專利名稱：一種以沼液為基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)生物有機(jī)肥的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以沼液作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)生物有機(jī)肥的方法，尤其是一種以枯草芽孢桿菌OfeCiBm SUbtiHs)作為功能微生物，既能控制加工番茄和棉花為主的經(jīng)濟(jì)作物的土傳病害，又能促進(jìn)加工番茄和棉花生長(zhǎng)的生物有機(jī)肥的生產(chǎn)方法，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
新疆是我國(guó)最大的產(chǎn)棉區(qū)和優(yōu)質(zhì)商品棉的生產(chǎn)基地，但是進(jìn)入90年代后，新疆棉花播種面積的比例過高，連作時(shí)間長(zhǎng)。棉花在連作5-10年后，造成棉鈴蟲，棉花枯、黃萎病等病蟲害的大面積爆發(fā)，連作障礙較明顯。新疆種植的加工番茄因茄紅素、谷維素、固形物含量高，霉菌少，黏度好，是生產(chǎn)加工番茄制品的上等原料，因而番茄產(chǎn)品在國(guó)際市場(chǎng)上非常有競(jìng)爭(zhēng)力，新疆已成為我國(guó)最主要的加工番茄種植和加工基地。然而，隨著加工番茄和棉花種植面積不斷擴(kuò)大，土傳病害也越來越嚴(yán)重，造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大，如2006-2008年連續(xù) 3年由于春季低溫多雨使得棉苗爛根病大發(fā)生，造成很多田塊爛籽、爛芽，甚至出現(xiàn)大面積的毀種重播的情況；棉花枯、黃萎病發(fā)病田塊已占棉花種植面積的40-50%，重病田達(dá)到20% 左右，全疆每年因?yàn)槊藁?、黃萎病導(dǎo)致的絕收面積在10萬畝以上；加工番茄根腐病田間發(fā)病率達(dá)到30-50%，重病田會(huì)造成20-30%植株死亡。而由疫霉和腐霉引起的葡萄、香梨樹的根腐病也常造成大量植株的死亡。因此成功地控制棉花、加工番茄以及其他名、特、優(yōu)蔬菜瓜果上的病蟲害是建設(shè)新疆優(yōu)質(zhì)商品棉和優(yōu)質(zhì)林果業(yè)基地的迫切需要。長(zhǎng)期以來，化學(xué)農(nóng)藥對(duì)病蟲害防治和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展起到了巨大的推動(dòng)作用，但化學(xué)農(nóng)藥的長(zhǎng)期使用也造成病菌抗藥性增強(qiáng)，而難以控制病害發(fā)生。。因此，許多國(guó)家已將對(duì)生態(tài)安全、與環(huán)境相容性強(qiáng)的生物農(nóng)藥作為病蟲害防治的一個(gè)重要發(fā)展方向。生物農(nóng)藥因具有對(duì)環(huán)境和生態(tài)安全的突出優(yōu)點(diǎn)，屬于國(guó)家優(yōu)先支持和鼓勵(lì)發(fā)展的項(xiàng)目，雖然微生物農(nóng)藥在病蟲害綜合治理中具有重要作用，但目前產(chǎn)值僅占各類農(nóng)藥總產(chǎn)值的7. 8%，真正實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用的品種僅4-5種。存在的突出問題是現(xiàn)有微生物農(nóng)藥多源于自然菌株直接加工應(yīng)用，在毒力水平、作用速度、防治對(duì)象的廣譜性方面尚不及化學(xué)農(nóng)藥，此外，微生物農(nóng)藥還存在地域適應(yīng)性，在其它地方表現(xiàn)出很好防病效能的微生物農(nóng)藥，到了新疆很多時(shí)候表現(xiàn)不穩(wěn)定，這就迫切需要利用從新疆本地篩選出的適合本土的高效防病微生物，并充分利用新疆本土的一些農(nóng)業(yè)及工業(yè)廢棄物作為其發(fā)酵基本培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)， 從而降低生物農(nóng)藥的生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，同時(shí)可以有效減少農(nóng)業(yè)及工業(yè)廢棄物數(shù)量，起到保護(hù)環(huán)境的作用。生物有機(jī)肥是一種含有特定功能微生物的有機(jī)肥料，有著其它化學(xué)肥料無法比擬的優(yōu)越性，對(duì)防治病害、提高產(chǎn)品品質(zhì)，增加作物產(chǎn)量，均有顯著效果。生物有機(jī)肥中的有機(jī)養(yǎng)分、無機(jī)養(yǎng)分、微生物養(yǎng)分既能互相促進(jìn)、提高肥效，又能緩急相濟(jì)、互補(bǔ)短長(zhǎng)，使養(yǎng)分釋放速率與作物吸收養(yǎng)分規(guī)律同步；同時(shí)生物有機(jī)肥既能直接為土壤微生物提供有機(jī)能源， 又能通過改善作物植株?duì)I養(yǎng)和根際土壤環(huán)境促進(jìn)微生物的繁衍，增加土壤有益微生物數(shù)量和抑制有害菌數(shù)量的目的。微生物發(fā)酵過程的生產(chǎn)水平不僅取決于生產(chǎn)菌種本身的性能，還要賦以合適的環(huán)境條件。在篩選到高效菌株的基礎(chǔ)上，必須了解生產(chǎn)菌在發(fā)酵過程中的代謝變化規(guī)律，及與發(fā)酵有關(guān)的參數(shù)及其影響，找到與之配套的培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、PH、溶氧等發(fā)酵條件，優(yōu)化發(fā)酵工藝，使生產(chǎn)菌種處于生長(zhǎng)的優(yōu)化環(huán)境中，提高發(fā)酵單位。目前國(guó)內(nèi)外生物農(nóng)藥的發(fā)酵生產(chǎn)通常采用油渣、豆粕、玉米粉、葡萄糖并添加無機(jī)鹽以及微量氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并采用響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)法來優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，但用這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)生產(chǎn)生物農(nóng)藥的生產(chǎn)成本還是較高，從而導(dǎo)致生物農(nóng)藥售價(jià)偏高從而限制了其應(yīng)用推廣。沼液是發(fā)酵后殘留的液體，主要包括發(fā)酵過程中分解釋放的有機(jī)、無機(jī)鹽類，其不僅含有豐富的氮、磷、鉀等大量常量營(yíng)養(yǎng)元素和鈣、銅、鐵、鋅、錳等微量營(yíng)養(yǎng)元素，還含有豐富的氨基酸、B族維生素、各種水解酶、某些植物激素、對(duì)病蟲害有抑制作用的物質(zhì)或因子。 因此利用沼液作為生物有機(jī)肥規(guī)模化生產(chǎn)的發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，不僅可以解決功能微生物發(fā)酵生產(chǎn)過程中需要消耗大量的水、氮源、碳源以及其他微量元素的問題，還可以有效解決沼液廢棄物綜合利用、提高利用效率的問題，同時(shí)可有效降低生物有機(jī)肥的生產(chǎn)成本，促進(jìn)生物有機(jī)肥的進(jìn)一步推廣和應(yīng)用。新疆生態(tài)環(huán)境非常脆弱，長(zhǎng)期的棉花連作和化肥的使用，導(dǎo)致了各種問題日益嚴(yán)重，同時(shí)為了追求高產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)效益，向農(nóng)田中投放了大量的農(nóng)藥和化肥，對(duì)新疆的農(nóng)業(yè)生態(tài)安全已造成日益嚴(yán)重的影響，因此開發(fā)新型生物肥料已成為國(guó)內(nèi)外專家學(xué)者共同關(guān)注的問題。目前將沼液、沼渣施肥使用已在一定范圍內(nèi)進(jìn)行了研究，已取得部分成果。利用新疆豐富的沼氣發(fā)酵剩余物進(jìn)行二次開發(fā)成生物肥料將具有廣闊的應(yīng)用前景，沼液和拮抗病原菌的功能微生物結(jié)合制成液體生物有機(jī)肥，既能有效利用沼液資源，又能發(fā)揮功能微生物的抗病作用，在提高土壤質(zhì)量，農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和生態(tài)環(huán)境保護(hù)有重要作用和意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用新疆沼氣發(fā)酵產(chǎn)物沼液為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用其發(fā)酵生產(chǎn)一種既能控制以加工番茄和棉花為主的經(jīng)濟(jì)作物的土傳病害，又能促進(jìn)經(jīng)濟(jì)作物生長(zhǎng)的生產(chǎn)成本低、適用新疆地區(qū)、效果好、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的以沼液為基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)生物有機(jī)肥的方法。本發(fā)明公開了一種以沼液為基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)生物有機(jī)肥的方法，其特征在于包括如下方法步驟
(1)、配制發(fā)酵培養(yǎng)基每IOOOmL沼液與包括下述重量份的組份配成液體，即得發(fā)酵培養(yǎng)基玉米粉10 15g、豆粕10 25g、磷酸二氫鉀1 2g、碳酸鈣15 20g、硫酸鎂0. 5 lg、硫酸銨1 2g、甘氨酸0. 5 lg、氯化鈉1. 5 2. 5g、硝酸鉀2 4g，將上述發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后備用；
(2)、將枯草芽孢桿菌劃線于NA營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基試管斜面上，在觀 30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h Mh，得到備用的斜面菌種；
(3)、用接種環(huán)挑取(2)步驟中得到斜面菌種單菌落，接種于裝有SDAY培養(yǎng)基的三角瓶中，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，SDAY培養(yǎng)基的裝液量為三角瓶體積的20% 50%，在觀 301下 180 200r/min振蕩培養(yǎng)16 Mh，得到一級(jí)種子液；
4(4)、將上述培養(yǎng)的一級(jí)種子液接入裝有SDAY培養(yǎng)基的三角瓶，接種量為SDAY培養(yǎng)基3 5% (ν/ν)，SDAY培養(yǎng)基的裝液量為三角瓶體積的20% 50%，在 30°C下 180 200r/min振蕩培養(yǎng)16h Mh，得到二級(jí)種子液；
(5)、種子罐培養(yǎng)在攪拌式發(fā)酵罐內(nèi)加入備用的發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為發(fā)酵罐體積的50% 60%，0.09 0. 11% (w/v)消泡劑，按5% 10%的接種量接入培養(yǎng)好的二級(jí)種子液，在 30°C下通氣量3 5L/min，罐壓60 80kPa，攪拌轉(zhuǎn)速180 200r/min條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間控制為16h Mh，得到三級(jí)種子液；
(6)、發(fā)酵罐培養(yǎng)在攪拌式發(fā)酵罐內(nèi)加入備用的發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為發(fā)酵罐體積的50% 60%，0.09 0.11% (w/v)消泡劑，按8 10%接入三級(jí)種子液，在 28 30°C下通氣量8 10L/min，罐壓60 80kPa，攪拌轉(zhuǎn)速180 220r/min條件下，發(fā)酵50h 72h，即可得到生物有機(jī)肥。所述發(fā)酵培養(yǎng)基配制組份中的玉米粉可以用淀粉、葡萄糖、蔗糖中的一種或幾種替換。玉米粉是為培養(yǎng)基提供碳源，所述碳源也可以用淀粉、葡萄糖或蔗糖中所含碳源來替代使用。所述配制發(fā)酵培養(yǎng)基組份中的豆粕由酵母浸膏、蛋白胨中的一種或兩種所替換。 豆粕是為培養(yǎng)基提供氮源，所述氮源也可以用酵母浸膏或蛋白胨中所含碳源來替代使用。在得到所述生物有機(jī)肥后，用顯微鏡檢查到有10 30%的芽胞囊破裂后，便可放罐，得到的生物有機(jī)肥中枯草芽孢桿菌的有效活菌數(shù)>1012cfu/ml達(dá)到合格。本發(fā)明所使用的發(fā)酵菌株為枯草芽孢桿菌，所述的發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基為沼液，生物有機(jī)肥中有效活菌數(shù)> 1012cfu/ml為合格，各種營(yíng)養(yǎng)成分占肥料總體質(zhì)量為有機(jī)質(zhì) 0. 15 0. 17%,腐植酸0. 1 0. 2%,速效氮500 1000mg/l，速效磷20 40mg/l，速效鉀 900 1200mg/l，鐵 200 1000mg/l，鋅 200 1000mg/l，猛 800 1500mg/l。該生物有機(jī)肥可用作控制或防治農(nóng)作物土傳病害的發(fā)生，特別是控制或防治以加工番茄、棉花和辣椒為主的經(jīng)濟(jì)作物的土傳病害的發(fā)生，同時(shí)該生物有機(jī)肥還可以有效促進(jìn)上述作物的生長(zhǎng)和產(chǎn)量的提高。作為進(jìn)一步的優(yōu)選，則是用于對(duì)加工番茄根腐病、棉苗立枯病或棉花枯、黃萎病的控制或防治，以田間滴灌方式使用，使用量為200 500g/畝。為降低生防菌枯草芽孢桿菌的發(fā)酵生產(chǎn)成本，以沼氣發(fā)酵殘留物沼液為基礎(chǔ)物質(zhì)，把玉米粉、豆粕作為發(fā)酵碳源和氮源，按不同的比例補(bǔ)充到沼液中，得到不同處理的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，從中選取最佳的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。結(jié)果顯示在IOOOml沼液中加入2g玉米粉、2g豆粕條件下，利用所選出的兩株枯草芽孢桿菌s37和s44分別可以提高棉花的發(fā)芽率23. 3% 和40%，并且對(duì)棉花立枯病的相對(duì)防效分別達(dá)到63. 4%和64. 3%，相對(duì)其它處理較高，保苗率分別提高22. 5%和20. 8%，分別可以提高棉花的兩片真葉率16. 7%和30. 5%，平均鮮重分別增加0. 06g和0. 092g,平均干重分別增加0. 054g和0. 034g。此條件下所需玉米粉和豆粕少，發(fā)酵生產(chǎn)成本底，可作為最佳培養(yǎng)基組合。其實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析如下
(1)發(fā)酵培養(yǎng)基配制以沼液作為發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基；玉米粉按ο. 2%、0. 5%和1%的比例加入；豆粕以0. 2%、0. 5%和1%的比例加入。其中玉米粉和豆粕不同的比例自由組合成9個(gè)處理，以不添加玉米粉和豆粕作為O處理。將培養(yǎng)基配制好后于121°C滅菌20min備用。具
權(quán)利要求
1.一種以沼液為基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)生物有機(jī)肥的方法，其特征在于主要包括如下方法步驟(1)、配制發(fā)酵培養(yǎng)基每IOOOmL沼液與包括下述重量份的組份配成液體，即得發(fā)酵培養(yǎng)基玉米粉10 15g、豆粕10 25g、磷酸二氫鉀1 2g、碳酸鈣15 20g、硫酸鎂0. 5 lg、硫酸銨1 2g、甘氨酸0. 5 lg、氯化鈉1. 5 2. 5g、硝酸鉀2 4g，將上述發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后備用；(2)、將枯草芽孢桿菌劃線于NA營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基試管斜面上，在觀 30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h Mh，得到備用的斜面菌種；(3)、用接種環(huán)挑取(2)步驟中得到斜面菌種單菌落，接種于裝有SDAY培養(yǎng)基的三角瓶中，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，SDAY培養(yǎng)基的裝液量為三角瓶體積的20% 50%，在觀 301下 180 200r/min振蕩培養(yǎng)16 Mh，得到一級(jí)種子液；(4)、將上述培養(yǎng)的一級(jí)種子液接入裝有SDAY培養(yǎng)基的三角瓶，接種量為SDAY培養(yǎng)基3 5% (ν/ν)，SDAY培養(yǎng)基的裝液量為三角瓶體積的20% 50%，在 30°C下 180 200r/min振蕩培養(yǎng)16h Mh，得到二級(jí)種子液；(5)、種子罐培養(yǎng)在攪拌式發(fā)酵罐內(nèi)加入備用的發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為發(fā)酵罐體積的50% 60%，0.09 0. 11% (w/v)消泡劑，按5% 10%的接種量接入培養(yǎng)好的二級(jí)種子液，在 30°C下通氣量3 5L/min，罐壓60 80kPa，攪拌轉(zhuǎn)速180 200r/min條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間控制為16h Mh，得到三級(jí)種子液；(6)、發(fā)酵罐培養(yǎng)在攪拌式發(fā)酵罐內(nèi)加入備用的發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為發(fā)酵罐體積的50% 60%，0.09 0.11% (w/v)消泡劑，按8 10%接入三級(jí)種子液，在 28 30°C下通氣量8 10L/min，罐壓60 80kPa，攪拌轉(zhuǎn)速180 220r/min條件下，發(fā)酵50h 72h，即可得到生物有機(jī)肥。
2.如權(quán)利要求1所述的以沼液為基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)生物有機(jī)肥的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基配制組份中的玉米粉用淀粉、葡萄糖、蔗糖中的一種或幾種替換。
3.如權(quán)利要求1所述的以沼液為基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)生物有機(jī)肥的方法，其特征在于所述配制發(fā)酵培養(yǎng)基組份中的豆粕用酵母浸膏、蛋白胨中的一種或兩種所替換。
4.如權(quán)利要求1、2或3所述的以沼液為基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)生物有機(jī)肥的方法，其特征在于得到生物有機(jī)肥后，用顯微鏡檢查到有10 30%的芽胞囊破裂后，便可放罐，得到的生物有機(jī)肥中枯草芽孢桿菌的有效活菌數(shù)>1012cfu/ml達(dá)到合格。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以沼液為基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)生物有機(jī)肥的方法，主要包括如下方法步驟(1)配制發(fā)酵培養(yǎng)基(2)將枯草芽孢桿菌斜面菌種；(3)斜面菌種行搖瓶培養(yǎng)，得到一級(jí)種子液；(4)將一級(jí)種子液接入裝有SDAY培養(yǎng)基培養(yǎng)得到二級(jí)種子液；(5)種子罐培養(yǎng)得到三級(jí)種子液；(6)得到三級(jí)種子液接入發(fā)酵罐放大培養(yǎng)可得到生物有機(jī)肥。本發(fā)明利用新疆沼氣發(fā)酵產(chǎn)物沼液為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用其發(fā)酵生產(chǎn)的有機(jī)肥既能控制以加工番茄和棉花為主的經(jīng)濟(jì)作物的土傳病害，又能促進(jìn)經(jīng)濟(jì)作物生長(zhǎng)的生產(chǎn)成本低、適用新疆地區(qū)、效果好、經(jīng)濟(jì)實(shí)用。
文檔編號(hào)C05F5/00GK102219567SQ20111012495
公開日2011年10月19日 申請(qǐng)日期2011年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月16日
發(fā)明者任娟, 劉勇杰, 張學(xué)坤, 李俊華, 杜娟, 趙思峰, 魯建江 申請(qǐng)人:新疆石大科技有限公司, 石河子大學(xué)