專利名稱：一種東哥阿里發(fā)狀根系的制備與培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物發(fā)狀根系的制備與培養(yǎng)方法，特別涉及一種東哥阿里狀根系的制備與培養(yǎng)方法，屬生物細(xì)胞工程技術(shù)。
背景技術(shù)：
東哥阿里(TongkatAli)的學(xué)名是 Eurycoma longifolia Jack,屬于苦木科(Simaroubaceae)。東哥阿里是一種生長緩慢的熱帶雨林灌木植物,主要分布于馬來西亞、菲律賓、印度尼西亞和泰國等東南亞國家和地區(qū)。其根入藥，常用于治療瘧疾、痢疾、口腔潰瘍、猩紅熱、頭痛等疾病，還具有增強(qiáng)男性性功能的功效，被稱為“馬來西亞人參”。近來研究表明，從該植物種提取的苦木堿(quassinoids)還有很好的抗腫瘤和抗HIV效果。東哥阿里屬于雌雄異株植物。由于東哥阿里是世界著名的滋陰補(bǔ)陽藥物植物，以及陸續(xù)發(fā)現(xiàn)新的藥用功能，目前世界醫(yī)藥市場對原材料的需求量急劇上升；加上東哥阿里的生境屬于熱帶雨林第五，分布面積較小，所以使東哥阿里產(chǎn)量不能滿足市場需求。利用現(xiàn)代細(xì)胞工程技術(shù)制備藥用植物發(fā)狀根，并對發(fā)狀根進(jìn)行離體規(guī)?；囵B(yǎng)，可以快速大量地提取植物體中有效化學(xué)成分，也是進(jìn)行藥用植物資源可持續(xù)發(fā)展的有效途徑之一。由于發(fā)狀根具有生長速度快、分枝多、弱向地性，處于器官化水平，激素自養(yǎng)，生理生化、遺傳特征穩(wěn)定，有穩(wěn)定的次生代謝物質(zhì)合成能力，并且發(fā)狀根培養(yǎng)不受環(huán)境、生態(tài)、氣候等條件的限制。因此，利用發(fā)狀根培養(yǎng)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)東哥阿里替代野生資源，可以緩解日益增長的市場需求，而且也將解決依賴進(jìn)口原材料、提取物等花費(fèi)大量外匯的問題。因此，建立東哥阿里發(fā)狀根培養(yǎng)系統(tǒng)，大量生產(chǎn)東哥阿里替代原材料具有重要意義。目前，用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)形成的植物發(fā)狀根涉及到31科100余種雙子葉植物，而露水草(Cyanotis arachnoidea C. B. Clarke)是迄今單子葉植物中發(fā)狀根誘導(dǎo)成功的唯一例子。發(fā)狀根培養(yǎng)與傳統(tǒng)栽培獲得中草藥原材料相比具有如下優(yōu)點(diǎn)(I)發(fā)狀根中染色體和次生代謝產(chǎn)物的生物合成相對穩(wěn)定；(2)發(fā)狀根不僅生長速度快，而且次生代謝產(chǎn)物含量高，(3)不受病蟲害、地理和季節(jié)等各種環(huán)境因素的影響；(4)所獲得的產(chǎn)物可從培養(yǎng)體系內(nèi)直接提取，并快速、高效地回收與利用，簡化了分離與純化步驟；(5)有利于細(xì)胞篩選、生物轉(zhuǎn)化，合成新的有效成分；(6)有利于研究植物的代謝途徑，還可以利用某些基因工程 手段探索與創(chuàng)造新的合成路線，得到價(jià)值更高的產(chǎn)品；(7)節(jié)省大量用于種植原料的農(nóng)田。正是由于發(fā)狀根的上述優(yōu)點(diǎn)，為其工業(yè)化、規(guī)?；a(chǎn)優(yōu)質(zhì)中草藥原材料提供了基礎(chǔ)，成為繼組織培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)之后當(dāng)代生物技術(shù)領(lǐng)域重要的研究和開發(fā)熱點(diǎn)。利用植物發(fā)狀根進(jìn)行天然產(chǎn)物的生產(chǎn)進(jìn)入了一個(gè)嶄新的發(fā)展階段，植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)的次生代謝產(chǎn)物被人類廣泛應(yīng)用。通過發(fā)狀根培養(yǎng)可以生產(chǎn)的次生代謝產(chǎn)物有生物堿類(如莨菪烷生物堿、喹啉生物堿)、甙類、黃酮類、醌類和一些重要的酶(如超氧化物歧化酶)等。人參發(fā)狀根的生長速度大大快于常規(guī)激素誘導(dǎo)根生長速度，而且組織中人參阜苷積累效率高(Yu et al, 2005 ；Murthy et al, 2005 ;Sivakumar et al, 2005);通過培養(yǎng)條件優(yōu)化使莨菪發(fā)狀根生長速度提高幾倍至數(shù)十倍，而且發(fā)狀根中莨菪堿的合成效率是原植物的 2 倍以上，(Rothe et al, 2001 ；Palazon et al, 2003 ；Dechaux & Boitel-Conti,2005 ；IMano etal，1986);我國學(xué)者對青蒿發(fā)狀根進(jìn)行了大量研究，結(jié)果表明優(yōu)化培養(yǎng)條件可以改善青蒿素的合成與積累，發(fā)狀根培養(yǎng)30d后生物量干重和青篙素產(chǎn)量分別達(dá)到
13.7g/L和0. 23g/L(ffang et al，2002 ;劉春超等，1999);鄭明智等(2002)研究發(fā)現(xiàn)栝樓發(fā)狀根生產(chǎn)天花粉蛋白克鮮重含量到8. 16毫克。這些研究表明，發(fā)狀根培養(yǎng)體系正在成為生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的重要生物技術(shù)之一，有些藥用植物發(fā)狀根已經(jīng)進(jìn)行了工業(yè)化和商業(yè)化階段。目前利用生物細(xì)胞工程技術(shù)制備東哥阿里發(fā)狀根系還未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種利用生物細(xì)胞工程技術(shù)高效制備、培養(yǎng)東哥阿里發(fā)狀根系的方法。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明東哥阿里發(fā)狀根系制備與培養(yǎng)方法通過如下步驟實(shí)現(xiàn) 取東哥阿里幼嫩莖為外植體進(jìn)行脫分化處理，獲得新鮮東哥阿里愈傷組織，將愈傷組織與含有Ri質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌(DC-AR2)共培養(yǎng)，以無菌紙吸取多余菌液后轉(zhuǎn)入到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)，在東哥阿里愈傷組織處生長出東哥阿里發(fā)狀根；抑菌培養(yǎng)后將具有發(fā)狀根的外植體放入擴(kuò)增培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)狀根的擴(kuò)大培養(yǎng)。所述東哥阿里幼嫩莖脫分化處理方法如下取I 2cm東哥阿里幼嫩莖段置于MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L培養(yǎng)基中，25 °C ±3下暗培養(yǎng)10 35d，獲得新鮮東哥阿里愈傷組織；所述發(fā)根農(nóng)桿菌與東哥阿里愈傷組織共培養(yǎng)前，發(fā)根農(nóng)桿菌先在固體YEB培養(yǎng)基中25°C ±3下暗培養(yǎng)I 6d ;然后選取單克隆到液體YEB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，菌液離心收集菌體；將菌體置于MS液體培養(yǎng)基中混勻；所述發(fā)根農(nóng)桿菌與東哥阿里愈傷組織共培養(yǎng)培養(yǎng)基為含100umol/L乙酰丁香酮的MS固體培養(yǎng)基,共培養(yǎng)時(shí)間為Id ;所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含有400mg/L頭孢噻肟鈉的MS固體培養(yǎng)基；所述介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的外植體放入抑菌培養(yǎng)基中于25V ±1暗黑培養(yǎng)，每2 9d繼代培養(yǎng)一次，至少五次的抑菌培養(yǎng)處理，直至將菌除凈；所述將抑菌處理后具有發(fā)狀根的外植體放入發(fā)狀根擴(kuò)增培養(yǎng)是在25°C ±1暗黑振蕩培養(yǎng)；所述擴(kuò)增培養(yǎng)基為無激素MS液體基本培養(yǎng)基；所述振蕩培養(yǎng)箱搖床轉(zhuǎn)速為100 IlOr mirT1。本發(fā)明東哥阿里發(fā)狀根系誘導(dǎo)與培養(yǎng)方法具體為(I)將東哥阿里幼嫩莖剪成I 5cm的小段，無菌操作臺(tái)中用HgCl2處理6 13min,酒精浸泡5 IOs,無菌水沖洗3 8遍后轉(zhuǎn)入到MS+6-BA0. 5mg/L+NAA0. 3mg/L培養(yǎng)基中，25°C ±3下暗培養(yǎng)10 35d，獲得東哥阿里愈傷組織。(2)將發(fā)根農(nóng)桿菌DC-AR2菌株用無菌水稀釋后，將其菌液涂布在YEB固體培養(yǎng)基上，25°C ±3下暗培養(yǎng)I 6d，長出克隆菌體，獲得發(fā)根農(nóng)桿菌A4克隆菌體。(3)挑取發(fā)根農(nóng)桿菌A41單菌落接種于50mL液體YEB培養(yǎng)基中，25°C ±3振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)12小時(shí)，OD值為0. 3 I. 2，取Iml菌液置于100ml YEB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)8h，OD值為0. 3 0. 9，收集菌液，3500rpm下離心5 15分鐘收集菌體。(4)將步驟(3)收集的菌體置于IOOml含有l(wèi)OOumol/L乙酰丁香酮、0. 7%瓊脂的MS固體培養(yǎng)基中并混勻。
(5)用步驟(4)混勻后得到的菌液浸染東哥阿里愈傷組織10 30min，取出后用無菌紙吸取多余的菌液，將浸染的東哥阿里愈傷組織接入到含有l(wèi)OOumol/L乙酰丁香酮、
0.7%瓊脂的MS固體培養(yǎng)基中I 3d。(6)把含有400mg/L頭孢噻肟鈉的無激素MS固體培養(yǎng)基作為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，將步驟(5)浸染后的愈傷組織接入該誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，進(jìn)行抑菌繼代培養(yǎng)；25°C ±1暗黑培養(yǎng)，每2 9d繼代培養(yǎng)一次，至少五次的抑菌培養(yǎng)處理，直至將菌除凈。(7)用無激素MS液體培養(yǎng)基作為擴(kuò)增培養(yǎng)基，將抑菌處理后的誘導(dǎo)出來的發(fā)狀根放入擴(kuò)增培養(yǎng)基中，25°C ±1暗黑懸浮振蕩培養(yǎng)，振蕩搖床轉(zhuǎn)速為100 IlOr mirT1。本發(fā)明利用生物細(xì)胞工程技術(shù)建立東哥阿里發(fā)狀根培養(yǎng)系統(tǒng)，制備東哥阿里發(fā)狀根系，發(fā)狀根生長速度快、無激素培養(yǎng)、不依賴氣候和季節(jié)、自動(dòng)化/管道化生長控制、節(jié)省人力，實(shí)現(xiàn)了標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)東哥阿里，替代野生資源，緩解了東哥阿里日益增長的市場需求，而且解決了東哥阿里依賴進(jìn)口問題。對藥用植物發(fā)狀根的工業(yè)化和商業(yè)化開發(fā)具有重要意 義。


圖I東哥阿里愈傷組織照片；圖2本發(fā)明發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化東哥阿里愈傷組織產(chǎn)生發(fā)根的照片；圖3本發(fā)明東哥阿里發(fā)狀根擴(kuò)增后懸浮培養(yǎng)的照片。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)驗(yàn)例和實(shí)施例用于進(jìn)一步說明但不限于本發(fā)明。實(shí)施例I甘露堿紙層析分析(I)材料本發(fā)明新誘導(dǎo)出的東哥阿里發(fā)根(NTR);經(jīng)過繼代培養(yǎng)的本發(fā)明發(fā)根(TR);器官根(NR)、葉片(L)或愈傷細(xì)胞(C)，發(fā)根農(nóng)桿菌A4菌液；(2)農(nóng)桿堿的提取分別取Ig上述樣品，加Iml (0. 1M)HC1室溫研磨，12，OOOrpm離心5min，取上清液lOiil，以微量進(jìn)樣器點(diǎn)樣。(3)層析層析濾紙的制備將層析濾紙裁成8X8 (cm)規(guī)格，浸泡于0. 4mol/L的HCl溶液中24h，然后用蒸餾水淋洗，再依次用乙醇、乙醚洗滌后，平放在托盤上，30°C下涼
干，備用。(4)樣品點(diǎn)樣距層析濾紙底邊I I. 5cm處劃一直線，鉛筆標(biāo)記出等距離的點(diǎn)樣線.以微量進(jìn)樣器點(diǎn)上5iU樣品，邊滴加邊吹干。(5)層析展開干燥濾紙垂直置入密閉的已飽和層析罐，待液體上限距上邊緣2 4cm時(shí)取出。(6)顯色將濾紙吹干后，浸入0. 2% AgNO3丙酮液lmin，取出風(fēng)干；然后浸入1%NaOH-甲醇液2 3min,最后用5%硫代硫酸鈉液固定,觀察并攝影。(7)結(jié)果對東哥阿里毛狀根的農(nóng)桿堿紙層分析，毛狀根樣品與農(nóng)桿堿標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)板斑點(diǎn)位置相近，此位置東哥阿里原植物及東哥阿里未侵染愈傷組織均沒有此斑點(diǎn)。說明發(fā)根農(nóng)桿菌基因已經(jīng)存在植物基因組中并表達(dá)。實(shí)施例2
(I)將東哥阿里幼嫩莖剪成2cm的小段，無菌操作臺(tái)中用HgCl2處理7min，酒精浸泡6s，無菌水沖洗4遍后轉(zhuǎn)入到MS+6-BA0. 5mg/L+NAA0. 3mg/L培養(yǎng)基中，25°C ±2下暗培養(yǎng)12d，獲得東哥阿里愈傷組織。(2)將發(fā)根農(nóng)桿菌DC-AR2菌株用I ii L無菌水稀釋后，將其菌液涂布在20mL YEB固體培養(yǎng)基上，25°C ±3下暗培養(yǎng)4d長出單克隆，獲得發(fā)根農(nóng)桿菌A4克隆菌體。(3)挑取發(fā)根農(nóng)桿菌A4克隆菌體置于YEB培養(yǎng)基中，25°C ±2振蕩培養(yǎng)，OD值為
0.5，取Iml菌液置于IOOmlYEB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，OD值為0. 5，收集菌液，3000rpm下離心7min收集菌體。(4)將步驟(3)收集的菌體置于IOOml含有l(wèi)OOumol/L乙酰丁香酮、0. 7%瓊脂的MS固體培養(yǎng)基中并混勻。 (5)用步驟(4)混勻后得到的菌液浸染東哥阿里愈傷組織12min，取出后用無菌紙吸取多余的菌液，將浸染的東哥阿里愈傷組織接入到含有l(wèi)OOumol/L乙酰丁香酮、0. 7%瓊脂的MS固體培養(yǎng)基中2d。(6)把含有400mg/L頭孢噻肟鈉的無激素MS固體培養(yǎng)基作為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，將步驟
(5)浸染后的愈傷組織接入該誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，進(jìn)行抑菌繼代培養(yǎng)；每7(1繼代培養(yǎng)一次，至少五次的抑菌培養(yǎng)處理，直至將菌除凈。(7)把無激素MS液體基本培養(yǎng)基作為擴(kuò)增培養(yǎng)基，將抑菌處理后的發(fā)狀根外植體放入該擴(kuò)增培養(yǎng)基中，25°C ±1暗黑懸浮振蕩培養(yǎng)，振蕩搖床轉(zhuǎn)速為100 IlOr mirT1。實(shí)施例3(I)將東哥阿里幼嫩莖剪成4cm的小段，無菌操作臺(tái)中用HgCl2處理lOmin，酒精浸泡8s，無菌水沖洗7遍后轉(zhuǎn)入到MS+6-BA0. 5mg/L+NAA0. 3mg/L培養(yǎng)基中，25°C ±2下暗培養(yǎng)30d，獲得東哥阿里愈傷組織。 (2)將發(fā)根農(nóng)桿菌DC-AR2菌株用I y L無菌水稀釋后，將其菌液涂布在20mL YEB固體培養(yǎng)基上，25°C ±3下暗培養(yǎng)5d長出單克隆，獲得發(fā)根農(nóng)桿菌A4克隆菌體。。(3)挑取發(fā)根農(nóng)桿菌A4克隆菌體置于YEB培養(yǎng)基中，25°C ±2振蕩培養(yǎng)，OD值為1，取Iml菌液置于IOOmlYEB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，OD值為0. 7，收集菌液，3000rpm下離心IOmin收集菌體。(4)將步驟(3)收集的菌體置于IOOml含有l(wèi)OOumol/L乙酰丁香酮、0. 7%瓊脂的MS固體培養(yǎng)基中并混勻。(5)用步驟(4)混勻后得到的菌液浸染東哥阿里愈傷組織25分鐘，取出后用無菌紙吸取多余的菌液，將浸染的東哥阿里愈傷組織接入到含有l(wèi)OOumol/L乙酰丁香酮、0. 7%瓊脂的MS固體培養(yǎng)基中2d。(6)把含有400mg/L頭孢噻肟鈉的無激素MS固體培養(yǎng)基作為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，將步驟
(5)浸染后的愈傷組織接入該誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，進(jìn)行抑菌繼代培養(yǎng)；每4(1繼代培養(yǎng)一次，至少五次的抑菌培養(yǎng)處理，直至將菌除凈。(7)把無激素MS液體基本培養(yǎng)基作為擴(kuò)增培養(yǎng)基，將抑菌處理后的發(fā)狀根外植體放入該擴(kuò)增培養(yǎng)基中，25°C ±1暗黑懸浮振蕩培養(yǎng)，振蕩搖床轉(zhuǎn)速為100 IlOr mirT1。
權(quán)利要求
1.一種東哥阿里發(fā)狀根系的制備與培養(yǎng)方法，其特征在于，通過如下步驟實(shí)現(xiàn)取東哥阿里幼嫩根莖為外植體進(jìn)行脫分化處理，獲得新鮮東哥阿里愈傷組織，將愈傷組織與與含有Ri質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，以無菌紙吸取多余菌液后轉(zhuǎn)入到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)，在東哥阿里幼莖表面生長出東哥阿里發(fā)狀根；抑菌培養(yǎng)后將具有發(fā)狀根的外植體放入擴(kuò)增培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)狀根的擴(kuò)大培養(yǎng)。
2.如權(quán)利要求I所述的東哥阿里發(fā)狀根系制備與培養(yǎng)方法，其特征在于，該方法中所述東哥阿里幼嫩莖脫分化處理時(shí)，是取I 2cm東哥阿里幼嫩莖段置于MS+6-BAQ.5mg/jNAAQ.3mg/L培養(yǎng)基中，25°C ±3下暗培養(yǎng)10 35d，獲得新鮮東哥阿里愈傷組織。
3.如權(quán)利要求I所述的東哥阿里發(fā)狀根系制備與培養(yǎng)方法，其特征在于，該方法中所述發(fā)根農(nóng)桿菌與東哥阿里愈傷組織共培養(yǎng)前，發(fā)根農(nóng)桿菌先在固體YEB培養(yǎng)基中25°C ±3下暗培養(yǎng)I 6d ;然后選取單克隆到液體YEB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，菌液離心收集菌體；將菌體置于MS液體培養(yǎng)基中混勻。
4.如權(quán)利要求I所述的東哥阿里發(fā)狀根系制備與培養(yǎng)方法，其特征在于，該方法中所述發(fā)根農(nóng)桿菌與東哥阿里愈傷組織共培養(yǎng)培養(yǎng)基為含lOOumol/L乙酰丁香酮的MS固體培養(yǎng)基，共培養(yǎng)時(shí)間為Id ;所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含有400mg/L頭孢噻肟鈉的MS固體培養(yǎng)基。
5.如權(quán)利要求I所述的東哥阿里發(fā)狀根系制備與培養(yǎng)方法，其特征在于，該方法中所述介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的外植體放入抑菌培養(yǎng)基中于25°C 土 I暗培養(yǎng)，每3 6d繼代培養(yǎng)一次，至少五次的抑菌培養(yǎng)處理，直至將菌除凈。
6.如權(quán)利要求I所述的東哥阿里發(fā)狀根系的制備與培養(yǎng)方法，其特征在于，該方法中所述將抑菌處理后具有發(fā)狀根的外植體放入發(fā)狀根擴(kuò)增培養(yǎng)是在25°C ±1暗黑振蕩培養(yǎng)；所述擴(kuò)增培養(yǎng)基為無激素MS液體基本培養(yǎng)基，所述振蕩培養(yǎng)箱搖床轉(zhuǎn)速為100 IlOr mirf1。
7.如權(quán)利要求1-6任何一種所述的東哥阿里發(fā)狀根系的制備與培養(yǎng)方法，其特征在于，該方法為 (1)將東哥阿里幼嫩莖剪成I 5cm的小段，無菌操作臺(tái)中用HgCl2處理6 13min，酒精浸泡5 IOs,無菌水沖洗3 8遍后轉(zhuǎn)入到MS+6-BA0. 5mg/L+NAA0. 3mg/L培養(yǎng)基中，250C ±3下暗培養(yǎng)10 35d，獲得東哥阿里愈傷組織； (2)將發(fā)根農(nóng)桿菌DC-AR2菌株用無菌水稀釋后，將其菌液涂布在YEB固體培養(yǎng)基上，250C ±3下暗培養(yǎng)I 6d，長出克隆菌體，獲得發(fā)根農(nóng)桿菌A4克隆菌體； (3)挑取發(fā)根農(nóng)桿菌A4單菌落接種于50mL液體YEB培養(yǎng)基中，25°C±3振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)12小時(shí)，OD值為0. 3 I. 2，取Iml菌液置于100ml YEB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)8h，OD值為0. 3 0. 9，收集菌液，3500rpm下離心5 15分鐘收集菌體； (4)將(3)收集的菌體置于IOOml含有l(wèi)OOumol/L乙酰丁香酮、0.7%瓊脂的MS固體培養(yǎng)基中并混勻； (5)用(4)混勻后得到的菌液浸染東哥阿里愈傷組織10 30min，取出后用無菌紙吸取多余的菌液，將浸染的東哥阿里愈傷組織接入到含有l(wèi)OOumol/L乙酰丁香酮、0. 7%瓊脂的MS固體培養(yǎng)基中I 3d; (6)把含有400mg/L頭孢噻肟鈉的無激素MS固體培養(yǎng)基作為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，將(5)浸染后的愈傷組織接入該誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，進(jìn)行抑菌繼代培養(yǎng)；25°C ± I暗黑培養(yǎng)，每2 9d繼代培養(yǎng)一次，至少五次的抑菌培養(yǎng)處理，直至將菌除凈； (7)用無激素MS液體培養(yǎng)基作為擴(kuò)增培養(yǎng)基，將抑菌處理后的誘導(dǎo)出來的發(fā)狀根放入擴(kuò)增培養(yǎng)基中，25°C ±1暗黑懸浮振蕩培養(yǎng)，振蕩搖床轉(zhuǎn)速為100 IlOr HiirT1。
8.如權(quán)利要求7所述的東哥阿里發(fā)狀根的制備與培養(yǎng)方法，其特征在于，該方法為 (1)將東哥阿里幼嫩根莖剪成2cm的小段，無菌操作臺(tái)中用HgCl2處理7min，酒精浸泡6s，無菌水沖洗4遍后轉(zhuǎn)入到MS+6-BA0. 5mg/L+NAA0. 3mg/L培養(yǎng)基中，26°C ±1下暗培養(yǎng)12d，獲得東哥阿里愈傷組織； (2)將發(fā)根農(nóng)桿菌DC-AR2菌株用無菌水稀釋后，將其菌液涂布在YEB固體培養(yǎng)基上，26°C ± I下暗培養(yǎng)4d長出單克隆，獲得發(fā)根農(nóng)桿菌A4克隆菌體； (3)挑取發(fā)根農(nóng)桿菌A4克隆菌體置于YEB培養(yǎng)基中，26°C± I振蕩培養(yǎng)，OD值為0.5，取Iml菌液置于IOOmlYEB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，OD值為0. 5，收集菌液，3，500rpm下離心7min收集菌體； (4)將(3)收集的菌體置于IOOml含有l(wèi)OOumol/L乙酰丁香酮、0.7%瓊脂的MS固體培養(yǎng)基中并混勻； (5)，用(4)混勻后得到的菌液浸染東哥阿里愈傷組織12min，取出后用無菌紙吸取多余的菌液，將浸染的東哥阿里愈傷組織接入到含有l(wèi)OOumol/L乙酰丁香酮、0. 7%瓊脂的MS固體培養(yǎng)基中2d ； (6)把含有400mg/L頭孢噻肟鈉的無激素MS固體培養(yǎng)基作為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，將(5)浸染后的愈傷組織接入該誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，進(jìn)行抑菌繼代培養(yǎng)；25°C ±1暗黑培養(yǎng)，每7d繼代培養(yǎng)一次，至少五次的抑菌培養(yǎng)處理，直至將菌除凈； (7)把無激素MS液體基本培養(yǎng)基作為擴(kuò)增培養(yǎng)基，將抑菌處理后的發(fā)狀根外植體放入該擴(kuò)增培養(yǎng)基中，25°C ±1暗黑懸浮振蕩培養(yǎng)，振蕩搖床轉(zhuǎn)速為100 IlOr HiirT1。
9.如權(quán)利要求7所述的東哥阿里發(fā)狀根的制備與培養(yǎng)方法，其特征在于，該方法為 (1)將東哥阿里幼嫩莖剪成4cm的小段，無菌操作臺(tái)中用HgCl2處理lOmin，酒精浸泡8s，無菌水沖洗7遍后轉(zhuǎn)入到MS+6-BA0. 5mg/L+NAA0. 3mg/L培養(yǎng)基中，26°C ±1下暗培養(yǎng)30d，獲得東哥阿里愈傷組織； (2)將發(fā)根農(nóng)桿菌DC-AR2菌株用無菌水稀釋后，將其菌液涂布在YEB固體培養(yǎng)基上，26°C ± I下暗培養(yǎng)4d長出單克隆，獲得發(fā)根農(nóng)桿菌A4克隆菌體； (3)挑取發(fā)根農(nóng)桿菌A4克隆菌體置于YEB培養(yǎng)基中，26°C±1振蕩培養(yǎng)，OD值為1，取Iml菌液置于IOOmlYEB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，OD值為0. 7，收集菌液，3，500rpm下離心12min收集菌體； (4)將(3)收集的菌體置于IOOml含有l(wèi)OOumol/L乙酰丁香酮、0.7%瓊脂的MS固體培養(yǎng)基中并混勻； (5)用(4)混勻后得到的菌液浸染東哥阿里愈傷組織20min，取出后用無菌紙吸取多余的菌液，將浸染的東哥阿里愈傷組織接入到含有l(wèi)OOumol/L乙酰丁香酮、0. 7%瓊脂的MS固體培養(yǎng)基中2d ； (6)把含有400mg/L頭孢噻肟鈉的無激素MS固體培養(yǎng)基作為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，將(5)浸染后的愈傷組織接入該誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，進(jìn)行抑菌繼代培養(yǎng)；25°C ±1暗黑培養(yǎng)，每5d繼代培養(yǎng)一次，至少五次的抑菌培養(yǎng)處理，直至將菌除凈；(7)把無激 素MS液體基本培養(yǎng)基作為擴(kuò)增培養(yǎng)基，將抑菌處理后的發(fā)狀根外植體放入該擴(kuò)增培養(yǎng)基中，25°C ±1暗黑懸浮振蕩培養(yǎng)，振蕩搖床轉(zhuǎn)速為100 IlOr HiirT1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種東哥阿里狀根系的制備與培養(yǎng)方法，屬生物細(xì)胞工程技術(shù)。該方法取東哥阿里幼嫩莖為外植體進(jìn)行脫分化處理，獲得新鮮東哥阿里愈傷組織，將愈傷組織與含有Ri質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌(DC-AR2)共培養(yǎng)，以無菌紙吸取多余菌液后轉(zhuǎn)入到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)，在東哥阿里愈傷組織處生長出東哥阿里發(fā)狀根；抑菌培養(yǎng)后將具有發(fā)狀根的外植體放入擴(kuò)增培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)狀根的擴(kuò)大培養(yǎng)。本發(fā)明利用生物細(xì)胞工程技術(shù)建立東哥阿里發(fā)狀根培養(yǎng)系統(tǒng)，制備東哥阿里發(fā)狀根系，實(shí)現(xiàn)了標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)東哥阿里，替代野生資源，緩解了東哥阿里日益增長的市場需求，而且解決了東哥阿里依賴進(jìn)口問題。對藥用植物發(fā)狀根的工業(yè)化和商業(yè)化開發(fā)具有重要意義。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102754594SQ201110108319
公開日2012年10月31日 申請日期2011年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月28日
發(fā)明者于振艷, 劉同祥, 葉乾堂, 張宗申 申請人:張宗申, 河南省海樂森藥用細(xì)胞工程技術(shù)有限公司