專利名稱：慢性炎癥動物模型的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)療評價、檢測技術(shù)和實驗動物技術(shù)領(lǐng)域，特別地，涉及一種慢性炎癥的動物模型的建立方法。
背景技術(shù)：
炎癥是最重要的基本病理過程之一，各種炎癥性疾病在人類疾病譜中占據(jù)極為重要的地位。典型的炎癥性疾病，如慢性支氣管炎等，時至今日仍然是嚴重困擾極大數(shù)人群的常見疾病。不僅如此，近年來的研究表明，許多原本認為與炎癥無關(guān)或關(guān)系不大的疾病事實上也與炎癥密切相關(guān)。在與心血管疾病、糖尿病一樣對預期壽命構(gòu)成嚴重威脅的惡性腫瘤的發(fā)病機制中，炎癥也是一個普遍而重要的因素?；谂c上述研究發(fā)現(xiàn)相似的、仍在不斷增加的證據(jù)，抑制炎癥成為阻止許多疾病發(fā)生以及治療眾多炎癥性疾病的關(guān)鍵。直到今天，各類病原體感染仍然是炎癥性疾病最主要的原因之一。業(yè)已證實，G—菌外膜的脂多糖(LPQ是介導感染性炎癥損傷的最主要的病原分子之一，尤其是在G—菌感染隱然躍居各類感染性疾病首位的今日更是如此。由于腸道是人體最大的細菌和LPS庫，在嚴重創(chuàng)傷、燒傷、休克和主要臟器功能衰竭等病理情況下，腸粘膜屏障功能減弱，腸道內(nèi)的細菌和LPS可進入循環(huán)系統(tǒng)，因此，初始疾病為非感染性疾病的患者仍然可能面臨LPS導致的嚴重的炎癥損傷，如多器官功能障礙綜合征、敗血癥等就是如此。此外，傳統(tǒng)上認為與細菌感染關(guān)系并不密切的疾病(例如大部分心血管疾病)以及許多免疫性疾病，已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)與某些病原體的慢性感染導致的持續(xù)性亞臨床炎癥損傷密切相關(guān)，由此推測抗炎治療也能夠阻止/抑制這些疾病的發(fā)生、發(fā)展，然而目前已有的抗炎藥物在安全性與有效性方面不能滿足臨床需要，因而產(chǎn)生了開發(fā)適用于預防這類疾病的抗炎藥物的迫切需求。LPS的生物學活性非常復雜，由于菌種來源、培養(yǎng)和提純方法以及測試方法不同， 所報道的LPS活性指標也不一致，特別是在機體內(nèi)的表現(xiàn)形式更是錯綜復雜。將純化的LPS 注入易感動物體內(nèi)可引起多種生物學活性變化，其生物學活性的核心表現(xiàn)與LPS誘導的炎癥免疫效應(yīng)密切相關(guān)，其主要的炎癥免疫效應(yīng)有致熱、激活補體系統(tǒng)、促進凝血、激活白細胞、致微循環(huán)障礙和糖、脂肪代謝紊亂等。盡管已經(jīng)進行了多年研究，對LPS誘導的炎癥損傷的病理生理機制的認識也已經(jīng)深入至分子水平，然而迄今為止在臨床實踐中尚無安全、有效的特效應(yīng)對措施。對于更為多見的LPS誘導的慢性炎癥相關(guān)疾病，如慢性呼吸道感染等，目前并沒有實際可用的拮抗炎癥的藥物，在由此而導致的全身性炎癥損傷的長期作用下，局部的疾病最終對整個機體造成了廣泛的不利影響，全身炎癥反應(yīng)的存在也是其他常見的慢性疾病如慢性心力衰竭、肥胖、糖尿病甚至老齡化的重要原因。因此，臨床實踐迫切需要能夠安全、有效地拮抗全身性炎癥的藥物。鑒于慢性炎癥網(wǎng)絡(luò)的復雜性，如果僅僅干預某個與炎癥相關(guān)的通路，其效果也許不是最理想的，因此需要以慢性炎癥動物模型為平臺進行更為廣泛而深入的研究，努力尋找能夠提高治療效果的藥物作用機制與靶標。
由于LPS對機體具有確定的誘導炎癥免疫效應(yīng)，并且對其致炎效應(yīng)的主要機制已有較多了解，因而LPS已被更廣泛用于建立各種炎癥相關(guān)疾病的動物模型。在以LPS建立的各種炎癥模型中，LPS致急性肺損傷模型最為常見，多采用以LPS經(jīng)腹腔或血管注射的方式，幾乎均為單次注射且劑量通常較大(可達5mg/kg至10mg/kg)，造成嚴重的肺組織急性損傷，常因伴有多器官功能障礙、彌漫性血管內(nèi)凝血、休克等并發(fā)癥而導致動物死亡， 顯然不能成為研究慢性炎癥的動物模型方法。LPS致慢性炎癥的動物模型亦有報道，包括眼葡萄膜炎、中耳炎、慢性支氣管炎、支氣管哮喘等，采用的多是經(jīng)腹腔或血管注射、局部滴注、吸入，單次或多次干預的方式。事實上，上述劑量級別的LPS進入動物體內(nèi)并且彌散之后，引發(fā)的已經(jīng)不僅僅是局部的炎癥了，更多的是系統(tǒng)性的或者是全身性的炎癥了，至少可以確定在經(jīng)血管注射LPS后引起了慢性炎癥。因此，無論是從理論上而言還是參考已被實踐證實的先例，經(jīng)血管注射LPS建立慢性炎癥動物模型是可行的。在建模所用劑量降低至 0. 5mg/kg至;3mg/kg不等之后，LPS引發(fā)的炎癥反應(yīng)依然劇烈，隨著時間延長，動物死亡依然存在，影響了實驗研究的進行，對于只需輕中度慢性炎癥的實驗研究而言無疑是不利的。如欲避免動物死亡而減少實驗動物消耗、增強LPS相關(guān)慢性炎癥實驗研究的可控性，降低建模所用LPS的劑量、分次干預可能是可行的方法，但具體降低至多少且仍能獲得較為典型的慢性炎癥改變，則沒有先例可循。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)方案提供了一種嚙齒類動物慢性炎癥模型，它首次嘗試利用間斷靜脈注射LPS來誘導慢性炎癥大鼠模型。通過該方法制得的動物模型穩(wěn)定性好，更接近人類感染性炎癥損傷的變化，用于篩選治療慢性炎癥的藥物和評價治療全身性慢性炎癥有非常實用的價值。本發(fā)明的慢性炎癥動物模型的建立方法，包括以下步驟步驟一、動物準備健康雄性大鼠，SPF級；步驟二、藥物準備取大腸桿菌脂多糖，臨用前以無菌生理鹽水稀釋至所需濃度， 混勻；步驟三、制備動物模型取健康雄性大鼠，每周尾靜脈注射LPS 120 300 μ g/kg 體重，每次注射時間間隔約為1周，連續(xù)4 8周后即制得慢性炎癥動物模型。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方法來實現(xiàn)的1、建立慢性炎癥動物模型；2.炎癥因子檢測；3.病理評價。


圖1各組大鼠心臟常規(guī)HE染色病理組織鏡檢圖譜(X 100)圖2各組大鼠肝臟常規(guī)HE染色病理組織鏡檢圖譜(X 100)圖3各組大鼠肺臟常規(guī)HE染色病理組織鏡檢圖譜(X 100)圖4各組大鼠腎臟常規(guī)HE染色病理組織鏡檢圖譜(X 100)
具體實施例方式實施例1
1實驗動物和主要試劑SPF級健康雄性SD大鼠，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司(實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK (湘)2009-0004)，體重220 MOg。以普通大鼠飼料飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度 25士4°C，相對濕度60% 70%。大腸桿菌脂多糖(血清型055:B5，美國Sigma公司)；PBS(北京索萊寶科技有限公司)；戊巴比妥鈉(北京化學試劑公司)；瑞氏-吉姆薩復合染液(南京建成科技有限公司)；白細胞稀釋液(南京建成科技有限公司)；大鼠hs-CRP ELISA試劑盒(美國R&D公司)2實驗方法2. 1實驗動物分組與處理SD大鼠32只，以隨機數(shù)字表法分為4組，每組8只，分別命名為正常對照組、LPS 120 (LPS 120μ g/kg)組、LPS 160 (LPS 160 μ g/kg)組、LPS 200 (LPS 200yg/kg)組。接受LPS處理的各組大鼠在實驗開始后每周首日以該組預設(shè)的劑量經(jīng)尾靜脈注射LPS，連續(xù)4 周。正常組使用等體積(0.5ml/kg)無菌生理鹽水以同樣方法間斷尾靜脈注射4周。2. 2實驗動物標本采集實驗第4周末，各組大鼠腹腔注射2 %戊巴比妥鈉麻醉，下腔靜脈穿刺取血5ml。其中Iml用于外周血白細胞計數(shù)與分類，其余室溫靜置后于4°C、4000轉(zhuǎn)/分離心獲得血清，分裝凍存于-70°C供酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)隨后摘取心、 肝、肺、腎并置于10%中性甲醛溶液中固定供常規(guī)石蠟切片蘇木素-伊紅染色(HE染色)病理組織鏡檢。2. 3主要觀察指標與檢測方法2.3. 1大鼠存活情況在實驗持續(xù)期間，即從開始進行尾靜脈注射至實驗第4周末為止，觀察各組大鼠存活情況。2. 3. 2外周血白細胞計數(shù)與分類以微量移液器準確吸取外周全血20 μ 1，加白細胞稀釋液380 μ 1，充分混勻后充入細胞計數(shù)板計數(shù)池進行白細胞計數(shù)。另以微量移液器取外周全血20 μ 1，制作血涂片并以瑞氏-吉姆薩復合染液染色，而后進行血細胞分類。2. 3. 3 血清 hs-CRP 檢測采用大鼠hs-CRP ELISA試劑盒，嚴格按照試劑盒說明書操作，以Multiskan MK3 型酶標儀于450nm波長測定吸光度。以Expert Curve 1. 3. 8曲線擬合軟件計算標準曲線的回歸方程，計算樣品hs-CRP濃度。2. 3. 4組織病理學檢測各組大鼠心臟、肝臟、肺臟、腎臟標本常規(guī)石蠟包埋、切片、脫水，HE染色，光鏡下觀察各臟器在LPS處理后各臟器的病理組織形態(tài)變化。2. 4統(tǒng)計學分析所有計量資料均以均數(shù)士標準差(3c±5 )表示，以SPSS 13. O統(tǒng)計軟件進行多個樣本間均數(shù)比較。方差齊性數(shù)據(jù)采用單因素方差分析LSD檢驗，方差不齊數(shù)據(jù)采用Kruskal Wallis秩和檢驗。以P < 0. 05為差異具有統(tǒng)計學意義。
3實驗結(jié)果3.1大鼠存活情況在實驗持續(xù)期間，即從開始進行尾靜脈注射至實驗第4周末為止，各組大鼠全部存活。3. 2外周血白細胞計數(shù)與分類間斷尾靜脈注射小劑量LPS 4周后，LPS120組、LPS160組其外周血白細胞計數(shù)、中性粒細胞比例均高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.(^) ；LPS200組其外周血白細胞計數(shù)、中性粒細胞比例均高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義(P < 0. 01)。結(jié)果參見表1。表1各組大鼠外周血白細胞計數(shù)與分類比較(〒±。n = 8)
權(quán)利要求
1.低劑量的脂多糖在制備用于篩選治療慢性炎癥藥物的動物模型中的用途，其中脂多糖的使用方法和劑量為間斷靜脈給藥，每次劑量為120 300μ g/kg體重。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于脂多糖的使用劑量為每次120 300 μ g/kg 體重。
3.一種制備權(quán)利要求1所述的慢性炎癥動物模型的方法，其特征在于將嚙齒類動物給予脂多糖誘導慢性炎癥的產(chǎn)生，建立了動物慢性炎癥的疾病模型，其中脂多糖的使用方法和劑量為間斷靜脈給藥，每次劑量為120 300 μ g/kg體重。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的慢性炎癥動物模型的制備方法，其特征在于所述嚙齒類動物為大鼠。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的間斷靜脈給藥，其特征在于每周靜脈給藥1次，兩次給藥的時間間隔約為1周，連續(xù)4 8周。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的間斷靜脈給藥，其特征在于所述的脂多糖的使用劑量為每次120 300 μ g/kg體重，4 8次。
7.權(quán)利要求3 5任一項所述的方法制備得到慢性驗證動物模型。
8.權(quán)利要求7所述慢性炎癥動物模型在篩選治療慢性炎癥的藥物中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于所述的藥物是治療慢性炎癥包括慢性全身性炎癥綜合征的藥物。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)療評價、檢測技術(shù)和實驗動物學領(lǐng)域，具體涉及一種用于篩選治療慢性炎癥藥物、評價治療全身性慢性炎癥方法的大鼠動物模型的方法，步驟為取健康雄性SD大鼠，每周首日尾靜脈注射脂多糖，連續(xù)4～8周，劑量為120～300μg/kg體重，從而形成外周血白細胞計數(shù)與中性粒細胞比例及血清超敏C反應(yīng)蛋白水平升高，且心臟、肝臟、肺臟、腎臟組織以炎性細胞浸潤、組織瘀血水腫為主的病理變化，符合慢性炎癥病理特點。本發(fā)明重復性好，操作方法簡單、易控、機理明了，指標可定量分析，便于統(tǒng)計學處理，且建立的動物模型更理想、更符合該類疾病的臨床病理生理學變化。
文檔編號A01K67/02GK102188442SQ20111011039
公開日2011年9月21日 申請日期2011年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月29日
發(fā)明者馮旭, 包傳紅, 衛(wèi)智權(quán), 鄧家剛, 閻莉 申請人:廣西中醫(yī)學院