專利名稱：通過(guò)組織培養(yǎng)獲得黃花苜蓿再生植株的方法及其培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)組織培養(yǎng)獲得黃花苜蓿再生植株的方法及其培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
黃花苜蓿(Medicago falcata L.)是豆科苜蓿屬中很重要的多年生野生豆科牧 草，主要分布在中國(guó)、蒙古、俄羅斯、巴基斯坦、印度、土耳其等國(guó)家。我國(guó)的黃花苜蓿品種資 源豐富，主要分布在我國(guó)的東北、華北、西北地區(qū)。與其它種比較，黃花苜蓿具有抗逆性強(qiáng)、 耐寒、耐旱、耐瘠薄和壽命長(zhǎng)等突出特點(diǎn)，適宜在干旱、寒冷的地區(qū)種植，是我國(guó)北方建設(shè)高 產(chǎn)優(yōu)質(zhì)人工草地的首選。黃花苜蓿的倍型多見二倍體Qn = 2x = 16)和四倍體Qn = 4x = 32) 2個(gè)染色 體倍性水平。一般來(lái)說(shuō)，四倍體和二倍體相比，具有植株高大，生長(zhǎng)繁茂，葉片增大等特征。 倍性影響著植物內(nèi)部基因的表達(dá)和調(diào)控，進(jìn)而影響到植物的形態(tài)和功能。多年以來(lái)黃花苜蓿的組培十分困難，導(dǎo)致黃花苜蓿的分子生物學(xué)和遺傳學(xué)改良工 作停滯不前。生物育種的關(guān)鍵是建立一個(gè)高效的組織培養(yǎng)再生體系，以提供改良目標(biāo)的基 因受體系統(tǒng)和遺傳轉(zhuǎn)化后受體細(xì)胞的培養(yǎng)系統(tǒng)。黃花苜蓿的組培開始研究較早，1985年Daniel Brown和Atanas Atanassov年試 驗(yàn)了 67種苜蓿的子葉和下胚軸，用三步法做組織培養(yǎng)，選出一些具有高再生能力的品種。 Tony H. H. Chen于1987年試驗(yàn)了 17種黃花苜蓿，說(shuō)明葉片也和子葉下胚軸一樣有能力形成 愈傷組織。Gilmour于1987年用黃花苜蓿的原生質(zhì)體培養(yǎng)進(jìn)行了組培再生體系。國(guó)內(nèi)馬海 燕于2005年用新疆野生黃花苜蓿的下胚軸進(jìn)行培養(yǎng)，但是分化率較低00-30% )。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種獲得黃花苜蓿愈傷組織的培養(yǎng)基。本發(fā)明所提供的獲得黃花苜蓿愈傷組織的培養(yǎng)基，由下述質(zhì)量份的營(yíng)養(yǎng)成分組 成大量元素以硝酸鉀計(jì)觀30份、微量元素以硫酸錳計(jì)1份、鐵鹽以乙二胺四乙酸鈉 計(jì)6. 97份、有機(jī)成分以尼克酸計(jì)10份、肌醇100份、2，4- 二氯苯氧乙酸1份_2份或1份或 2份、N6-呋喃甲基腺嘌呤1份-2份或1份或2份；所述大量元素由下述質(zhì)量份的物質(zhì)組成硝酸鉀觀30份、硫酸銨463份、磷酸二氫鉀400份、七水硫酸鎂185份和二水氯化 鈣166份；所述微量元素由下述質(zhì)量份的物質(zhì)組成硫酸錳1份、硼酸0. 5份、七水硫酸鋅0. 1份、碘化鉀0. 1份、二水鉬酸鈉0. 01份、 五水硫酸銅0. 02份和六水氯化鈷0. 01份；所述鐵鹽由下述質(zhì)量份的物質(zhì)組成乙二胺四乙酸鈉6. 97份；
所述有機(jī)成分由下述質(zhì)量份的物質(zhì)組成尼克酸10份、鹽酸硫胺素10份和鹽酸吡哆醇10份。所述培養(yǎng)基由所述營(yíng)養(yǎng)成分和水組成；所述營(yíng)養(yǎng)成分中所述大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)成分、肌醇、2，4_ 二氯苯氧乙 酸和N6-呋喃甲基腺嘌呤均獨(dú)立包裝。所述培養(yǎng)基由以下成分組成硝酸鉀、硫酸銨、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、二水氯化鈣、硫酸錳、硼酸、七水硫酸 鋅、碘化鉀、二水鉬酸鈉、五水硫酸銅、六水氯化鈷、乙二胺四乙酸鈉、尼克酸、鹽酸硫胺素、 鹽酸吡哆醇、肌醇、2，4- 二氯苯氧乙酸和N6-呋喃甲基腺嘌呤和水；以上成分在所述培養(yǎng)基中濃度分別為硝酸鉀2. 830g/L、硫酸銨0. 463g/L、磷酸二氫鉀0. 400g/L、七水硫酸鎂0. 185g/ L、二水氯化鈣0. 166g/L、硫酸錳lmg/L、硼酸0. 5mg/L、七水硫酸鋅0. lmg/L、碘化鉀0. Img/ L、二水鉬酸鈉0. 01mg/L、五水硫酸銅0. Oang/L、六水氯化鈷0. 0lmg/L,乙二胺四乙酸鈉 6. 97mg/L、尼克酸10mg/L、鹽酸硫胺素10mg/L、鹽酸吡哆醇10mg/L、肌醇100mg/L、2，4-二氯 苯氧乙酸lmg/L-ang/L和N6-呋喃甲基腺嘌呤lmg/L-ang/L，其余為水。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種獲得黃花苜蓿愈傷組織的固體培養(yǎng)基，由凝固劑 和上述獲得黃花苜蓿愈傷組織的培養(yǎng)基配成固體培養(yǎng)基。所述凝固劑的用量使上述獲得黃花苜蓿愈傷組織的培養(yǎng)基形成固體即可；所述凝固劑在所述固體培養(yǎng)基中的濃度為8g/L ；所述凝固劑為瓊脂。所述固體培養(yǎng)基為如下1)或2)所示1)所述固體培養(yǎng)基中2，4-二氯苯氧乙酸的濃度為2mg/L和N6-呋喃甲基腺嘌呤 的濃度為lmg/L ；2)所述固體培養(yǎng)基中2，4-二氯苯氧乙酸的濃度為lmg/L和N6-呋喃甲基腺嘌呤 的濃度為ang/L。所述培養(yǎng)基的PH值為5. 8 ； 所述黃花苜蓿為四倍體黃花苜蓿或二倍體黃花苜蓿。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種獲得黃花苜蓿愈傷組織的方法。本發(fā)明所提供的獲得黃花苜蓿愈傷組織的方法，包括如下步驟用上述1)所示的 培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)黃花苜蓿外植體，得到黃花苜蓿愈傷組織。所述方法還包括用上述2~)所示的培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)黃花苜蓿愈傷組織的步驟；所述黃花苜蓿外植體為切成塊的幼嫩葉片；所述黃花苜蓿為四倍體黃花苜?；蚨扼w黃花苜蓿。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種獲得黃花苜蓿再生植株的方法。本發(fā)明所提供的獲得黃花苜蓿再生植株的方法，包括以下步驟將上述方法得到的 黃花苜蓿愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)得到芽，即得到黃花苜蓿再生植株。所述分化培養(yǎng)基由以下成分組成硝酸鉀、硫酸銨、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、二水氯化鈣、硫酸錳、硼酸、七水硫酸 鋅、碘化鉀、二水鉬酸鈉、五水硫酸銅、六水氯化鈷、乙二胺四乙酸鈉、尼克酸、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、肌醇、N6-呋喃甲基腺嘌呤和水；以上成分在所述分化培養(yǎng)基中濃度分別為硝酸鉀2. 830g/L、硫酸銨0. 463g/L、磷酸二氫鉀0. 400g/L、七水硫酸鎂0. 185g/ L、二水氯化鈣0. 166g/L、硫酸錳lmg/L、硼酸0. 5mg/L、七水硫酸鋅0. lmg/L、碘化鉀0. Img/ L、二水鉬酸鈉0. 01mg/L、五水硫酸銅0. Oang/L、六水氯化鈷0. 0lmg/L,乙二胺四乙酸鈉 6. 97mg/L、尼克酸10mg/L、鹽酸硫胺素10mg/L、鹽酸吡哆醇10mg/L、肌醇100mg/L和N6-呋 喃甲基腺嘌呤0. %ig/L，其余為水。所述分化培養(yǎng)基的pH值為5. 8 ；所述方法在所述分化培養(yǎng)之后，還包括將得到的芽接種到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng) 的步驟；所述生根培養(yǎng)基由以下成分組成硝酸鉀、硫酸銨、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、二水氯化鈣、硫酸錳、硼酸、七水硫酸 鋅、碘化鉀、二水鉬酸鈉、五水硫酸銅、六水氯化鈷、乙二胺四乙酸鈉、尼克酸、鹽酸硫胺素、 鹽酸吡哆醇和水；以上成分在所述生根培養(yǎng)基中濃度分別為硝酸鉀1. 415g/L、硫酸銨0. 2315g/L、磷酸二氫鉀0. 200g/L、七水硫酸鎂0. 0925g/ L、二水氯化鈣0. 083g/L、硫酸錳lmg/L、硼酸0. 5mg/L、七水硫酸鋅0. lmg/L、碘化鉀0. Img/ L、二水鉬酸鈉0. 01mg/L、五水硫酸銅0. 0ang/L、六水氯化鈷0. 0lmg/L,乙二胺四乙酸鈉 6. 97mg/L、尼克酸10mg/L、鹽酸硫胺素10mg/L、鹽酸吡哆醇10mg/L，其余為水。所述生根培養(yǎng)基的pH值為5. 8 ；所述黃花苜蓿外植體為切成塊的幼嫩葉片； 所述黃花苜蓿為四倍體黃花苜蓿或二倍體黃花苜蓿。本發(fā)明是從一批來(lái)自于新疆的四倍體黃花苜蓿和來(lái)自于俄羅斯的二倍體黃花苜 蓿中進(jìn)行組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，從中篩選出最高效的組培品種，以及建立起一套高效的再生體系， 愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到90%以上，分化率達(dá)到60% -70%，成苗率達(dá)到40% -50%，完成全部 再生體系僅需10周左右，隨后可以利用轉(zhuǎn)基因等生物技術(shù)高效、快速地對(duì)作物品種和性狀 進(jìn)行遺傳改良。由于我國(guó)的黃花苜蓿主要生長(zhǎng)在內(nèi)蒙古和新疆，這些地方比較干旱寒冷，對(duì) 黃花苜蓿進(jìn)行抗寒抗旱的改良十分必要，本發(fā)明為黃花苜蓿育種提供了一種方便、快捷和 有效的方法，具有一定的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益，對(duì)我國(guó)草業(yè)的可持續(xù)發(fā)展有一定的貢獻(xiàn)。


圖1為愈傷組織在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀態(tài)。圖2為愈傷組織在增殖培養(yǎng)基中形成體細(xì)胞胚并有芽生成。圖3為愈傷組織在分化培養(yǎng)基上再生芽繼續(xù)生長(zhǎng)并有根生成。圖4為在生根培養(yǎng)基中，胚性愈傷組織長(zhǎng)成再生苗。圖5為黃花苜蓿再生苗移到花盆中生長(zhǎng)。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。無(wú)機(jī)鹽購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司和北京化學(xué)試劑公司；2，4_ 二氯苯氧乙 酸0，4-D)、N6-呋喃甲基腺嘌呤(KT)和維生素購(gòu)自SIGMA公司；肌醇購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試 劑有限公司；蔴糖購(gòu)自北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司，瓊脂購(gòu)自北京振泰科技創(chuàng)新發(fā) 展中心。實(shí)施例1、通過(guò)組織培養(yǎng)獲得四倍體黃花苜蓿再生植株本實(shí)驗(yàn)新疆四倍體野生黃花苜蓿(公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得，記載過(guò)該材料的 非專利文獻(xiàn)是王紅梅，王俊杰等，二倍體和四倍體野生黃花苜蓿形態(tài)特征比較研究，草地 學(xué)報(bào)，Vol. 17 No. 4，Jul 2009)為材料，采自新疆伊犁地區(qū)。實(shí)驗(yàn)步驟如下1、種子處理和無(wú)菌苗的培育選取籽粒飽滿的新疆野生黃花苜蓿種子80粒，用濃硫酸處理8分鐘左右，待種皮 上有黑點(diǎn)出現(xiàn)，吸出濃硫酸用無(wú)菌水洗5遍。然后在超凈臺(tái)中用5%次氯酸鈉水溶液中浸泡 15分鐘，再用無(wú)菌水洗5遍；然后將其接種于在1/2 MS培養(yǎng)基上(超凈臺(tái)內(nèi)操作)。置于 組培室中，培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度是室溫(25°C)；光周期是光照16小時(shí)/黑暗8小時(shí)，光照 強(qiáng)度為5000Lux。2、外植體的選擇選取3周左右的黃花苜蓿無(wú)菌苗的幼嫩葉片作為外植體。3、愈傷組織的誘導(dǎo)和保持在超凈臺(tái)中，將作為外植體的黃花苜蓿無(wú)菌苗的幼嫩葉片用滅過(guò)菌的刀片切成約 3mm2的小塊，接種到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。約兩周愈傷生成(圖1)，將愈傷組織轉(zhuǎn) 接到愈傷增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基和愈傷增殖培養(yǎng)基都在滅菌前將PH調(diào) 到5. 8，滅菌條件是121°C下20分鐘。培養(yǎng)條件和步驟1相同。實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果取平均值，每個(gè)重復(fù)設(shè)50個(gè)外植體。愈傷組織誘導(dǎo)率(％ )=實(shí)際形成愈傷組織數(shù)/接種外植體數(shù)X 100%。結(jié)果愈傷組織誘導(dǎo)率為90. 7%。愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基由以下成分組成硝酸鉀、硫酸銨、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、二水氯化鈣、硫酸錳、硼酸、七水硫酸 鋅、碘化鉀、二水鉬酸鈉、五水硫酸銅、六水氯化鈷、乙二胺四乙酸鈉、尼克酸、鹽酸硫胺素、 鹽酸吡哆醇、肌醇、2，4- 二氯苯氧乙酸和N6-呋喃甲基腺嘌呤和水；以上成分在所述愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中濃度分別為硝酸鉀2. 830g/L、硫酸銨0. 463g/L、磷酸二氫鉀0. 400g/L、七水硫酸鎂0. 185g/ L、二水氯化鈣0. 166g/L、硫酸錳lmg/L、硼酸0. 5mg/L、七水硫酸鋅0. lmg/L、碘化鉀0. Img/ L、二水鉬酸鈉0. 01mg/L、五水硫酸銅0. Oang/L、六水氯化鈷0. 01mg/L、乙二胺四乙酸鈉 6. 97mg/L、尼克酸10mg/L、鹽酸硫胺素10mg/L、鹽酸吡哆醇10mg/L、肌醇100mg/L、2，4-二氯 苯氧乙酸2mg/L和N6-呋喃甲基腺嘌呤lmg/L，其余為水。愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH值為5. 8。愈傷增殖培養(yǎng)基由以下成分組成硝酸鉀、硫酸銨、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、二水氯化鈣、硫酸錳、硼酸、七水硫酸鋅、碘化鉀、二水鉬酸鈉、五水硫酸銅、六水氯化鈷、乙二胺四乙酸鈉、尼克酸、鹽酸硫胺素、 鹽酸吡哆醇、肌醇、2，4- 二氯苯氧乙酸和N6-呋喃甲基腺嘌呤和水；以上成分在所述愈傷增殖培養(yǎng)基中濃度分別為硝酸鉀2. 830g/L、硫酸銨0. 463g/L、磷酸二氫鉀0. 400g/L、七水硫酸鎂0. 185g/ L、二水氯化鈣0. 166g/L、硫酸錳lmg/L、硼酸0. 5mg/L、七水硫酸鋅0. lmg/L、碘化鉀0. Img/ L、二水鉬酸鈉0. 01mg/L、五水硫酸銅0. Oang/L、六水氯化鈷0. 0lmg/L,乙二胺四乙酸鈉 6. 97mg/L、尼克酸10mg/L、鹽酸硫胺素10mg/L、鹽酸吡哆醇10mg/L、肌醇100mg/L、2，4-二氯 苯氧乙酸lmg/L和N6-呋喃甲基腺嘌呤ang/L，其余為水。愈傷增殖培養(yǎng)基的pH值為5. 8。4、體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)和分化經(jīng)過(guò)一次繼代培養(yǎng)，再經(jīng)過(guò)3周的生長(zhǎng)，有些愈傷出現(xiàn)胚性愈傷(圖幻；將出現(xiàn)胚 性愈傷的愈傷組織分成3mm2的小塊，轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)，培養(yǎng)條件與上述步驟1 相同；約20天后，體細(xì)胞胚分化出芽和根(圖3)。實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果取平均值，每個(gè)重復(fù)設(shè)30個(gè)胚性愈傷。愈傷組織分化率(％ )=分化成芽的愈傷組織/接種愈傷組織數(shù)X 100%。結(jié)果愈傷組織分化率為68. 9 %。分化培養(yǎng)基由以下成分組成硝酸鉀、硫酸銨、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、二水氯化鈣、硫酸錳、硼酸、七水硫酸 鋅、碘化鉀、二水鉬酸鈉、五水硫酸銅、六水氯化鈷、乙二胺四乙酸鈉、尼克酸、鹽酸硫胺素、 鹽酸吡哆醇、肌醇、N6-呋喃甲基腺嘌呤和水；以上成分在所述分化培養(yǎng)基中濃度分別為硝酸鉀2. 830g/L、硫酸銨0. 463g/L、磷酸二氫鉀0. 400g/L、七水硫酸鎂0. 185g/ L、二水氯化鈣0. 166g/L、硫酸錳lmg/L、硼酸0. 5mg/L、七水硫酸鋅0. lmg/L、碘化鉀0. Img/ L、二水鉬酸鈉0. 01mg/L、五水硫酸銅0. 0ang/L、六水氯化鈷0. 0lmg/L,乙二胺四乙酸鈉 6. 97mg/L、尼克酸10mg/L、鹽酸硫胺素10mg/L、鹽酸吡哆醇10mg/L、肌醇100mg/L和N6-呋 喃甲基腺嘌呤0. %ig/L，其余為水；所述分化培養(yǎng)基的pH值為5. 8。5、再生芽的生根和移栽黃花苜蓿再生芽在分化的同時(shí)一般都有根的形成。當(dāng)根長(zhǎng)到約Icm時(shí)將其轉(zhuǎn)到 生根培養(yǎng)基(即1/2 SH培養(yǎng)基)上培養(yǎng)到根長(zhǎng)到約5cm，此時(shí)可進(jìn)行再生苗(圖4)的移 栽。再生苗移栽的方法為將蒸餾水加到剛沒(méi)過(guò)培養(yǎng)基，封口膜半開口置于組培室條件(即 培養(yǎng)溫度是室溫(25°C )；光周期是光照16小時(shí)/黑暗8小時(shí)；培養(yǎng)物表面的光照強(qiáng)度為 5000LUX) 3天，然后全開封口膜放置3天，再小心地在水龍頭下將培養(yǎng)基沖洗干凈，然后將 再生苗移栽到花盆中在同樣條件下培養(yǎng)(圖5)，完成整個(gè)黃花苜蓿再生的過(guò)程。實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果取平均值，每個(gè)重復(fù)設(shè)50個(gè)再生芽。成苗率(％ )=長(zhǎng)成再生苗的芽/接種的再生芽數(shù)X 100%。結(jié)果成苗率為46.7%。所述生根培養(yǎng)基由以下成分組成硝酸鉀、硫酸銨、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、二水氯化鈣、硫酸錳、硼酸、七水硫酸
8鋅、碘化鉀、二水鉬酸鈉、五水硫酸銅、六水氯化鈷、乙二胺四乙酸鈉、尼克酸、鹽酸硫胺素、 鹽酸吡哆醇；以上成分在所述生根培養(yǎng)基中濃度分別為硝酸鉀1. 415g/L、硫酸銨0. 2315g/L、磷酸二氫鉀0. 200g/L、七水硫酸鎂0. 0925g/ L、二水氯化鈣0. 083g/L、硫酸錳lmg/L、硼酸0. 5mg/L、七水硫酸鋅0. lmg/L、碘化鉀0. Img/ L、二水鉬酸鈉0. 01mg/L、五水硫酸銅0. Oang/L、六水氯化鈷0. 0lmg/L,乙二胺四乙酸鈉 6. 97mg/L、尼克酸10mg/L、鹽酸硫胺素10mg/L、鹽酸吡哆醇10mg/L，其余為水。所述生根培養(yǎng)基的pH值為5. 8。實(shí)施例2、通過(guò)組織培養(yǎng)獲得二倍體俄羅斯黃花苜蓿再生植株二倍體俄羅斯黃花苜蓿PI50M49來(lái)源于美國(guó)USDA-ARS Plant GermplasmQuarantine Center。1、種子處理和無(wú)菌苗的培育選取籽粒飽滿的俄羅斯黃花苜蓿PI50M49種子80粒，用濃硫酸處理8分鐘左右， 待種皮上有黑點(diǎn)出現(xiàn)，吸出濃硫酸用無(wú)菌水洗5遍。然后在超凈臺(tái)中用5%次氯酸鈉水溶液 中浸泡15分鐘，再用無(wú)菌水洗5遍；然后將其接種于在1/2 MS培養(yǎng)基上(超凈臺(tái)內(nèi)操作)。 置于組培室中，培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度是室溫(25°C)；光周期是光照16小時(shí)/黑暗8小時(shí)， 光照強(qiáng)度為5000LUX。2、外植體的選擇選取3周左右的黃花苜蓿無(wú)菌苗的幼嫩葉片作為外植體。3、愈傷組織的誘導(dǎo)和保持在超凈臺(tái)中，將作為外植體的黃花苜蓿無(wú)菌苗的幼嫩葉片用滅過(guò)菌的刀片切成約 3mm2的小塊，接種到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。約兩周愈傷生成，將愈傷組織轉(zhuǎn)接到愈傷 增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基和愈傷增殖培養(yǎng)基都在滅菌前將PH調(diào)到5. 8，滅 菌條件是121°C下20分鐘。培養(yǎng)條件和步驟1相同。實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果取平均值，每個(gè)重復(fù)設(shè)50個(gè)外植體。愈傷組織誘導(dǎo)率(％ )=實(shí)際形成愈傷組織數(shù)/接種外植體數(shù)X 100%。結(jié)果愈傷組織誘導(dǎo)率為89.3%。愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組成及各成分的濃度與實(shí)施例1中相同；愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基的PH 值與實(shí)施例1中相同。愈傷增殖培養(yǎng)基的組成及各成分的濃度與實(shí)施例1中相同；愈傷增殖培養(yǎng)基的PH 值與實(shí)施例1中相同。4、體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)和分化經(jīng)過(guò)一次繼代培養(yǎng)，再經(jīng)過(guò)3周的生長(zhǎng)，有些愈傷出現(xiàn)胚性愈傷；將出現(xiàn)胚性愈傷 的愈傷組織分成3mm2的小塊，轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)，培養(yǎng)條件與上述步驟2相同； 約20天后，體細(xì)胞胚分化出芽和根。實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果取平均值，每個(gè)重復(fù)設(shè)50個(gè)胚性愈傷。愈傷組織分化率(％ )=分化成芽的愈傷組織/接種愈傷組織數(shù)X 100%。結(jié)果愈傷組織分化率為37.8%。分化培養(yǎng)基的組成及各成分的濃度與實(shí)施例1中相同；分化培養(yǎng)基的PH值與實(shí)施例1中相同。5、再生芽的生根和移栽黃花苜蓿再生芽在分化的同時(shí)一般都有根的形成。當(dāng)根長(zhǎng)到約Icm時(shí)將其轉(zhuǎn)到生 根培養(yǎng)基(即1/2 SH培養(yǎng)基)上培養(yǎng)到根長(zhǎng)到約5cm，此時(shí)可進(jìn)行再生苗的移栽。再生苗 移栽的方法為與實(shí)施例1中相同。實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果取平均值，每個(gè)重復(fù)設(shè)30個(gè)再生芽。成苗率(％)=長(zhǎng)成再生苗的芽/接種的再生芽數(shù)X 100%。結(jié)果成苗率為21. 1%。生根培養(yǎng)基的組成及各成分的濃度與實(shí)施例1中相同；生根培養(yǎng)基的PH值與實(shí)施 例1中相同。
權(quán)利要求
1.一種獲得黃花苜蓿愈傷組織的培養(yǎng)基，由下述質(zhì)量份的營(yíng)養(yǎng)成分組成大量元素以硝酸鉀計(jì)觀30份、微量元素以硫酸錳計(jì)1份、鐵鹽以乙二胺四乙酸鈉計(jì) 6. 97份、有機(jī)成分以尼克酸計(jì)10份、肌醇100份、2，4_ 二氯苯氧乙酸1份_2份或1份或2 份、N6-呋喃甲基腺嘌呤1份-2份或1份或2份； 所述大量元素由下述質(zhì)量份的物質(zhì)組成硝酸鉀觀30份、硫酸銨463份、磷酸二氫鉀400份、七水硫酸鎂185份和二水氯化鈣 166 份；所述微量元素由下述質(zhì)量份的物質(zhì)組成硫酸錳1份、硼酸0. 5份、七水硫酸鋅0. 1份、碘化鉀0. 1份、二水鉬酸鈉0. 01份、五水 硫酸銅0. 02份和六水氯化鈷0. 01份； 所述鐵鹽由下述質(zhì)量份的物質(zhì)組成 乙二胺四乙酸鈉6. 97份； 所述有機(jī)成分由下述質(zhì)量份的物質(zhì)組成 尼克酸10份、鹽酸硫胺素10份和鹽酸吡哆醇10份。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于 所述培養(yǎng)基由以下成分組成硝酸鉀、硫酸銨、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、二水氯化鈣、硫酸錳、硼酸、七水硫酸鋅、碘 化鉀、二水鉬酸鈉、五水硫酸銅、六水氯化鈷、乙二胺四乙酸鈉、尼克酸、鹽酸硫胺素、鹽酸吡 哆醇、肌醇、2，4- 二氯苯氧乙酸和N6-呋喃甲基腺嘌呤和水； 以上成分在所述培養(yǎng)基中濃度分別為硝酸鉀2. 830g/L、硫酸銨0. 463g/L、磷酸二氫鉀0. 400g/L、七水硫酸鎂0. 185g/L、二水 氯化鈣0. 166g/L、硫酸錳lmg/L、硼酸0. 5mg/L、七水硫酸鋅0. lmg/L、碘化鉀0. lmg/L、二水 鉬酸鈉0. 0lmg/L、五水硫酸銅0. Oang/L、六水氯化鈷0. 0lmg/L、乙二胺四乙酸鈉6. 97mg/L、 尼克酸10mg/L、鹽酸硫胺素10mg/L、鹽酸吡哆醇10mg/L、肌醇100mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸 lmg/L-2mg/L 和 N6-呋喃甲基腺嘌呤 lmg/L-ang/L。
3.一種獲得黃花苜蓿愈傷組織的固體培養(yǎng)基，由凝固劑和權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng) 基配成固體培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的固體培養(yǎng)基，其特征在于 所述凝固劑在所述固體培養(yǎng)基中的濃度為8g/L ； 所述凝固劑為瓊脂。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的固體培養(yǎng)基，其特征在于所述固體培養(yǎng)基為如下1)或 2)所示1)所述固體培養(yǎng)基中2，4-二氯苯氧乙酸的濃度為ang/L和N6-呋喃甲基腺嘌呤的濃 度為lmg/L ；2)所述固體培養(yǎng)基中2，4-二氯苯氧乙酸的濃度為lmg/L和N6-呋喃甲基腺嘌呤的濃 度為ang/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的培養(yǎng)基，其特征在于 所述培養(yǎng)基的PH值為5.8;所述黃花苜蓿為四倍體黃花苜?；蚨扼w黃花苜蓿。
7.一種獲得黃花苜蓿愈傷組織的方法，包括如下步驟用權(quán)利要求5中1)所示的培養(yǎng) 基誘導(dǎo)培養(yǎng)黃花苜蓿外植體，得到黃花苜蓿愈傷組織。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述方法還包括用權(quán)利要求5中i)所示的培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)黃花苜蓿愈傷組織的步驟；所述黃花苜蓿外植體為切成塊的幼嫩葉片； 所述黃花苜蓿為四倍體黃花苜?；蚨扼w黃花苜蓿。
9.一種獲得黃花苜蓿再生植株的方法，包括以下步驟將權(quán)利要求7或8中所述的方 法得到的黃花苜蓿愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)得到芽，即得到黃花苜蓿再 生植株。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于 所述分化培養(yǎng)基由以下成分組成硝酸鉀、硫酸銨、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、二水氯化鈣、硫酸錳、硼酸、七水硫酸鋅、碘 化鉀、二水鉬酸鈉、五水硫酸銅、六水氯化鈷、乙二胺四乙酸鈉、尼克酸、鹽酸硫胺素、鹽酸吡 哆醇、肌醇、N6-呋喃甲基腺嘌呤和水；以上成分在所述分化培養(yǎng)基中濃度分別為硝酸鉀2. 830g/L、硫酸銨0. 463g/L、磷酸二氫鉀0. 400g/L、七水硫酸鎂0. 185g/L、二水 氯化鈣0. 166g/L、硫酸錳lmg/L、硼酸0. 5mg/L、七水硫酸鋅0. lmg/L、碘化鉀0. lmg/L、二水 鉬酸鈉0. 0lmg/L、五水硫酸銅0. Oang/L、六水氯化鈷0. 0lmg/L、乙二胺四乙酸鈉6. 97mg/L、 尼克酸10mg/L、鹽酸硫胺素10mg/L、鹽酸吡哆醇10mg/L、肌醇100mg/L和N6-呋喃甲基腺嘌 呤 0. 4mg/L ；所述分化培養(yǎng)基的PH值為5.8;所述方法在所述分化培養(yǎng)之后，還包括將得到的芽接種到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)的步驟；所述生根培養(yǎng)基由以下成分組成硝酸鉀、硫酸銨、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、二水氯化鈣、硫酸錳、硼酸、七水硫酸鋅、碘 化鉀、二水鉬酸鈉、五水硫酸銅、六水氯化鈷、乙二胺四乙酸鈉、尼克酸、鹽酸硫胺素、鹽酸吡 哆醇和水；以上成分在所述生根培養(yǎng)基中濃度分別為硝酸鉀1. 415g/L、硫酸銨0. 2315g/L、磷酸二氫鉀0. 200g/L、七水硫酸鎂0. 0925g/L、二 水氯化鈣0. 083g/L、硫酸錳lmg/L、硼酸0. 5mg/L、七水硫酸鋅0. lmg/L、碘化鉀0. lmg/L、二 水鉬酸鈉0. 0lmg/L、五水硫酸銅0. 0ang/L、六水氯化鈷0. 0lmg/L、乙二胺四乙酸鈉6. 97mg/ L、尼克酸10mg/L、鹽酸硫胺素10mg/L、鹽酸吡哆醇10mg/L ； 所述生根培養(yǎng)基的PH值為5.8; 所述黃花苜蓿外植體為切成塊的幼嫩葉片； 所述黃花苜蓿為四倍體黃花苜蓿或二倍體黃花苜蓿。
全文摘要
本發(fā)明公開了通過(guò)組織培養(yǎng)獲得黃花苜蓿再生植株的方法及其培養(yǎng)基。本發(fā)明所提供的獲得黃花苜蓿愈傷組織的培養(yǎng)基，由下述質(zhì)量份的營(yíng)養(yǎng)成分組成大量元素以硝酸鉀計(jì)2830份、微量元素以硫酸錳計(jì)1份、鐵鹽以乙二胺四乙酸鈉計(jì)6.97份、有機(jī)成分以尼克酸計(jì)10份、肌醇100份、2，4-二氯苯氧乙酸1份-2份、N6-呋喃甲基腺嘌呤1份-2份。本發(fā)明為黃花苜蓿育種提供了一種方便、快捷和有效的方法，具有一定的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益，對(duì)我國(guó)草業(yè)的可持續(xù)發(fā)展有一定的貢獻(xiàn)。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102138533SQ20111011541
公開日2011年8月3日 申請(qǐng)日期2011年5月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月5日
發(fā)明者仝宗永, 王濤, 董江麗, 靳永勝 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)