基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的單增李斯特菌的層析試紙條的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)學檢測領(lǐng)域，具體地說涉及一種基于低噪聲激發(fā)式熒光染料標記的單增李斯特菌免疫層析試紙條及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明采用量子點作為標記，采用免疫層析技術(shù)，制備靶向于單增李斯特菌的免疫層析試紙條，檢測時，采用專用便攜式低噪聲激發(fā)式熒光掃描儀分別掃描質(zhì)控線和檢測線，以檢測線熒光強度檢測值實現(xiàn)樣本的定性及定量檢測，該試紙條適用于食品及病理樣本中單增李斯特菌即時檢測，本發(fā)明具有快速、高敏、兼顧定性及精準定量及便攜的特點。
【專利說明】基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的單増李斯特菌的層析試紙條

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品檢測領(lǐng)域，具體地說涉及一種基于低噪聲激發(fā)式熒光染料標記的 單增李斯特菌免疫層析試紙條及其制備方法與應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 單核細胞增生李斯特氏菌簡稱單增李斯特菌，是一種人畜共患病的病原菌。它能 引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細胞增多。它廣泛存在于 自然界中，食品中存在的單增李氏菌對人類的安全具有危險，該菌在4°c的環(huán)境中仍可生長 繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一，因此，在食品衛(wèi)生微生物檢驗中，必須 加以重視。目前，單增李斯特菌已經(jīng)作為致病菌檢測的一項重要指標，在公共衛(wèi)生、食品衛(wèi) 生、畜牧獸醫(yī)和出入境檢驗檢疫中均有重要的意義，同時也對單增李斯特菌的快速及高精 度的定量檢測提出了更高的要求。為探求快速、準確、高靈敏度、易操作且能夠定量的檢測 方法，世界各國學者進行了大量研宄，從以傳統(tǒng)方法為基礎(chǔ)發(fā)展到以免疫學、分子生物學為 基礎(chǔ)的快速檢測方法，并在實踐中不斷取得新進展。
[0003] 免疫層析技術(shù)是一項有效結(jié)合了層析法卓越分離能力和免疫反應(yīng)高度特異性的 新型免疫檢測技術(shù)，當前在疾病快速診斷、環(huán)境污染物分析及致病生物因子檢定等領(lǐng)域得 到廣泛應(yīng)用。其原理是將特異抗原或抗體固定于硝酸纖維素膜的某一區(qū)帶，當該干燥的硝 酸纖維素膜一端浸入樣品后，由于毛細管作用，樣品將沿著該膜向前移動，當迀移至交聯(lián)標 記抗體的特定區(qū)域時，樣品中相應(yīng)的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合形成抗原-標記抗體 復合物，經(jīng)標記物的顯色、發(fā)光或電化學反應(yīng)而使該區(qū)域顯示一定的信號，從而實現(xiàn)特異性 免疫診斷。常用的標記物包括生色型探針（包括膠體金、膠體碳、著色微球等）和熒光分子 (如有機熒光染料、量子點、稀土元素配合物、上轉(zhuǎn)磷光顆粒等）。
[0004] 然而上述的標記物卻存在靈敏度有限且無法實現(xiàn)精確定量檢測等缺陷，進而限制 了免疫層析技術(shù)的廣泛應(yīng)用。如現(xiàn)有技術(shù)中常見的利用酶標記催化生色底物的酶促反應(yīng)而 顯色，可用于抗原或抗體的直接檢測，將該方法應(yīng)用于食品中單增李斯特菌的檢測，通過單 克隆抗體大大降低假陽性率，但是該方法的靈敏度較分子生物學方法低，且必須經(jīng)過增菌 篩選純培養(yǎng)步驟，因此難以在短時間內(nèi)得到檢測結(jié)果。
[0005] 對于現(xiàn)有的膠體金免疫層析技術(shù)，通過膠體金等納米顆粒的聚集反應(yīng)而顯色，從 而實現(xiàn)結(jié)果判定。雖然該種方法具有便捷、快速、準確和無污染等特點被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學 檢測和臨床診斷，在病原體檢測方面，其敏感性、特異性具有其他免疫學方法無可比擬的優(yōu) 勢，且無需特殊儀器設(shè)備，對檢測人員的專業(yè)要求低，有良好的基層應(yīng)用開發(fā)前景。但這種 方法中存在標記物的穩(wěn)定性較差，顏色單一，靈敏度較低，受基質(zhì)的背景干擾大等缺陷，且 只能定性檢測，不能做到精確定量檢測，上述標記靈敏度有限且無法實現(xiàn)精確定量，限制了 免疫層析技術(shù)的應(yīng)用。
[0006] 另外，現(xiàn)有免疫層析技術(shù)一直主要用于對蛋白類的檢測，對于微生物的檢測則所 見甚少，同時更難以實現(xiàn)微生物的定量檢測，對于快速檢測致病菌而言，其應(yīng)用受到極大的 限制。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于現(xiàn)有技術(shù)中難于快速定量檢測單增李斯特 菌的問題，進而提供一種基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的單增李斯特菌免疫層析試紙條，并 進一步公開了其應(yīng)用。
[0008] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的一種低噪聲激發(fā)式熒光單增李斯特菌免疫層 析試紙條，包括：
[0009] 底板以及沿所述底板的長度方向上依次粘附在所述底板上的樣品墊、結(jié)合墊、抗 體承載膜和吸水墊，且所述樣品墊、結(jié)合墊、抗體承載膜和吸水墊之間，依次與且僅與相鄰 部位相接觸且部分重疊；所述抗體承載膜粘附于所述底板的中間部位，其上設(shè)置有相間隔 的檢測線和質(zhì)控線，所述檢測線靠近所述結(jié)合墊，所述質(zhì)控線靠近所述吸水墊；
[0010] 所述結(jié)合墊上噴涂有低噪聲激發(fā)式熒光染料標記的可與所述單增李斯特菌特異 性結(jié)合的單克隆抗體；
[0011] 所述檢測線由可與所述單增李斯特菌特異性結(jié)合的多克隆抗體涂層形成；所述質(zhì) 控線由與所述單增李斯特菌以及所述可與單增李斯特菌特異性結(jié)合的多克隆抗體均無關(guān) 的抗體涂層形成。
[0012] 所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的單增李斯特菌免疫層析試紙條，所述結(jié)合墊 上噴涂的所述可與單增李斯特菌特異性結(jié)合的單克隆抗體為鼠抗單增李斯特菌單克隆抗 體（Pierce抗體公司）。
[0013] 所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的單增李斯特菌免疫層析試紙條，形成所述檢 測線的所述可與單增李斯特菌特異性結(jié)合的多克隆抗體為鼠抗單增李斯特菌多克隆抗體 (Pierce抗體公司）。
[0014] 任一所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的單增李斯特菌免疫層析試紙條，形成所 述質(zhì)控線的抗體為羊抗鼠IgG多克隆抗體。
[0015] 任一所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的單增李斯特菌免疫層析試紙條，所述的 低噪聲激發(fā)式焚光染料為發(fā)射波長為650-1000nm的焚光分子。
[0016] 所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的單增李斯特菌免疫層析試紙條，所述的低噪 聲激發(fā)式熒光染料為NHS活化的低噪聲激發(fā)式熒光染料DyLight800 (Thermofisher公司）。
[0017] 本發(fā)明提供了一種制備所述的低噪聲激發(fā)式熒光單增李斯特菌免疫層析試紙條 的方法，包括如下步驟：
[0018] A)取以PBS(pH7. 4)緩沖液稀釋10倍的所述低噪聲激發(fā)式熒光染料（便于取樣準 確），染料與沙門氏菌單克隆抗體按1:2質(zhì)量比混合均勻，室溫條件下避光反應(yīng)2小時，隨后 將所得的標記產(chǎn)物放入含有PBS緩沖液的透析袋中，4°C透析4小時，向所述標記好的標記 產(chǎn)物中添加終濃度為I. 5%BSA、0. 15%Tween20和0. 15%。疊氮化鈉，4°C保存，備用；
[0019] B)在所述結(jié)合墊上噴涂以層析緩沖液稀釋10000倍后的所述標記產(chǎn)物，然后室溫 風干，備用；
[0020] C)使用含5%BSA，0. 1 %Tween20的PBS緩沖液噴涂在所述樣品墊上，室溫風干 后，備用；
[0021] D)分別取所述單增李斯特菌多克隆抗體和所述羊抗鼠IgG多克隆抗體用劃線機 在所述抗體承載膜上劃所述檢測線和所述質(zhì)控線，室溫風干，備用；
[0022] E)將上述步驟獲得的所述樣品墊、所述結(jié)合墊、所述抗體承載膜和所述吸水墊沿 所述底板的長度方向上依次粘附，然后切割成試紙條，即得。
[0023] 本發(fā)明提供了一種由上述的制備方法制得的低噪聲激發(fā)式熒光單增李斯特菌免 疫層析試紙條在定性及定量檢測單增李斯特菌領(lǐng)域中的用途。
[0024] 本發(fā)明提供了一種利用所述的低噪聲激發(fā)式熒光單增李斯特菌免疫層析試紙條 定性檢測單增李斯特菌的方法，包括如下步驟：
[0025] a)以PBS(pH7. 4)緩沖液稀釋處理待測樣品，取上清液作為檢樣，另取所述緩沖液 作為陰性對照，分別用所述的試紙條進行免疫層析；
[0026] b)熒光掃描所述檢測線和所述質(zhì)控線，分別測定所述檢測線和所述質(zhì)控線區(qū)域的 熒光強度，若所述質(zhì)控線區(qū)域出現(xiàn)熒光發(fā)射峰，則表明該試紙條有效，反之則無效；若所述 檢測線區(qū)域同時出現(xiàn)熒光發(fā)射峰則為陽性結(jié)果，反之則為陰性。
[0027] 本發(fā)明提供了一種利所述的低噪聲激發(fā)式熒光單增李斯特菌免疫層析試紙條定 量檢測單增李斯特菌的方法，包括如下步驟：
[0028] 取單增李斯特菌菌株標準品配制成1-100倍梯度濃度的系列標準品；并將上述濃 度系列標準品分別用所述的試紙條進行免疫層析，熒光掃描所述檢測線和所述質(zhì)控線，分 別測定所述檢測線和所述質(zhì)控線區(qū)域的熒光強度，制作抗原濃度與熒光強度比之間關(guān)系的 標準曲線，并擬合方程；
[0029] 所述定量檢測的步驟包括：取待測樣品以所述的試紙條進行免疫層析檢測，利用 上述標準曲線及方程計算得到所述單增李斯特菌濃度。
[0030] 本發(fā)明的上述技術(shù)方案相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點：
[0031] (1)本發(fā)明所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的單增李斯特菌免疫層析試紙條， 其發(fā)射光譜位于低噪聲激發(fā)式區(qū)域（波長為650-1100nm)的低噪聲激發(fā)式熒光探針具有 較高的信噪比，并由此保障了其高檢測靈敏度，同時由于生物基體極少在低噪聲激發(fā)式光 譜區(qū)自發(fā)熒光，使得基于此類探針標記的分析檢測免受背景熒光干擾；因散射光強度與波 長的四次方成反比，發(fā)射光位于長波區(qū)的低噪聲激發(fā)式熒光探針受其干擾小。與常用的膠 體金免疫層析試紙條相比，基于低噪聲激發(fā)式熒光染料標記的免疫層析體系對靶標菌的靈 敏度提高約100倍；如單增李斯特菌膠體金免疫層析試紙條的最低檢出限為l*l〇5CFU/mL， 而本發(fā)明中基于低噪聲激發(fā)式熒光染料的單增李斯特菌免疫層析試紙條的最低檢出限為 I* 103CFU/mL;
[0032] (2)本發(fā)明所述的低噪聲激發(fā)式熒光單增李斯特菌免疫層析試紙條定性檢測單增 李斯特菌的方法具有便攜的優(yōu)勢，適用于現(xiàn)場、即時、快速檢測，本方法所涉的免疫層析試 紙條及低噪聲激發(fā)式熒光掃描儀均屬于便攜可移動裝置，且整個檢測過程可在45min內(nèi)完 成，適用于現(xiàn)場、即時、快速檢測，相對于傳統(tǒng)培養(yǎng)法5-6天的檢測周期及繁瑣的培養(yǎng)基配 制等過程具有顯著的時效性優(yōu)勢；相對于PCR及實時熒光定量PCR法等分子生物學方法則 在儀器的檢測速度、便攜性及現(xiàn)場適用性上呈現(xiàn)明顯優(yōu)勢；
[0033] (3)本發(fā)明所述的低噪聲激發(fā)式熒光單增李斯特菌免疫層析試紙條定量檢測單 增李斯特菌的方法可對所述單增李斯特菌進行定量檢測，傳統(tǒng)的免疫層析法依賴膠體金顆 粒的聚集效應(yīng)而生色以判讀結(jié)果，其顏色深淺雖與樣品中靶標菌的濃度存在一定的數(shù)量關(guān) 系，但無法進行準確定量，而本發(fā)明將近紅外熒光染料標記于特異性抗體上，檢測線的熒光 強度直接體現(xiàn)了與捕獲分子相結(jié)合的靶標菌的量，加之質(zhì)控線不隨樣本改變的熒光強度作 為內(nèi)參，通過掃描檢測線及質(zhì)控線上的熒光強度、計算比值，并與標準曲線比較即可得出檢 樣中靶標菌的濃度。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0034] 為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚的理解，下面根據(jù)本發(fā)明的具體實施例并結(jié)合 附圖，對本發(fā)明作進一步詳細的說明，其中
[0035]圖1是實施例1中所述的低噪聲激發(fā)式熒光單增李斯特菌免疫層析試紙條的示意 圖；
[0036]圖2是實施例2中所述的單增李斯特菌低噪聲激發(fā)式熒光檢測圖；
[0037]圖3是實施例2中所述的單增生李斯特氏菌進行特異性檢測的結(jié)果；
[0038]圖4是實施例3中所述的單增李斯特菌的標準曲線。
[0039] 圖中附圖標記表示為：1-樣品墊，2-結(jié)合墊，3-硝酸纖維素膜，4-檢測線，5-質(zhì)控 線，6-吸水墊，7-底板。

【具體實施方式】
[0040] 實施例1
[0041] 本實施例所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的單增李斯特菌免疫層析試紙條如 圖1所示，其包括，底板7以及沿所述底板7的長度方向上依次粘附在所述底板上的樣品墊 1、結(jié)合墊2、抗體承載膜3和吸水墊6,且所述樣品墊1、結(jié)合墊2、抗體承載膜3和吸水墊6 之間，依次與且僅與相鄰部位相接觸且部分重疊；所述抗體承載膜3上粘附于所述底板7的 中間部位，其上設(shè)置有相間隔的檢測線4的質(zhì)控線5,所述檢測線4靠近所述結(jié)合墊2,所述 質(zhì)控線5靠近所述吸水墊6。所述質(zhì)控線4與所述檢測線5平行設(shè)置，所述檢測線和所述質(zhì) 控線間距0. 5cm。
[0042] 所述結(jié)合墊2上噴涂有低噪聲激發(fā)式熒光染料標記的可與單增李斯特菌特異性 結(jié)合的單克隆抗體-鼠抗單增李斯特菌單克隆抗體（Pierce抗體公司）；所述檢測線4由可 與所述單增李斯特菌特異性結(jié)合的多克隆抗體鼠抗單增李斯特菌多克隆抗體（Pierce抗 體公司）涂層形成；所述質(zhì)控線5由與所述單增李斯特菌以及所述可與單增李斯特菌特異 性結(jié)合的多克隆抗體均無關(guān)的羊抗鼠IgG多克隆抗體涂層形成。
[0043] 所述的低噪聲激發(fā)式熒光染料為發(fā)射波長為777nm，發(fā)射光波長為790nm的NHS活 化的低噪聲激發(fā)式熒光染料DyLight800作為熒光分子。
[0044] 上述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的單增李斯特菌免疫層析試紙條的制備方法， 包括如下步驟：
[0045] 1)低噪聲激發(fā)式熒光標記的單增李斯特菌單克隆抗體和鼠IgG.
[0046] 將dylight800原液用PBS緩沖液稀釋10倍，取L4μL與20μg單增李斯特菌單 克隆抗體（Pierce抗體公司）輕柔混合均勻后于室溫避光反應(yīng)2小時。反應(yīng)結(jié)束后，將標 記產(chǎn)物放入透析袋中，用PBS4°C透析過夜，去除游離的熒光染料。標記好的抗體溶液中添 加終濃度為I. 5%BSA和0. 15%Tween20,疊氮化鈉0. 15%。，4°C保存。使用前標記產(chǎn)物以 層析緩沖液稀釋20000倍；
[0047] 2)制作結(jié)合墊
[0048] 選取玻璃纖維素膜為所述結(jié)合墊2,在所述結(jié)合墊2上噴涂以層析緩沖液稀釋 10000倍后的所述標記產(chǎn)物，然后室溫風干，備用；
[0049] 3)制作樣品墊
[0050] 選取纖維素膜為所述樣品墊1，使用含5%BSA，0. 1 %Tween20的PBS緩沖液噴涂 在所述樣品墊1上，室溫風干后，備用；
[0051] 4)抗體承載膜
[0052] 選取硝酸纖維素膜為所述抗體承載膜3,分別取所述單增李斯特菌多克隆抗體和 所述羊抗鼠IgG(北京華大蛋白質(zhì)）多克隆抗體用劃線機在所述抗體承載膜3上劃所述檢 測線4和所述質(zhì)控線5,室溫風干，備用；
[0053] 5)組裝免疫層析試紙條
[0054]將上述步驟獲得的所述樣品墊1、所述結(jié)合墊2、所述抗體承載膜3和所述吸水墊6 沿所述底板7的長度方向上依次粘附，具體為在底板7中間先鋪設(shè)抗體承載膜3,然后在抗 體承載膜3的與質(zhì)控線5相臨近的一端鋪吸水墊6,使吸水墊6與抗體承載膜3部分重疊， 然后在抗體承載膜3的與所述檢測線4相臨近的一端鋪所述結(jié)合墊2,使所述抗體承載膜3 與所述結(jié)合墊2的一端部分重疊，隨后在所述結(jié)合墊2的另一端再部分重疊的鋪設(shè)所述樣 品墊1，最后切割成0. 5cm寬，即得試紙條。
[0055] 實施例2
[0056] 本實施例提供了一種利用上述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的單增李斯特菌免 疫層析試紙條進行定性單增李斯特菌的方法，包括如下步驟：
[0057] a)取奶粉樣品25g，用225mL含5 %BSA，0· 1 %Tween20的PBS緩沖液稀釋樣品， 取上清液作為檢樣，吸取Iml上清液至EP管中，超聲破菌，纟3探頭，工作5s，休息15s，屏 幕顯示能量為40%，共計30次循環(huán)，吸取100μL經(jīng)超聲處理的檢樣滴加到樣品墊1上，待 吸收干后再滴加50μL層析液，另取所述緩沖液作為陰性對照，用所述的試紙條進行免疫 層析；
[0058] b)室溫放置15min后，用便攜式低噪聲激發(fā)式熒光掃描儀（北京博潤福得科技發(fā) 展有限公司）分別測定所述檢測線4和所述質(zhì)控線5區(qū)域的熒光強度，若所述質(zhì)控線5區(qū) 域出現(xiàn)熒光發(fā)射峰，則表明該試紙條有效，反之則無效；若所述檢測線4區(qū)域同時出現(xiàn)熒光 發(fā)射峰則為陽性結(jié)果，反之則為陰性，附圖2給出了對上述樣品的定性檢測結(jié)果。
[0059] c)將沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、大腸埃希氏菌、單增李斯特菌、副溶血 弧菌分別調(diào)制成0. 6XIO4CFUAiL菌液，按照先前介紹的方法進行破菌處理，吸取100μL經(jīng) 超聲處理的樣本滴加到樣品墊上，待吸收干后再滴加50μL層析液。室溫放置15min后，用 便攜式近紅外熒光掃描儀讀數(shù)，其方法特異性檢測結(jié)果詳見圖3。除單增李斯特菌樣品外， 其余檢測的細菌在檢測線位置均未出現(xiàn)發(fā)射峰，各菌的試紙條均在質(zhì)控線處出現(xiàn)發(fā)射峰。 表明本方法對單增李斯特菌的檢測特異性好，與其他四個菌屬無交叉反應(yīng)。
[0060] 實施例3
[0061] 本實施例提供了一種利用所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的單增李斯特菌免 疫層析試紙條定量單增李斯特菌的方法，包括如下步驟：
[0062] (a)制備標準曲線：取IO5CFUAiL的單增李斯特菌純菌（本實驗室分離株），用 含5%BSA，0. 1%Tween20,PBS稀釋液將所述純菌進行倍數(shù)系列稀釋，制成0. 5*105CFU/ mL、l*104CFU/mL、0. 5*104CFU/mL、l*103CFU/mL、0. 5*103CFU/mL、l*102CFU/mL、10CFU/mL的樣 品；
[0063] (b)依照實施例2中步驟a中所述方法進行超聲破菌處理，吸取100μL以上樣本 滴加到樣品墊1上，待樣品吸收后再滴加50μL層析液，室溫靜置10分鐘，將上述試紙條 放入便攜式低噪聲激發(fā)式熒光掃描儀（北京博潤福得科技發(fā)展有限公司）中讀數(shù)。上述系 列稀釋的單增李斯特菌標準品分別進行檢測，掃描獲得檢測線4和質(zhì)控線5的熒光值，同時 出現(xiàn)檢測區(qū)域熒光峰和質(zhì)控區(qū)域熒光峰方表明反應(yīng)正常。每個稀釋度樣本平行測量兩次， 取平均值作為測量值，檢測結(jié)果見表1 ;以該值對相應(yīng)的樣品濃度作標準工作曲線，如圖4 所示；并擬合得適用的標準曲線（y=I. 3344χ+2. 4321，R2= 0. 9757)。
[0064] 表1不同濃度單增李斯特菌菌標準品對應(yīng)檢測結(jié)果

【權(quán)利要求】
1. 一種基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的單增李斯特菌免疫層析試紙條，其特征在于，包 括： 底板（7)以及沿所述底板（7)的長度方向上依次粘附在所述底板上的樣品墊（1)、結(jié)合 墊（2)、抗體承載膜（3)和吸水墊（6)，且所述樣品墊（1)、結(jié)合墊（2)、抗體承載膜（3)和吸 水墊（6)之間，依次與且僅與相鄰部位相接觸且部分重疊；所述抗體承載膜（3)粘附于所述 底板（7)的中間部位，其上設(shè)置有相間隔的檢測線（4)和質(zhì)控線（5)，所述檢測線（4)靠近 所述結(jié)合墊（2)，所述質(zhì)控線（5)靠近所述吸水墊（6); 所述結(jié)合墊（2)上噴涂有低噪聲激發(fā)式熒光染料標記的可與所述單增李斯特菌特異 性結(jié)合的單克隆抗體； 所述檢測線（4)由可與所述單增李斯特菌特異性結(jié)合的多克隆抗體涂層形成；所述質(zhì) 控線（5)由與所述單增李斯特菌以及所述可與單增李斯特菌特異性結(jié)合的多克隆抗體均 無關(guān)的抗體涂層形成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的單增李斯特菌免疫層析試紙 條，其特征在于，所述結(jié)合墊（2)上噴涂的所述可與單增李斯特菌特異性結(jié)合的單克隆抗 體為鼠抗單增李斯特菌單克隆抗體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的單增李斯特菌免疫層析試 紙條，其特征在于，形成所述檢測線（4)的所述可與單增李斯特菌特異性結(jié)合的多克隆抗 體為鼠抗單增李斯特菌多克隆抗體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的單增李斯特菌免疫層 析試紙條，其特征在于，形成所述質(zhì)控線（5)的抗體為羊抗鼠 IgG多克隆抗體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的單增李斯特菌免疫層 析試紙條，其特征在于，所述的低噪聲激發(fā)式熒光染料為發(fā)射波長為650-1000nm的熒光分 子。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的單增李斯特菌免疫層析試 紙條，其特征在于，所述的低噪聲激發(fā)式熒光染料為NHS活化的低噪聲激發(fā)式熒光染料 DyLight800。
7. -種制備權(quán)利要求1-6任一所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的單增李斯特菌免 疫層析試紙條的方法，其特征在于，包括如下步驟： A) 取以PBS緩沖液稀釋10倍的所述低噪聲激發(fā)式熒光染料，染料與沙門氏菌單克隆 抗體按1:2質(zhì)量比混合均勻，室溫條件下避光反應(yīng)2小時，隨后將所得的標記產(chǎn)物放入含有 PBS緩沖液的透析袋中，4°C透析4小時，向所述標記好的標記產(chǎn)物中添加終濃度為1. 5% BSA、0. 15% Tween20 和 0? 15%。疊氮化鈉，4°C保存，備用； B) 在所述結(jié)合墊（2)上噴涂以層析緩沖液稀釋20000倍后的上述步驟A)中的所述標 記產(chǎn)物，然后室溫風干，備用； C) 使用含5% BSA，0. 1% Tween 20的PBS緩沖液噴涂在所述樣品墊（1)上，室溫風干 后，備用； D) 分別取所述單增李斯特菌多克隆抗體和所述與單增李斯特菌以及可與單增李斯特 菌特異性結(jié)合的多克隆抗體均無關(guān)的抗體用劃線機在所述抗體承載膜（3)上劃所述檢測 線（4)和所述質(zhì)控線（5)，室溫風干，備用； E)將上述步驟獲得的所述樣品墊（1)、所述結(jié)合墊（2)、所述抗體承載膜（3)和所述吸 水墊（6)沿所述底板（7)的長度方向上依次粘附，然后切割成試紙條，即得。
8. 權(quán)利要求1-6任一所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的單增李斯特菌免疫層析試 紙條在定性及定量檢測單增李斯特菌領(lǐng)域中的用途。
9. 一種利用權(quán)利要求1-6任一所述的基于低噪聲激發(fā)式熒光標記的單增李斯特菌免 疫層析試紙條檢測單增李斯特菌的方法，其特征在于，包括如下步驟： a) 以pH為7. 4的PBS緩沖液稀釋處理待測樣品，取上清液作為待檢樣，另取所述PBS 緩沖液作為陰性對照，分別以利用權(quán)利要求1-6任一所述的試紙條進行免疫層析檢測； b) 熒光掃描所述檢測線（4)和所述質(zhì)控線（5)，分別測定所述檢測線（4)和所述質(zhì)控 線（5)區(qū)域的熒光強度，若所述質(zhì)控線（5)區(qū)域出現(xiàn)熒光發(fā)射峰，則表明該試紙條有效，反 之則無效；若所述檢測線（4)區(qū)域同時出現(xiàn)熒光發(fā)射峰則為陽性結(jié)果，反之則為陰性。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測單增李斯特菌的方法，其特征在于，還包括制備標準曲 線及定量檢測的步驟：其中， 所述制備標準曲線的步驟包括：取單增李斯特菌菌株標準品配制成1-100倍梯度濃度 的系列標準品；并將上述濃度系列標準品分別用所述的試紙條進行免疫層析，熒光掃描所 述檢測線（4)和所述質(zhì)控線（5)，分別測定所述檢測線（4)和所述質(zhì)控線（5)區(qū)域的熒光強 度，制作抗原濃度與熒光強度比之間關(guān)系的標準曲線，并擬合方程； 所述定量檢測的步驟包括：取待測樣品以所述的試紙條進行免疫層析檢測，利用上述 標準曲線及方程計算得到所述單增李斯特菌濃度。
【文檔編號】G01N33/02GK104483459SQ201410815563
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月23日
【發(fā)明者】張捷, 王小晉, 王靜, 張錫全, 尚士進, 康西西, 張曉光, 舒咬根, 陳廣全 申請人:北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心, 中華人民共和國淮安出入境檢驗檢疫局, 威海出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心