專利名稱：基于生物體壽命篩選提高誘導(dǎo)性多能干細胞產(chǎn)生效率的化合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及篩選提高誘導(dǎo)性多能干細胞(induced pluripotent stem cell,簡稱iPSC)產(chǎn)生效率的化合物的方法，具體是基于生物體壽命，特別是果蠅壽命篩選提高誘導(dǎo)性多能干細胞產(chǎn)生效率的化合物的方法。本發(fā)明還涉及壽命延長化合物，特別是果蠅壽命延長化合物，具體是雷帕霉素、PP242、PQ401、白藜蘆醇、非瑟酮、亞精胺、LY294002和姜黃色素在提高誘導(dǎo)性多能干細胞產(chǎn)生效率中的新用途。
背景技術(shù)：
胚胎干細胞(ESC)是一群來源于胚胎囊胚期內(nèi)細胞團，能夠在體外無限增殖，同時保持多向分化能力的細胞。十多年前，人胚胎干細胞的成功分離給再生醫(yī)學(xué)帶來極大希望?？茖W(xué)家們預(yù)期ESC定向分化的研究將有助于加速細胞移植臨床治療的步伐。然而，ESC本身無法避免的倫理問題以及異體細胞移植的免疫排斥問題構(gòu)成了 ESC治療應(yīng)用于臨床的巨大障礙。誘導(dǎo)性多能干細胞的出現(xiàn)在很大程度上同時解決了以上兩個問題，iPSC最初通過向體細胞中以病毒方式導(dǎo)入外源的四個轉(zhuǎn)錄因子而獲得，具有與ESC相似的形態(tài)和表觀遺傳特征，更重要的是，兩者具有相似的分化能力，即分化的全能性(pluripotency)[1]。iPSC的出現(xiàn)使得無倫理爭議的患者特異性的干細胞獲得成為可能，而由患者特異性的iPSC分化得到的特異性前體細胞和成熟細胞在組織器官移植治療、基因治療、藥物篩選模型建立，以及特異疾病分子機制的研究方面無疑具有相當大的優(yōu)勢和潛力[2]。自2006年第一篇iPSC的報道以來，這個領(lǐng)域已經(jīng)在各國科學(xué)家的努力下有了突飛猛進的發(fā)展。目前，已有三個小組宣布成功獲得無病毒整合的人類誘導(dǎo)性多能干細胞[3_5]。這標志著誘導(dǎo)性多能干細胞研究向臨床應(yīng)用邁出了重要一步。同時，蛋白質(zhì)和維生素C的應(yīng)用將誘導(dǎo)性多能干細胞的低誘導(dǎo)效率迅速提高，首次利用誘導(dǎo)性多能干細胞克隆出活體實驗鼠的四倍體互補試驗則證明了誘導(dǎo)性多能干細胞具備和ES同樣的發(fā)育潛能。因此誘導(dǎo)性多能干細胞在細胞形態(tài)、生長特性、干細胞標志物表達等方面與ES細胞非常相似，形成嵌合體動物方面也與ES細胞幾乎完全相同。但是，在誘導(dǎo)性多能干細胞誘導(dǎo)技術(shù)迅速進展的同時，對于誘導(dǎo)性多能干細胞誘導(dǎo)過程中分子機制的研究卻進展緩慢，這成為誘導(dǎo)性多能干細胞應(yīng)用于臨床的主要障礙。我們知道，外源因子誘導(dǎo)的細胞重編程是一個非常緩慢的過程，通常需要兩周甚至更長時間，在這個過程中，大部分細胞并未被重編程，只有極少數(shù)(一般為0. 5%)的細胞在經(jīng)過了若干個中間態(tài)之后被完全重編程[6]。從以前的研究結(jié)果上看，誘導(dǎo)性多能干細胞產(chǎn)生效率基本相同，效率大約為從十萬個起始細胞獲得十個誘導(dǎo)的多潛能干細胞，此效率非常低。低效率會嚴重影響誘導(dǎo)性多能干細胞的推廣和應(yīng)用。自從誘導(dǎo)性多能干細胞產(chǎn)生以來，對其重編程機制和高效率的探索就沒有停止過，目前的研究證明有一些化合物通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)來提高誘導(dǎo)性多能干細胞的產(chǎn)生效率，然而本領(lǐng)域仍然非常需要能提高誘導(dǎo)性多能干細胞產(chǎn)生效率的化合物，也需要更有效的系統(tǒng)來篩選能提高誘導(dǎo)性多能干細胞產(chǎn)生效率的化合物。生物體壽命和誘導(dǎo)性多能干細胞的產(chǎn)生過程都是由多信號、多途徑調(diào)控的。前期的研究工作顯示，抗氧化物維生素C能延長果蠅的壽命。也有報道稱維生素C能顯著提高iPSC誘導(dǎo)效率[8]。這些研究提示，生物體壽命調(diào)控途徑可能與細胞重編程調(diào)控途徑，進而與誘導(dǎo)多能干細胞相關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明測試了多種具有壽命延長作用的化合物，驚訝地發(fā)現(xiàn)這些化合物基本上都具有誘導(dǎo)多能干細胞的作用。因此，本發(fā)明的目的在于提供一種能更高效地篩選提高誘導(dǎo)性多能干細胞產(chǎn)生效率的化合物的方法。這種方法在現(xiàn)有篩選方法的基礎(chǔ)上，引入根據(jù)生物體壽命進行預(yù)篩選的步驟，具有操作簡便、參考價值高、經(jīng)濟節(jié)約等特點，能夠更高效、更準確地篩選到提高誘導(dǎo)性多能干細胞產(chǎn)生效率的化合物。 具體地，本發(fā)明提供一種篩選提高誘導(dǎo)性多能干細胞產(chǎn)生效率的化合物的方法，所述方法包括I)提供候選化合物；2)用生物體預(yù)篩選能延長生物體壽命的化合物；和3)從上述步驟2)中篩選到的化合物中進一步篩選提高誘導(dǎo)性多能干細胞產(chǎn)生效率的化合物。更具體地，上述本發(fā)明方法的步驟2)可包括i)用候選化合物喂食或培育生物體；ii)觀察生物體的壽命變化；和iii)選擇能延長生物體壽命的化合物。在一個具體實施方式
中，候選化合物可以是任何化合物，優(yōu)選是根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)推斷可能延長生物體壽命的化合物，例如mTOR抑制劑、抗氧化劑或DNA修復(fù)促進劑等。在另一實施方式中，本發(fā)明所用的生物體可以是細菌、真菌或動物體，優(yōu)選是生物學(xué)實驗中用作模式生物的那些。在生物體篩選中候選化合物的用量應(yīng)該是對該生物體不產(chǎn)生明顯毒性的用量，例如，每千克體重O. Ol-IOOmg,例如每千克體重O. 01mg、0. 05mg、0. lmg、0. 5mg、lmg、2mg、5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg或其間任何范圍，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)和有限實驗不難確定這一用量。在另一實施方式中，可通過多種指標或參數(shù)觀察生物體壽命變化，包括但不限于，記錄生物體的存活時間、隨時間記錄生物體的死亡情況、檢測生物體的壽命相關(guān)生理指標如基礎(chǔ)代謝率、檢測生物體的壽命相關(guān)分子指標如端粒長度等等。另一方面，上述本發(fā)明方法的步驟3)可包括a)提供動物細胞；b)用誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)染所述動物細胞并與步驟I)中篩選出的化合物相接觸；c)檢測誘導(dǎo)性多能干細胞的數(shù)量；和d)選擇能增加誘導(dǎo)性多能干細胞產(chǎn)生數(shù)量的化合物。
在一個具體實施方式
中，所述動物細胞可以是部分分化的細胞或終末分化的細胞。在另一具體實施方式
中，所述動物細胞可從商業(yè)途徑購得或用本領(lǐng)域分離方法動物體制備，其中所述動物體可以是成體或胚胎。在又一實施方式中，轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子的過程是通過本領(lǐng)域常規(guī)方式進行的，例如通過病毒載體轉(zhuǎn)染、通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染等，優(yōu)選通過病毒載體轉(zhuǎn)染。所述病毒載體可以是逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒等，優(yōu)選逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，例如PMXs載體。在一個實施方式中，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子能誘導(dǎo)多能干細胞的任何轉(zhuǎn)錄因子，例如Sox2、Klf4、0ct4和c-Myc (在本文中縮寫為SK0M)。在另一個具體實施方式
中，所述化合物接觸步驟可以是簡單地將一定濃度的化合物加入動物細胞培養(yǎng)液中，也可以是通過某種載體，例如脂質(zhì)體、乳化劑等將一定濃度的化合物與動物細胞相接觸。所述化合物接觸步驟可以在轉(zhuǎn)染過程之前、期間或之后開始進行，例如，可以在轉(zhuǎn)染過程開始之前或之后1-10天開始進行，并持續(xù)1-20天或更長時間。具體說，所述化合物接觸步驟可以在轉(zhuǎn)染過程之前或之后I天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天開始進行。更具體說，所述化合物接觸步驟可持續(xù)進行(例如)1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、12天、14天、16天、18天或20天或其間 任何范圍。在動物細胞篩選中所用的化合物終濃度可以是對該動物細胞沒有明顯毒性的任何濃度，根據(jù)具體化合物，可以是(例如)0. OlnM至100 u M，例如0. 01nM、0. 03nM、0. 05nM、
0.07nM、0. lnM、0. 3nM、0. 5nM、0. 7nM、lnM、3nM、5nM、7nM、10nM、15nM、20nM、25nM、30nM、35nM、40nM、45nM、50nM、55nM、60nM、65nM、70nM、75nM、80nM、85nM、90nM、95nM、1uM、5uM、10uM、15 u M、20 u M、25 u M、30 u M、35 u M、40 u M、45 u M、50 u M、55 u M、60 u M、65 u M、70 u M、75 uM,80u M、85 uM,90u M、95 u M、100 u M或其間任何范圍，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)和有限實驗不難確定這一濃度。在一個實施方式中，所述檢測誘導(dǎo)性多能干細胞數(shù)量的步驟可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的一種或多種方法進行，包括但不限于，可通過本領(lǐng)域已知的染色法，例如免疫染色 法直接檢測攜帶誘導(dǎo)性多能干細胞標志基因的細胞。這些標志基因可以分布在細胞表面或細胞內(nèi)，甚至是細胞核內(nèi)的標志基因，例如堿性磷酸酶、SSEA-I和/^Nanog ;也可以是本發(fā)明所述的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子，例如是Sox2、Klf4、0ct4和c-Myc中一種或多種。染色后，可通過例如以下方法進行定量測定利用血球計數(shù)板計數(shù)法在顯微鏡下觀察染色細胞的數(shù)量；利用流式細胞術(shù)對染色細胞計數(shù)；對染色總量的定量分析；等等。另外，也可通過本領(lǐng)域已知的報告基因法間接檢測攜帶誘導(dǎo)性多能干細胞標志基因的細胞的數(shù)量。所述報告基因可以構(gòu)建成在標志基因表達時表達的可檢測基因，包括如上所述標志基因表達時驅(qū)動其表達的可檢測基因，優(yōu)選Sox2、Klf4、0ct4和c-Myc中一種或多種表達時驅(qū)動其表達的可檢測基因，更優(yōu)選0ct4表達時驅(qū)動其表達的可檢測基因，例如是熒光蛋白基因，如GFP或YFP基因。所述報告基因可以在進行本發(fā)明步驟2)之前、期間或之后引入所述動物細胞中，優(yōu)選在進行本發(fā)明步驟2)之前引入所述動物細胞中。染色后，可通過例如以下方法進行定量測定利用血球計數(shù)板計數(shù)法在熒光顯微鏡下觀察發(fā)出熒光的細胞數(shù)量；利用流式細胞術(shù)對發(fā)出熒光的細胞計數(shù)；對熒光總量的定量分析；等等。另外，還可通過本領(lǐng)域已知的蛋白質(zhì)或mRNA定量測定法對經(jīng)處理的全部細胞中的標志基因進行定量測定，來確定誘導(dǎo)性多能干細胞的相對數(shù)量。這種方法具體可包括但不限于，蛋白質(zhì)印跡法、逆轉(zhuǎn)錄PCR和/或?qū)崟r定量PCR等。運用上述基于生物體壽命來進行誘導(dǎo)性多能干細胞相關(guān)化合物的篩選，成功篩選出雷帕霉素、PP242、PQ401等壽命延長化合物具有提高誘導(dǎo)性多能干細胞產(chǎn)生效率的作用，且它們對誘導(dǎo)性多能干細胞的多潛能干細胞特性沒有影響。因此，本發(fā)明的目的還在于提供壽命延長化合物在提高誘導(dǎo)性多能干細胞產(chǎn)生效率中的應(yīng)用。經(jīng)過實驗證實，本發(fā)明測試的 所有壽命延長化合物基本上都能提高誘導(dǎo)性多能干細胞產(chǎn)生效率。另外所篩選出的提高誘導(dǎo)性多能干細胞產(chǎn)生效率的化合物不影響誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子的表達、不影響干細胞多能性；獲得的誘導(dǎo)性干細胞在生理條件下具有多潛能性。


圖IA和B分別說明PP242和PQ401處理后，綠色熒光蛋白(GFP)陽性細胞占小鼠胚胎成纖維細胞總數(shù)的百分數(shù)，η = 4，數(shù)據(jù)表示為平均值土標準誤ΓΡ < O. 01，*Ρ<0. 05)。圖IC和E分別說明飼喂3μΜ雷帕霉素以及如圖所示不同濃度ΡΡ242和PQ401的情況下，W1118果蠅成活百分比的時程變化。圖ID和F分別說明飼喂3 μ M雷帕霉素以及如圖所示不同濃度ΡΡ242和PQ401的情況下，W1118果蠅平均存活時間的柱形圖，數(shù)據(jù)表示平均值土標準誤Γ"Ρ < O. 001廣P < O. 01)。圖IG說明所有測試化合物(O. 3ηΜ雷帕霉素、
O.InM PP242、0.3nM PQ401、3 μ M 白藜蘆醇、3 μ M 非瑟酮、30ηΜ 亞精胺、O. 3 μ M LY294002、10 μ M姜黃色素)均引起綠色熒光蛋白(GFP)陽性細胞百分數(shù)增加。圖IH是圖IG所示所有測試化合物的功能機制、壽命延長的證據(jù)和重編程效率提高倍數(shù)的匯總。圖2Α和C分別說明用不同濃度的雷帕霉素(Rapa)處理小鼠胚胎成纖維細胞16天或用O. 3ηΜ雷帕霉素處理小鼠胚胎成纖維細胞不同時間后產(chǎn)生的綠色熒光蛋白(GFP)陽性集落占所有集落數(shù)量的百分數(shù)，數(shù)據(jù)表示平均值土標準誤。圖2Β說明雷帕霉素(Rapa)處理后GFP陽性細胞占小鼠胚胎成纖維細胞總數(shù)的百分數(shù)，η = 4，數(shù)據(jù)表示平均值土標準誤(**Ρ < O. 01，*Ρ < O. 05)。圖2D從左到右分別是雷帕霉素(Rapa)處理后誘導(dǎo)的誘導(dǎo)性多能干細胞的明場顯微照片、熒光(GFP)顯微照片和堿性磷酸酶染色顯微照片。圖2Ε顯示雷帕霉素(Rapa)處理誘導(dǎo)的誘導(dǎo)性多能干細胞中內(nèi)源多能性標記Nanog、0ct4和Sox2的相對mRNA表達水平，其中#2、#4和#5分別代表不同集落的編號。圖2F分別是雷帕霉素(Rapa)處理后產(chǎn)生的GFP陽性誘導(dǎo)性多能干細胞的Nanog和SSEA-I免疫染色顯微照片。圖2G是雷帕霉素(Rapa)處理后產(chǎn)生的誘導(dǎo)性多能干細胞的核型分析圖。圖2H顯示雷帕霉素(Rapa)處理后產(chǎn)生的誘導(dǎo)性多能干細胞產(chǎn)生的嵌合體小鼠。圖3顯示經(jīng)流式細胞術(shù)分析，對照和雷帕霉素(O. 3nM)處理條件下逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染第12天綠色熒光蛋白陽性細胞占全部細胞的百分數(shù)。圖4A-F分別顯示不同濃度的白藜蘆醇、非瑟酮、亞精胺、LY294002、姜黃色素和二甲雙胍誘導(dǎo)的GFP陽性誘導(dǎo)性多能干細胞的百分數(shù)。
具體實施例方式I.定義本文所用術(shù)語“胚胎干細胞”或“ES細胞”指衍生自胚胎、能夠在體外無限增殖同時保持多向分化能力的細胞。
本文所用術(shù)語“誘導(dǎo)性多能干細胞”或“iPSC”指具有與ESC相似的形態(tài)、表觀遺傳特征和分化能力，但不衍生自胚胎的細胞。具體說，誘導(dǎo)性多能干細胞可以是通過物理、化學(xué)、生物學(xué)、遺傳工程學(xué)等手段誘導(dǎo)產(chǎn)生的多能干細胞。所述誘導(dǎo)性多能干細胞可以來自無脊椎動物或脊椎動物，優(yōu)選來自脊椎動物，具體可以來自魚類、鳥類或哺乳動物，更具體可以來自嚙齒動物、貓科動物、犬科動物或靈長動物，最優(yōu)選來自小鼠、大鼠、犬、稱猴、黑猩猩或人。本文所用術(shù)語“誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子”指能誘導(dǎo)多能干細胞的轉(zhuǎn)錄因子，具體可以是SKOM轉(zhuǎn)錄因子，即Sox2、Klf4、0ct4和c-Myc。本領(lǐng)域已知，以病毒方式向體細胞中導(dǎo)入所述誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子后可獲得誘導(dǎo)性多能干細胞。本文所用術(shù)語“生物體”指細菌、真菌或動物，常常是生物學(xué)實驗中用作模式生物
的生命周期較短的那些，包括但不限于真細菌、酵母菌、線蟲、昆蟲、嚙齒動物、魚類等，具體可以是大腸桿菌、芽孢桿菌、釀酒酵母、秀麗新小桿線蟲(C. elegans)、果蠅(Drosophila)、小鼠、大鼠或斑馬魚等等，優(yōu)選果蠅、小鼠、大鼠、酵母或魚，更優(yōu)選果蠅。當然，小鼠和大鼠生命周期長達1-2年，飼養(yǎng)條件要求苛刻，不大適用于大規(guī)模的化合物篩選研究。本文所用術(shù)語“壽命延長化合物”指能夠延長生物體壽命的化合物，包括但不限于mT0R抑制劑、抗氧化劑、DNA修復(fù)促進劑、雷帕霉素、PP242、PQ401、白藜蘆醇、非瑟酮、亞精胺、LY294002和姜黃色素等。本文所用術(shù)語“雷帕霉素”也稱為西羅莫司(Sirolimus)，是一種mTOR信號通路的抑制劑，在果蠅和小鼠動物模型上均能延長生物體壽命[9];本文所用術(shù)語“PP242”為
\[一~(C16H16N6O)，它也是mTOR信號通路抑制劑；本文所用術(shù)語“PQ401”
、入N』
人
Cl
為(Ci8Hi6c1na),它是類胰島素一號生長因子拮抗劑。本文所用術(shù)語
[TyS 0Me
O
“LY294002，，*;Y o. N,、(C19H18ClNO3)。
A1本文所用術(shù)語“全能性”指分化形成完整生物體的能力。本文所用術(shù)語“動物細胞”指來源于動物體的細胞。一方面，這類細胞可來自無脊椎動物或脊椎動物，優(yōu)選來自脊椎動物，具體可以來自魚類、鳥類或哺乳動物，更具體可以來自嚙齒動物、貓科動物、犬科動物或靈長動物，最優(yōu)選來自小鼠、大鼠、犬、獼猴、黑猩猩或人。另一方面，這類細胞可以是部分分化的細胞或終末分化的細胞。所述“部分分化的細胞”指從全能干細胞分化的、不具有全能性、但仍保持一定分化能力的細胞；所述“終末分化的細胞”指從全能干細胞分化的、不具有全能性、也喪失進一步分化能力的細胞。所述“部分分化細胞”包括成纖維細胞、神經(jīng)母細胞、淋巴母細胞、造血干細胞、基底細胞、成骨細胞、上皮細胞、毛細胞；所述“終末分化細胞”包括血細胞、淋巴細胞、肌細胞、肝細胞、腎細胞、神經(jīng)細胞、星形細胞、粘液細胞等。該術(shù)語可以指來源于動物胚胎的細胞，例如來源于動物胚胎的成纖維細胞，優(yōu)選來源于小鼠胚胎的成纖維細胞。II.實施例下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。材料W1118果蜆由英國劍橋大學(xué)醫(yī)學(xué)研究所Damian Crowther博士提供；pMXs載體為東京大學(xué)Toshio Kitamura教授饋贈；plat_E細胞來自廣州生物醫(yī)藥健康研究院； 原味米粉購自中國上海市的雀巢公司(目錄號Q/SCQC0005S)，人工氣候箱購自江南寧波儀器公司(中國浙江省寧波市)；雷帕霉素購自惠氏公司(中國上海市)；PQ401和PP242購自中國上海市的西格瑪奧德里奇公司(Sigma-Aldrich);白藜蘆醇、非瑟酮、亞精胺購自中國上海的西格瑪公司(Sigma) ;LY294002和姜黃色素購自美國密蘇里州的特克利公司(Tocris) ;Polybrene購自中國上海的密理博公司(Milipore);實驗中所用培養(yǎng)基、FBS、KSR和LIF購自中國上海的吉布科公司(Gibco BRL) ;L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β-巰基乙醇等基本生化試劑購于中國上海實驗試劑有限公司。 Trizol試劑和PCR混合物(PCR MIX)和堿性磷酸酶染色試劑盒(85L3R)購自中國上海的西格瑪公司(Sigma) ;M_MLV購自中國上海的普洛麥格公司(Promega) ;Eva綠(EvaGreen)購自美國加利福尼亞州拜騰公司(Biotium) ;SSEA_1抗體480 (sc21702)和Nanog抗體M-149(sc33760)均來自美國加利福利亞州圣克魯斯生物技術(shù)公司(Santa Cruz)；MX3000P型PCR機購自美國加利福尼亞州司查塔基公司(Stratagene)。方法 果蠅壽命學(xué)野生型果蠅回交6次以上，產(chǎn)生Fl子代分為20只/管，每個處理5管共100只果蠅。所有實驗用果蠅均飼養(yǎng)在保持25°C、65%濕度飼養(yǎng)條件和白天12小時晚上12小時晝夜周期的人工氣候箱中，每天記錄果蠅的死亡數(shù)目。果蠅食物由1.4mL相應(yīng)濃度化合物的水溶液與O. 55g速溶原味米粉充分混合而成。果蠅食物每兩天更換一次，果蠅壽命數(shù)據(jù)用SPSS 13. O軟件(IBM公司，美國紐約市)中Kaplan-Meier統(tǒng)計分析作圖。 小鼠胚胎成纖維細胞分離按Huangfu Dff等所述的方法[19]獲得含有GFP報告基因并由0CT4驅(qū)動表達的轉(zhuǎn)基因小鼠模型0G2+/-/R0SA26+/-(0G2)GFP小鼠，將0G2+/-/R0SA26+/-(0G2)GFP小鼠(13. 5胚胎期)處死，去掉所有的腺體和內(nèi)臟，直接由胚胎分離胚胎成纖維細胞，細胞經(jīng)過傳代3次后在后續(xù)試驗中使用。所用小鼠基因組中帶有綠色熒光蛋白基因，該基因的表達受0ct4轉(zhuǎn)錄因子驅(qū)動表達，而0ct4只有在轉(zhuǎn)染了 SKOM的誘導(dǎo)性多能干細胞中才有表達，因而可通過檢測綠色熒光蛋白發(fā)出的熒光來檢測誘導(dǎo)性多能干細胞。 逆轉(zhuǎn)錄病毒制作和誘導(dǎo)性多能干細胞的誘導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄病毒用含鼠源Sox2、Klf4、0ct4和c-Myc編碼序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMXs轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞系plat_E，包裝病毒。并用此病毒液轉(zhuǎn)染液感染小鼠胚胎成纖維細胞2輪,加入終濃度8 μ g/mL的Polybrene以提高病毒轉(zhuǎn)染率。在此之后，將細胞換入mES培養(yǎng)液(含有15% FBS (胎牛血清)、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β -巰基乙醇和1000U/ml LIF的DMEM中繼續(xù)培養(yǎng)，并將這天定義為感染后第O天。 化合物處理化合物先用水或者DMSO溶解，用mES培養(yǎng)液稀釋到相應(yīng)濃度，加入培養(yǎng)有小鼠成纖維細胞的mES培養(yǎng)液中。并在感染后第12天用流式細胞儀檢測GFP陽性集落，在熒光顯微鏡下計算G FP陽性細胞的數(shù)目(至少計算兩盤細胞)。為了獲得完全的重編程誘導(dǎo)性多能干細胞，在感染后第16天，從SKOM轉(zhuǎn)染的小鼠胚胎成纖維細胞中挑取ES樣集落，胰酶消化為單細胞懸液轉(zhuǎn)入含有15% KSR(Knockout Serum Replacement,敲除血清替代物)、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β -巰基乙醇和1000U/ml LIF的DMEM培養(yǎng)液的96孔板中。 誘導(dǎo)性多能干細胞的驗證堿性磷酸酶(AP)和SSEA-I為誘導(dǎo)性多能干細胞表面的標志蛋白，Nanog是誘導(dǎo)性多能干細胞特異性表達的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，本領(lǐng)域技術(shù)人員常常用它們的特異染色來驗證誘導(dǎo)性多能干細胞。具體是將建立好的誘導(dǎo)性多能干細胞以I X IO4個/孔密度轉(zhuǎn)入24孔板，兩天后使用堿性磷酸酶染色試劑盒、SSEA-I抗體480和Nanog抗體M-149對細胞中的堿性磷酸酶、Nanog和SSEA-I染色。 逆轉(zhuǎn)錄實時定量PCR :用Trizol試劑從細胞裂解液中提取總的RNA，用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄，PCR反應(yīng)體系2x PCR混合物(PCR MIX)加上Eva綠(EvaGreen)在MX3000P型PCR機上反應(yīng)測出基因相對表達并用內(nèi)參標準化。實時定量PCR反應(yīng)條件如下94°C初始變性5分鐘，后接94°C變性30秒鐘、58°C退火60秒鐘、72°C擴增60秒鐘的35個循環(huán)。實時定量PCR中所用的引物如下0CT4 正義引物TCTTTCCACCAGGCCCCCGGCTC(SEQ ID NO :1)；0CT4 反義引物TGCGGGCGGACATGGGGAGATCC(SEQ ID NO :2)；Sox 2 正義引物TAGAGCTAGACTCCGGGCGATGA(SEQ ID NO :3)；Sox 2 反義引物TTGCCTTAAACAAGACCACGAAA(SEQ ID NO :4)；Nanog 正義引物AGGGTCTGCTACTGAGATGCTCTG(SEQ ID NO :5)；Nanog 反義引物CAACCACTGGTTTTTCTGCCACCG (SEQ ID NO :6)。 嵌合體小鼠通過顯微注射的方法將iPSC細胞注射到供體小鼠的囊胚腔中，再將注射后的囊胚移植到假孕雌鼠的子宮中，從而獲得嵌合體小鼠。 核型分析方法取實驗組與對照的中期細胞，用細胞核堿性染料進行染色后，將染色體配對，在顯微鏡下拍照后進行對比。除非另有特別說明，以下實施例均采用上述材料和方法進行。實施例I雷帕霉素、PP242和PQ401對果蠅壽命的影響本發(fā)明人根據(jù)上述方法檢測3 μ M雷帕霉素、不同濃度的PP242和不同濃度的PQ401對果蠅壽命的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3μΜ雷帕霉素，(λ 3μΜ、1μΜ和3μΜ ΡΡ242，以及
3μ Μ、10 μ M和30 μ M PQ401均能顯著增加果蠅的成活百分比(如圖IC和E所示)和平均存活時間(如圖ID和F所示)。 實施例2ΡΡ242和PQ401對小鼠成纖維細胞GFP+百分數(shù)的影響本發(fā)明人根據(jù)上述方法檢測不同濃度的ΡΡ242和不同濃度的PQ401作用下用SKOM
轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的GFP+細胞百分數(shù)和GFP+集落數(shù)，以確定ΡΡ242和PQ401對SKOM成功轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細胞的影響。結(jié)果表明，與不用主題化合物處理的對照相比，0. 03nM、0. lnM、0. 3nM和InM PP242,以及0. 3nM、lnM、3nM和IOnM PQ401均能提高GFP+細胞百分數(shù)和GFP+集落數(shù)，即提高了 SKOM成功轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細胞，使其變?yōu)檎T導(dǎo)性多能干細胞的效率(如圖IA和B所示)。通過定量分析，可確定這些化合物能提高誘導(dǎo)性多能干細胞誘導(dǎo)效率達3倍之多。實施例3多種化合物對小鼠成纖維細胞GFP+百分數(shù)的影響本發(fā)明人還選取了雷帕霉素和文獻報道的在酵母、線蟲、果蠅、小鼠等模式生物上有壽命延長效果的化合物，包括白藜蘆醇、非瑟酮、亞精胺、LY294002、姜黃色素和二甲雙胍[14_18]，根據(jù)上述方法檢測在它們作用下用SKOM轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的GFP+細胞百分數(shù)。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，與僅用載體如水和DMSO處理的對照相比，除二甲雙胍外，這些化合物(3yM白藜蘆醇、3111非瑟酮、301^亞精胺、0.311|1 LY294002、10iiM姜黃色素)均能提高GFP+細胞百分數(shù)，即提高了 SKOM成功轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細胞，使其變?yōu)檎T導(dǎo)性多能干細胞的效率(如圖IG和H所示)。實施例4雷帕霉素對小鼠成纖維細胞GFP+百分數(shù)的影響 在實施例3的基礎(chǔ)上，本發(fā)明人進一步根據(jù)上述方法檢測雷帕霉素作用下用SKOM轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的GFP+細胞百分數(shù)和GFP+集落數(shù)。結(jié)果表明，與不用雷帕霉素處理的對照相比，不同濃度的雷帕霉素處理16天(如圖2A和B所示)，或用0. 3nM雷帕霉素處理不同時間(如圖2C所示)，能夠提高GFP+細胞百分數(shù)和/或GFP+集落數(shù)，即提高了 SKOM成功轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細胞，使其變?yōu)檎T導(dǎo)性多能干細胞的效率。通過定量分析，可確定雷帕霉素能提高誘導(dǎo)性多能干細胞誘導(dǎo)效率達4倍之多。這一分析結(jié)果與流式細胞儀分析結(jié)果相一致(如圖3所示)。通過前述誘導(dǎo)性多能干細胞的驗證方法觀察雷帕霉素處理對GFP+小鼠成纖維細胞的堿性磷酸酶(AP)、Nanog和SSEA-I表達的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素處理過程對這些誘導(dǎo)性多能干細胞標志物的表達無影響(如圖2D和F所示)。還通過前述逆轉(zhuǎn)錄實時定量PCR方法進一步在mRNA水平驗證GFP+小鼠成纖維細胞中0CT4、Sox 2和Nanog的相對表達水平。結(jié)果標明，雷帕霉素處理過程對誘導(dǎo)性多能干細胞標志物Nanog以及轉(zhuǎn)染基因0CT4和Sox2的表達無顯著影響(如圖2E所示)。還通過前述核型分析方法分析雷帕霉素處理后得到的GFP+小鼠成纖維細胞，發(fā)現(xiàn)這些細胞仍然是正常的誘導(dǎo)性多能干細胞(圖2G)。這樣經(jīng)雷帕霉素處理而誘導(dǎo)出的多能干細胞能在生理條件下發(fā)揮功能并成功分化形成嵌合體小鼠(如圖2H所示)。實施例5白藜蘆醇、非瑟酮、亞精胺、LY294002、姜黃色素和二甲雙胍對小鼠成纖維細胞GFP+百分數(shù)的影響。在實施例3的基礎(chǔ)上，本發(fā)明人進一步根據(jù)上述方法檢測在不同濃度的白藜蘆醇、非瑟酮、亞精胺、LY294002、姜黃色素和二甲雙胍作用下用SKOM轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的GFP+細胞百分數(shù)。結(jié)果進一步證實，除二甲雙胍外，這些化合物均能提高GFP+細胞百分數(shù)，即提高了SKOM成功轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細胞，使其變?yōu)檎T導(dǎo)性多能干細胞的效率(如圖4所示)。討論據(jù)分析，壽命延長化合物可能通過以下途徑促使體細胞重編程，進而誘導(dǎo)多能干細胞I)抗細胞衰老途徑在轉(zhuǎn)入逆病毒起始重編程會加速體細胞衰老、細胞凋亡過程，使很少的細胞進入到重編程的過程，進而產(chǎn)生誘導(dǎo)性多能干細胞。壽命延長化合物的主要機制就是延緩衰老，因而可以使更多的細胞進入重編程過程，從而提高誘導(dǎo)性多能干細胞產(chǎn)生效率。2)mT0R信號通路途徑mT0R信號途徑為感知環(huán)境中生長因子、氨基酸，抑制mTOR有很強的抗細胞衰老、能量限制作用[1°_13]，除此以外mTOR信號途徑下游TGFP信號途徑起作用，在重編程的過程中TGFii水平上升抑制體細胞重編程的發(fā)生，所以抑制mTOR可能通過TGFii信號途徑延長生物體壽命和提高重編程的效果。(3)抗氧化途徑維生素等抗氧化物能延長生物體壽命，并提高體細胞重編程效率就是通過抗氧化途徑起作用。 (4)增強DNA修復(fù)功能抑制mTOR可增加細胞修復(fù)基因組的作用，而在體細胞重編程過程中過表達轉(zhuǎn)錄因子增加基因組損傷而影響重編程效率。參考文獻[I]Yamanaka S. Cell Stem Cell,2007，11) :39-49 ；[2]Daley GQ, Lensch MW，Jaenisch R.等，Cell Stem Cell, 2009,4 (3) :200-1 ；[3] Yu J, Hu K, Smuga-Otto K.等，Science, 2009 ;[4]Kaji K, Norrby K，Paca A.等，Nature, 2009，458 (7239) :771-5 ；[5]ffoltjen K, Michael IP, Mohseni P.等，Nature，2009，458 (7239) :766-70 ；[6]Brambrink T,Foreman R,Welstead GG.等，Cell Stem Cell, 2008, 2) :151-9;[7]Fontana L, Partridge L, Longo VD (2010) · Science. 328,321-326 ;[8]Miguel Angel Esteban 等，Cell Stem Cell. 2010 年 I 月 8 日；61) :71_9 ；[9]David E. Harrison 等，Nature 460,392-395 ；[10]Powers Rff, Kaeberlein M, Caldwell SD, Kennedy BK, Fields S(2006 年 I月).Genes Dev.202) :174-84 ；[II]Kaeberlein M,Powers Rff,Steffen KK,Westman EA,Hu D,Dang N，Kerr E0,Kirkland KT, Fields S, Kennedy BK(2005 年 9 月)·Science 310(5751) :1193-6;[12]Jia K，Chen D, Riddle DL. (2004 年 8 月)· Development 131(16) :3897-906;[13]Kapahi P, Zid BM, Harper T, Koslover D, Sapin V, Benzer S(2004 年 5月)·Curr· Biol. 14(10) :885-9 ；[14]Howitz KT, Bitterman KJ, Cohen HY 等(2003 年 9 月).Nature 425(6954)191-6 ；[15]Lee KS, Lee BS, Semnani S.等，Rejuvenation Res. 20100ct ；13 (5) :561-70;[16]Tobias Eisenberg, Heide Knauer. Alexandra Schauer 等.NatureCellBiology 11,1305-1314(2009)；[17] A. A. Moskalev and Μ. V. Shaposhnikov. REJUVENATION RESEARCH 第 13 卷，第2-3 期，201 ；[18]Mouchiroud L, Molin L, Dalliere N, Solari F. Biofactors· 2010 年 9 月；36(5) :377-82 ；[19]Huangfu Dff, Maehr R, Guo WJ 等，Nat Biotechnol. 2008 ；26 :795_797。
權(quán)利要求
1.一種篩選提高誘導(dǎo)性多能干細胞產(chǎn)生效率的化合物的方法，所述方法包括 1)提供候選化合物； 2)用生物體從候選化合物中預(yù)篩選能延長生物體壽命的化合物；和 3)從上述步驟2)中篩選到的化合物中進一步篩選提高誘導(dǎo)性多能干細胞產(chǎn)生效率的化合物。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟2)包括 i)用所述候選化合物喂食或培育生物體； ii)觀察所述生物體的壽命變化；和 iii)選擇能延長生物體壽命的化合物。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述步驟3)包括 a)提供動物細胞； b)用誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)染所述動物細胞并與所述步驟2)中篩選出的化合物相接觸； c)檢測誘導(dǎo)性多能干細胞的數(shù)量；和 d)選擇能增加誘導(dǎo)性多能干細胞產(chǎn)生數(shù)量的化合物。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述生物體是細菌、酵母菌、線蟲、昆蟲、嚙齒動物或魚類。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述生物體是果蠅、酵母或魚。
6.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟ii)通過記錄生物體的存活時間、隨時間記錄生物體的死亡情況、檢測生物體的壽命相關(guān)生理指標或檢測生物體的壽命相關(guān)分子進行。
7.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟b)中所用的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子是Sox2、Klf4、0ct4和c_Myc中的一種或多種。
8.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟c)可通過染色法、報告基因法、蛋白質(zhì)定量測定法或mRNA定量測定法進行。
9.壽命延長化合物在提高誘導(dǎo)性多能干細胞產(chǎn)生效率中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述壽命延長化合物是mTOR抑制劑、抗氧化劑、DNA修復(fù)促進劑、雷帕霉素、PP242、PQ401、白藜蘆醇、非瑟酮、亞精胺、LY294002和姜黃色素等。
全文摘要
本發(fā)明涉及篩選提高誘導(dǎo)性多能干細胞產(chǎn)生效率的化合物的方法，具體是基于生物體壽命，特別是果蠅壽命篩選提高誘導(dǎo)性多能干細胞產(chǎn)生效率的化合物的方法。本發(fā)明還涉及壽命延長化合物，特別是果蠅壽命延長化合物，具體是雷帕霉素、PP242、PQ401、白藜蘆醇、非瑟酮、亞精胺、LY294002和姜黃色素在提高誘導(dǎo)性多能干細胞產(chǎn)生效率中的新用途。
文檔編號A01K67/033GK102758000SQ20111011035
公開日2012年10月31日 申請日期2011年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月29日
發(fā)明者萬洪江, 于潔, 沈立, 裴鋼, 趙簡, 陳濤濤 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院