄的荒山生長(zhǎng)不良，可在低海拔地區(qū)種植，并有很強(qiáng)的適應(yīng)性和較強(qiáng)的抗污染性。性喜光照充足和溫暖的環(huán)境，較耐高溫和陰涼，可在低海拔地區(qū)種植，最適生育溫度15 28°C，并有很強(qiáng)的適應(yīng)性和較強(qiáng)的抗污染性能力。福建山櫻花早春開(kāi)花，適宜種植與中國(guó)式庭院的水池邊、假山旁或院落中，亦可布置與公園中。福建山櫻花生長(zhǎng)緩慢，其木材可用于室內(nèi)裝修和器械用具等用材，該樹(shù)種，花色粉紅，尚美觀，可做庭園樹(shù)種栽培。其果實(shí)成熟時(shí)，果皮鮮紅色，既美觀， 亦可食用。福建山櫻花的花果還具有一定的食用價(jià)值，花朵曬干后可代替茶葉使用，也可做成糕點(diǎn)或經(jīng)鹽漬后當(dāng)成油炸物或湯類的配料。花瓣加入面包中還可增加美觀及風(fēng)味；浸泡于紹興酒中，飲來(lái)分外香醇。果實(shí)可洗凈后生食，也可用糖腌漬后食用，或制成果醬或蜜餞。開(kāi)展福建山櫻花新品種選育研究，對(duì)豐富我國(guó)的觀賞花木資源，改善生態(tài)環(huán)境具有重要的意義。但福建山櫻花現(xiàn)存林分極為稀少、種實(shí)成熟時(shí)極易爆裂，種子的采收貯存與發(fā)芽極為困難，傳統(tǒng)育種方法中，不論是利用無(wú)性系改良方法進(jìn)行品種改良，還是進(jìn)行有性雜交育種，或是把有性育種和無(wú)性利用二者有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，都不易取得大的突破，且通常需要耗費(fèi)十多年乃至數(shù)十年的時(shí)間，育種效率有待提高。隨著植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的不斷完善，在理論研究和生產(chǎn)實(shí)踐的應(yīng)用上都已取得一些重大成果。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全世界約有1000多種高等植物作過(guò)離體培養(yǎng)的研究， 其中絕大多數(shù)可通過(guò)體細(xì)胞胚發(fā)生途徑形成再生植株。而且愈來(lái)愈多的研究表明，植物體細(xì)胞在離體培養(yǎng)中，通過(guò)體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑形成再生植株已是極其普遍的現(xiàn)象，并認(rèn)為該發(fā)生途徑是植物體細(xì)胞在離體培養(yǎng)條件下的一個(gè)基本發(fā)育途徑。這也就是說(shuō)，植物的體細(xì)胞可能具有潛在的，像有性過(guò)程產(chǎn)生合子胚一樣的全能性。為提高育種效率近年來(lái)利用組織培養(yǎng)的技術(shù)對(duì)福建山櫻花的研究較多，2002年王光萍最先利用福建山櫻花的嫩枝進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)和叢生芽生根，為福建山櫻花的組織培養(yǎng)摸索了條件。2006年呂月良對(duì)福建山櫻花不定芽誘導(dǎo)和植株再生規(guī)模化繁殖試驗(yàn)，試管苗
3移栽成活率較高，各項(xiàng)指標(biāo)已達(dá)到快繁育苗的要求，為工廠化作業(yè)提供了條件。2006年黃宇翔等也對(duì)福建山櫻花組培快繁進(jìn)行研究，并探索了如何縮短組培快繁的時(shí)間。2008年鄒娜，徐楠等對(duì)福建山櫻花試管苗生根條件的優(yōu)化，以提高試管苗移栽成活率。對(duì)于福建山櫻花的器官發(fā)生的研究已經(jīng)比較系統(tǒng)，而這些研究目前還不能夠?qū)崿F(xiàn)快速培育福建山櫻花來(lái)滿足使用要求。在2010年的《福建山櫻花不定芽繁殖及體細(xì)胞胚胎發(fā)生研究》研究生碩士學(xué)位論文中，賈利娜對(duì)福建山櫻花體細(xì)胞胚胎發(fā)生進(jìn)行了探索性試驗(yàn)，采用福建山櫻花的葉片、 葉柄、枝條、花瓣、花托和花柄為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)，只有葉片、葉柄、花瓣、花柄有類似胚的發(fā)育，類似胚的結(jié)構(gòu)只長(zhǎng)出根便發(fā)育停止，最終未發(fā)育成體胚及體胚苗，枝條和花托的愈傷組織也沒(méi)有分化。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種周期短、繁殖率高、成本低廉的福建山櫻花體細(xì)胞胚胎發(fā)生方法。技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種福建山櫻花體細(xì)胞胚胎發(fā)生方法，包括以下步驟
(1)春季采集福建山櫻花的未成熟果實(shí)，先用流水沖洗2h，然后在無(wú)菌條件下切開(kāi)種皮，取出兩片子葉和未成熟胚接到誘導(dǎo)培養(yǎng)基，控溫23°C，培養(yǎng)半個(gè)月，得胚性愈傷組織； 其中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用MS培養(yǎng)基，在其中附加l.(T4.0mg/L 2，4_D、0. 2 1. Omg/L 6-芐胺基嘌呤(BA)、500mg/L水解酪蛋白、lOmg/L維生素C、30g/L蔗糖和6g/L瓊脂，pH5. 8 ；
(2)將步驟(1)的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基，控溫23°C，暗培養(yǎng)至產(chǎn)生球形胚狀體；其中，增殖培養(yǎng)基采用MS或1/2MS培養(yǎng)基，在其中附加0. 5^1. Omg/L 2，4_D、 0. 2 0. 5mg/L BA、500mg/L 水解酪蛋白、lOmg/L 維生素 C、30g/L 蔗糖和 6g/L 瓊脂，ρΗ5· 8 ；
(3)將步驟(2)的球形胚狀體轉(zhuǎn)入培育培養(yǎng)基，控溫22 27光照12h d — S光照度為1200 Ix,光培養(yǎng)至長(zhǎng)出幼苗；其中，培育培養(yǎng)基采用MS基本培養(yǎng)基，在其中附加1 Omg/L維生素C、蔗糖30g/L和瓊脂6g/L，ρΗ5· 8 ；
(4)將步驟(3)的幼苗轉(zhuǎn)入生長(zhǎng)培養(yǎng)基，培養(yǎng)至長(zhǎng)成完整小苗；其中，生長(zhǎng)培養(yǎng)基采用 MS培養(yǎng)基，在其中附加10mg/L維生素C、蔗糖20g/L和瓊脂6g/L，pH5. 8。步驟(1)中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的2，4-D的濃度優(yōu)選為2. 0 3. Omg/L。有益效果與現(xiàn)有技術(shù)中的體細(xì)胞發(fā)生方法相比，本發(fā)明的福建山櫻花體細(xì)胞胚胎發(fā)生方法具有的突出優(yōu)勢(shì)為首次采用福建山櫻花的未成熟果實(shí)，取其未成熟胚為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)，增殖且得到體胚苗和結(jié)構(gòu)完整的再生植株，是一種周期短、繁殖率高、成苗快、 結(jié)構(gòu)完整、遺傳相對(duì)性穩(wěn)定成本低廉的方法，突破了福建山櫻花現(xiàn)存林分極為稀少、種實(shí)成熟時(shí)極易爆裂，種子的采收貯存與發(fā)芽極為困難，傳統(tǒng)育種方法困難且育種效率低，無(wú)法滿足園林綠化及生產(chǎn)的需要的現(xiàn)狀。


圖1是2，4-D濃度與胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的關(guān)系曲線。圖中的縱坐標(biāo)為誘導(dǎo)率 (%)，橫坐標(biāo)為2，4-D的濃度，單位為mg/L ；
4圖2是外植體接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的圖3左圖是外植體在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上直接體細(xì)胞胚胎發(fā)生圖4右圖是外植體在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上胚根伸長(zhǎng)生長(zhǎng)圖5左圖是外植體在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上膨大生長(zhǎng)且邊緣有愈傷組織長(zhǎng)出的圖6右圖是外植體在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出的胚性愈傷組織圖7是愈傷組織增殖階段的愈傷組織圖8和圖9均為胚性愈傷組織在增殖階段產(chǎn)生的胚狀體；
圖10是將胚狀體轉(zhuǎn)到培育培養(yǎng)基上光下培養(yǎng)圖11是體胚苗生長(zhǎng)培養(yǎng)基上的圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的解釋。以下實(shí)施例所使用的材料和培養(yǎng)基配方如下
材料選擇長(zhǎng)勢(shì)良好、抗性強(qiáng)的優(yōu)良母株，開(kāi)花授粉、坐果后采集其未成熟果實(shí)為材
料；
誘導(dǎo)培養(yǎng)基在MS或B5培養(yǎng)基中附加廣4mg/L 2，4_D、0. 2 lmg/L BA、500mg/L水解酪蛋白、10mg/L的維生素C、30g/L蔗糖和6g/L瓊脂，pH5. 8 ；
增殖培養(yǎng)基在MS或1/2MS培養(yǎng)基中附加0. 5 1.0mg/L 2，4_D、0. 2 0. 5mg/L ΒΑ、 500mg/L水解酪蛋白、lOmg/L維生素C、30g/L蔗糖和6g/L瓊脂，pH5. 8 ；
培育培養(yǎng)基在MS培養(yǎng)基中附加:10mg/L維生素C、蔗糖30g/L和瓊脂6g/L，ρΗ5· 8 ； 生長(zhǎng)培養(yǎng)基在MS培養(yǎng)基中附加10mg/L維生素C、蔗糖20g/L和瓊脂6g/L，pH5. 8 ； 其中，MS、B5以及1/2MS培養(yǎng)基均為業(yè)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)配方。實(shí)施例1胚性愈傷組織的誘導(dǎo)
采用未成熟胚進(jìn)行胚性愈傷組織的誘導(dǎo)。春季采集未成熟果實(shí)先用流水沖洗2h，然后在超凈臺(tái)上用酒精滅菌30s，用滅過(guò)菌的蒸餾水沖洗干凈再用0. 1%的升汞或84消毒液處理Γ20π η，蒸餾水沖洗干凈，未成熟果實(shí)在超凈工作臺(tái)內(nèi)用解剖刀切開(kāi)種皮，取出兩片子葉和未成熟胚接到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，如圖2所示，將接種好的材料置于23°C的培養(yǎng)箱中進(jìn)行暗培養(yǎng)。未成熟胚接到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上后約半個(gè)月后開(kāi)始啟動(dòng)，如圖3、圖4、圖5和圖6中所示，有的直接體細(xì)胞胚胎發(fā)生，有的紅色的胚根開(kāi)始伸長(zhǎng)，有的則在子葉子葉膨大邊緣有白色突起，有的在刀口邊緣長(zhǎng)出白色、淡黃色或黃綠色愈傷組織。如圖1所示，各種濃度的2，4-D均能誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生，濃度低的2，4_D利于福建山櫻花直接體細(xì)胞胚胎發(fā)生，濃度為2. (Γ3. Omg/L的2，4-D特別利于胚性愈傷組織的產(chǎn)生。實(shí)施例2胚性愈傷組織增殖階段
胚性愈傷組織增殖階段，采用增殖培養(yǎng)基，增殖培養(yǎng)基繼續(xù)使用MS基本培養(yǎng)基，置于 23°C的培養(yǎng)箱中進(jìn)行暗培養(yǎng)，如圖7所示。胚狀體的發(fā)生，在胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基上， 繼代幾次后，如圖8和圖9所示，黃綠色愈傷上有白色的，球形的胚狀體產(chǎn)生。實(shí)施例3胚狀體的發(fā)育和成熟
胚狀體的發(fā)育和成熟，球形胚形成以后，轉(zhuǎn)入培育培養(yǎng)基進(jìn)行光下培養(yǎng)，光照l(shuí)l'h.d S光照度為1200 lx，室溫為22 27°C。如圖10所示，幼苗在MS培養(yǎng)基上發(fā)育成小植株，轉(zhuǎn)入生長(zhǎng)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，長(zhǎng)成完整小苗，如圖11所示。 本發(fā)明的福建山櫻花體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)為福建山櫻花的大規(guī)模無(wú)性繁殖育苗提供一種周期短、繁殖率高、成本低廉的方法，有效解決了福建山櫻花現(xiàn)存林分極為稀少、 種子成熟時(shí)極易爆裂、種子的采收貯存與發(fā)芽極為困難、傳統(tǒng)育種方法困難、且育種效率低，無(wú)法滿足園林綠化及生產(chǎn)需要問(wèn)題。
權(quán)利要求
1.一種福建山櫻花體細(xì)胞胚胎發(fā)生方法，其特征在于，包括以下步驟(1)春季采集福建山櫻花的未成熟果實(shí)，先用流水沖洗2h，然后在無(wú)菌條件下切開(kāi)種皮，取出兩片子葉和未成熟胚接到誘導(dǎo)培養(yǎng)基，控溫23°C，培養(yǎng)半個(gè)月，得胚性愈傷組織；其中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用MS培養(yǎng)基，在其中附加1. 0 4· Omg/L 2，4_D、0. 2 1. Omg/L ΒΑ、 500mg/L水解酪蛋白、lOmg/L維生素C、30g/L蔗糖和6g/L瓊脂，pH5. 8 ；(2)將步驟(1)的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基，控溫23°C，暗培養(yǎng)至產(chǎn)生胚狀體；其中，增殖培養(yǎng)基采用MS或1/2MS培養(yǎng)基，在其中附加0. 5 1. Omg/L 2，4_D、0. 2 0. 5mg/L BA、500mg/L水解酪蛋白、lOmg/L維生素C、30g/L蔗糖和6g/L瓊脂，pH5. 8 ；(3)將步驟(2)的胚狀體轉(zhuǎn)入培育培養(yǎng)基，控溫22 27°C，光照12h d— 1，光照度為 1200 lx，光培養(yǎng)至長(zhǎng)出幼苗；其中，培育培養(yǎng)基采用MS培養(yǎng)基，在其中附加10mg/L維生素 C、蔗糖 30g/L 和瓊脂 6g/L，ρΗ5· 8 ；(4)將步驟(3)的幼苗轉(zhuǎn)入生長(zhǎng)培養(yǎng)基，培養(yǎng)至長(zhǎng)成完整小苗；其中，生長(zhǎng)培養(yǎng)基采用 MS培養(yǎng)基，在其中附加10mg/L維生素C、蔗糖20g/L和瓊脂6g/L，pH5. 8。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的福建山櫻花體細(xì)胞胚胎發(fā)生方法，其特征在于步驟(1)中， 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的2，4-D的濃度為2. (Γ3. Omg/L。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種福建山櫻花體細(xì)胞胚胎發(fā)生方法，該方法包括在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)未成熟胚的胚性愈傷組織、采用增殖培養(yǎng)基進(jìn)行胚性愈傷組織增殖、采用培育培養(yǎng)基和生長(zhǎng)培養(yǎng)基分別進(jìn)行胚狀體的發(fā)育和成熟，直至長(zhǎng)成完整小苗。本發(fā)明的福建山櫻花體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)為福建山櫻花的大規(guī)模無(wú)性繁殖育苗提供一種周期短、繁殖率高、成本低廉的方法，有效解決了福建山櫻花現(xiàn)存林分極為稀少、種子成熟時(shí)極易爆裂、種子的采收貯存與發(fā)芽極為困難、傳統(tǒng)育種方法困難、且育種效率低，無(wú)法滿足園林綠化及生產(chǎn)需要問(wèn)題。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102217534SQ201110097798
公開(kāi)日2011年10月19日 申請(qǐng)日期2011年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月19日
發(fā)明者呂月良, 張?jiān)? 施季森, 蘇倩, 陳璋, 陳金慧 申請(qǐng)人:南京林業(yè)大學(xué)