專利名稱：一種與植物抗逆性相關(guān)的基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種與植物抗逆性相關(guān)的基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
大豆原產(chǎn)我國，豆科大豆屬一年生草本植物，是世界上廣泛栽培的重要的糧食和油料作物，干旱、鹽堿等環(huán)境脅迫對大豆的生長發(fā)育具有重要影響，嚴重時會造成大豆大規(guī)模減產(chǎn)。解析大豆抵抗逆境的分子機制，培育耐逆性強的大豆品種是目前大豆育種的主要目標之一。目前，應(yīng)用基因工程育種已經(jīng)成為增強作物耐逆性的重要手段。高等植物在應(yīng)答環(huán)境脅迫時啟動了多種應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)，目前已成為提高大豆產(chǎn)量及保證農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要途徑之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種與植物抗逆性相關(guān)的基因及其應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下。一種與植物抗逆性相關(guān)的基因，其具有序列表中SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。含有上述基因的重組表達載體，所用空載體為pEGAD。將目的基因插入到pEGAD的限制性內(nèi)切酶Kpn I和BamH I酶切識別位點之間，得
到重組表達載體。上述基因在培育高抗逆轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。首先構(gòu)建含有SEQ ID NO :1所示基因的重組表達載體，然后利用所得重組表達載體構(gòu)建轉(zhuǎn)化體，再利用轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)化目的植物，篩選陽性植株，得到與正常植物相比具有高抗逆性的轉(zhuǎn)基因植物。所述目的植物為大豆。采用上述技術(shù)方案所產(chǎn)生的有益效果在于發(fā)明人通過大量科學(xué)研究證明本發(fā)明的基因?qū)χ参锏亩喾N脅迫條件具有應(yīng)答性，證明其與植物的抗逆性具有緊密聯(lián)系，利用現(xiàn)有常規(guī)基因工程方法將本發(fā)明的基因?qū)氲街参矬w內(nèi)，能夠得到具有高抗逆性的轉(zhuǎn)基因植物，對提高作物的產(chǎn)量具有重大意義。


圖1為大豆中GALl基因在受ABA，NaCl脅迫下表達模式。圖2為pCAMBIA3301-PeAU:⑶S的在鹽、ABA脅迫下的⑶S染色結(jié)果；l，Ck ；2,150mM NaCl,3,100 μ M ΑΒΑ。
具體實施例方式以下實施例詳細說明了本發(fā)明。本發(fā)明所使用的各種原料及各項設(shè)備均為常規(guī)市售產(chǎn)品，均能夠通過市場購買直接獲得。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，
3結(jié)果取平均值。本發(fā)明的基因來源于大豆屬大豆，命名為GmAP21ike-l (簡稱GAL1)?？捎矛F(xiàn)有的植物表達載體構(gòu)建含有所述基因和啟動子的重組表達載體。所述植物表達載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物基因槍轉(zhuǎn)化法所用的載體等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；?如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用所述基因構(gòu)建重組植物表達載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或組成型啟動子，如煙草花椰菜花葉病毒 (CAMV) 35S啟動子、玉米的泛素啟動子⑴biquitin)，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS 基因、GFP基因等)、具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等)或是抗化學(xué)試劑標記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。利用本發(fā)明的基因制備轉(zhuǎn)基因高抗逆性植物時，首先構(gòu)建含有SEQ ID NO 1所示基因的重組表達載體，然后利用此重組表達載體構(gòu)建轉(zhuǎn)化體，再利用此轉(zhuǎn)化體侵染目的植物，篩選陽性植株，獲得與正常植物相比具有高抗逆性的轉(zhuǎn)基因植物。實施例1、實時熒光定量分析GALl的表達模式(1)、脅迫處理Hoagland營養(yǎng)液生長20天左右的大豆Williams82幼苗用200mM NaCl, 100 μ M ABA分別處理Oh、lh、;3h、6h、12h，取根用液氮速凍，_80°C保存?zhèn)溆茫?2)、mRNA的分離采用Trizol法提取大豆總RNA，①先將組織剪切成小塊，放入研磨中用液氮研磨3次，將研磨好的組織50-100mg加入1. 5mL離心管中然后加入Iml RNAVzol，裂解產(chǎn)物應(yīng)呈澄清的透明粘稠液體.室溫放置5分鐘；②加200 μ 1氯仿，振蕩混勻，室溫靜置5min，12，000r/min，4°C離心IOmin ；③取500 μ 1上清于另一離心管，加等體積異丙醇，室溫放置lOmin，12，OOOr/min，4°C離心IOmin ；④加入Iml 75%乙醇洗沉淀， 8，000r/min，4°C離心5min，重復(fù)兩次；室溫風(fēng)干IOmin左右，加20 μ 1左右DEPC處理過的 RNase Free水(DEPC水)溶解沉淀；(3)、反轉(zhuǎn)錄為cDNA 將提取的mRNA用!Iomega公司的反轉(zhuǎn)錄酶AMV反轉(zhuǎn)錄為 cDNA ；cDNA第一鏈的合成配置第一種混合液totalRNA,7y 1(2μ g) ；oligo dT (10 μ Μ)，3 μ 1 ；總體積 10 μ 1，PCR儀上70°C放置8min，立即置于冰上；配置第二種混合液5XBuffer，4y1 ；dNTPs(dATP, dGTP, dTTP, dCTP 2. 5mmol/ L each), 4 μ 1 ； RNase inhibitor (40U/μ 1) ,0. 5μ 1 ；RNase-free 水，0· 5 μ 1 ；M-MLV (200U/μ 1)反轉(zhuǎn)錄酶， μ ι ；混勻，將第二種混合液加入到第一種混合液中，每管 ομ 1，pcr儀上 42°C孵育90min，然后70°C，IOmin終止反應(yīng)；(4)、實時熒光定量PCR對GALl表達特征的分析以上述cDNA作為模板，根據(jù)GALl序列設(shè)計引物，以18srRNA為內(nèi)參，使用TaKaRa 公司出品的STOR Premix Ex Tag 進行定量PCR分析。在20 μ 1體系中加入cDNA模板 2μ 1、正反向引物各 0. 4μ 1、STOR Primix Ex taq (2X) 10μ 1, ROX Reference Dye ΙΙ(50Χ)0· 4μ 1、ddH20 6·8μ1。擴增程序為95°C 30s ；95°C 5s,60°C 34s,45 cycles ； 95°C 15s,60°C lmin,95°C 15s ；引物序列分別為qGALl-F 5' -CAATGGGCAGGAAAGAGC-3，(SEQ ID NO 3)；qGALl-R 5' -ATGGCAGTCGATGGAAAGGT-3，(SEQ ID NO 4)；18srRNA-F 5' -CCTTGCTTGTTGCTTTACTAAAT-3，(SEQ ID NO 5)；18srRNA-R 5' -ATGCACCTTTTCGTTTGTTTCGGAG-3，(SEQ ID NO 6)；(5)結(jié)果結(jié)果如圖1所示，表明相對于CK，GALl基因在NaCl，ABA處理下表達上調(diào)，其中 NaCl處理后3小時達到最高，ABA處理后6小時表達達到最高，之后表達下調(diào)；這表明本發(fā)明的基因與植物的抗逆性具有緊密聯(lián)系，利用現(xiàn)有常規(guī)基因工程方法將本發(fā)明的基因?qū)氲街参矬w內(nèi)，能夠得到具有高抗逆性的轉(zhuǎn)基因植物，對提高作物的產(chǎn)量具有重大意義。實施例2、PemiarOTS染色技術(shù)分析GALl基因的逆境表達模式(I)GALl 的 Promoter 的克隆根據(jù)GALl基因的啟動子序列(ATG上游取llliBbp，見SEQ ID NO 2)設(shè)計引物對， 根據(jù)載體PCAMBIA3301多克隆位點，引物末端分別引入EcoRI和BglII酶切識別位點，以 CTAB法提取的大豆測序品種Williams82的DNA為模板，PCR擴增GALl基因的啟動子；引物序列為Pro-GALl-F-EcoRI :5，-CGGAATTC GATCTACTTAAGTCAATAAC-3，(SEQ ID NO 7)；Pro-GALl-R-BglII :5，-GAAGATCT CGTGGCGCTTCTTTTTTTTA-3，(SEQ ID NO 8)；PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，采用上海生工膠回收試劑盒回收純化 1113bb左右的條帶；連T載體(PMD19-T)，挑陽性克隆，測序；(2)重組表達載體的構(gòu)建①提取含有正確測序的GALl Promoter序列的T載體質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶EcoRI 和BglII酶切，回收酶切產(chǎn)物；②用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BglII酶切空載體pCAMBIA3301，回收載體骨架；③用T4連接酶將步驟1的酶切產(chǎn)物和步驟2的載體骨架連接；④將步驟3的連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5 α菌株，37°C過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆進行測序；測序結(jié)果表明，得到了重組質(zhì)粒pCAMBIA330l-PeAU⑶S ；(3)農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化采用液氮凍溶法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，具體操作如下a.取出凍存的200 μ 1感受態(tài)細胞，融化后加入5_10 μ 1質(zhì)粒DNA，輕彈管壁混勻， 冰上放20-30min ；
b.放入液氮中5min后取出，將管轉(zhuǎn)入37°C (5min)融化后，加入800 μ 1 LB (無抗性)液體培養(yǎng)基，28°C低速振蕩(150rpm)4-^!;d. 10000rpm，30sec，去上清，加100 μ 1 LB液體培養(yǎng)基，懸浮菌體后涂板(含50mg/ ml卡那霉素)；e.置培養(yǎng)至白色轉(zhuǎn)化子長出，用于毛狀根的轉(zhuǎn)化；(4)農(nóng)桿菌K599介導(dǎo)的毛狀根轉(zhuǎn)化以大豆品種吉林小粒1號為材料，取種子材料用氯氣消毒10小時后，在&培養(yǎng)基(培養(yǎng)基配方蔗糖，0. 8 瓊脂粉(sigma)，1XGAMB0RG B-5BASAL(Phyto Technology Laboratories，貨號:G398)，pH調(diào)至5. 7左右；)上萌發(fā)5天，待子葉剛要張開時切下子葉， 在子葉節(jié)處縱橫切割數(shù)刀，浸在活化的農(nóng)桿菌K599中侵染30min(0D :0. 6左右)后，將外植體轉(zhuǎn)至1/2MS培養(yǎng)基(培養(yǎng)基配方2%蔗糖，0. 8瓊脂粉(sigma)，0. 5XMURA SHIGE & SKOOG BASAL MEDIOM w/VITAMINS(Phyto Technology Laboratories，貨號G519)，pH調(diào)至 5. 7左右；)上共培生長3天后，再轉(zhuǎn)至1/2 MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)毛狀根，7天后，毛狀根長出， 取根進行GUS染色分析；(5)⑶S染液的配制首先配制GUS反應(yīng)緩沖液Tris Buffer，其中包括IOOmM Tris和50mM NaCl以濃鹽酸調(diào)pH至7. 4 ；然后以Tris buffer配制0. 5mM K3 [Fe (CN)6]溶液。按lmg/ml的濃度稱取x-glu(5-溴-4-氯-3-吲哚葡萄糖醛酸苷)，按照每mg加入10 μ 1 DMSO (二甲基亞砜)的比例溶解x-glu，加入1Tris buffer配制的0.5mM K3 [Fe (CN)6]溶液定容，可加入幾滴TritonX-100以增強染色效果。迅速分裝后于_20°C避光保存；(6)脅迫處理及⑶S染色將轉(zhuǎn)基因毛狀根浸沒在1/2MS培養(yǎng)基，100 μ M ABA, 150mM NaCl中脅迫處理3，6， 24h后進行⑶S染色，以V2MS培養(yǎng)基中的毛狀根作為對照；(7)結(jié)果結(jié)果如圖2所示，表明在ABA，NaCl，處理條件下該基因表達上調(diào)，ΙΟΟμΜ ABA處理后3 Jh表達上調(diào)；150mM NaCl處理池后表達上調(diào)；這表明本發(fā)明的基因與植物的抗逆性具有緊密聯(lián)系，利用現(xiàn)有常規(guī)基因工程方法將本發(fā)明的基因?qū)氲街参矬w內(nèi)，能夠得到具有高抗逆性的轉(zhuǎn)基因植物，對提高作物的產(chǎn)量具有重大意義。上述描述僅作為本發(fā)明可實施的技術(shù)方案提出，不作為對其技術(shù)方案本身的單一限制條件。
權(quán)利要求
1.一種與植物抗逆性相關(guān)的基因，其特征在于其具有序列表中SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列。
2.含有權(quán)利要求1所述基因的重組表達載體，其特征在于所用空載體為PEGAD。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組表達載體，其特征在于將目的基因插入到pEGAD的限制性內(nèi)切酶Kpn I和BamH I酶切識別位點之間，得到重組表達載體。
4.權(quán)利要求1所述的基因在培育高抗逆轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于首先構(gòu)建含有SEQID NO :1所示基因的重組表達載體，然后利用所得重組表達載體構(gòu)建轉(zhuǎn)化體，再利用轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)化目的植物，篩選陽性植株，得到與正常植物相比具有高抗逆性的轉(zhuǎn)基因植物。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用，其特征在于所述目的植物為大豆。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與植物抗逆性相關(guān)的基因，其具有序列表中SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，其與植物的抗逆性具有緊密聯(lián)系，基于此，利用現(xiàn)有的基因工程方法能夠培育出具有高抗逆性的轉(zhuǎn)基因植物，對提高作物的產(chǎn)量具有重大意義。
文檔編號A01H5/00GK102226191SQ20111015480
公開日2011年10月26日 申請日期2011年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月10日
發(fā)明者李霞, 鄒艷敏 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所