專利名稱：干擾Bx-cpl-2基因表達(dá)的dsRNA載體及其在松材線蟲防治和研究中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物病蟲防治技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種干擾Βχ-cpl-l基因表達(dá)的 dsRNA載體及其在松材線蟲防治中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilu)是一種對(duì)森林具有極大危害的寄生線蟲，它主要危害松屬樹種為代表的針葉樹木。二十世紀(jì)，日本的松樹感染上松材線蟲后，遭到了毀滅性的破壞。在我國，松材線蟲病于1982年在南京首次被發(fā)現(xiàn)。之后，疫情迅速蔓延，對(duì)我國的松林資源照成了極大的破壞，其經(jīng)濟(jì)損失難以估量，松材線蟲病甚至已經(jīng)直接對(duì)我國的張家界等世界自然文化遺產(chǎn)景觀造成了威脅。松材線蟲病素有“松樹的癌癥”之稱，因?yàn)槠渎赢惓Ｑ杆?，一旦發(fā)病，樹木會(huì)很快死亡，因而防治難度非常之大。由于該病疫的傳播和人類的活動(dòng)有密切的關(guān)系，因此不少國家將其列為A類植物檢疫對(duì)象。為了避免松材線蟲病對(duì)我國的森林資源照成危害，對(duì)于松材線蟲病的防治迫在眉睫。松材線蟲病的傳播異常迅速，一旦疫情發(fā)生就難以控制。該病到目前為止仍然沒有得到有效的控制。因此，要始終堅(jiān)持以預(yù)防為主的政策，對(duì)于已經(jīng)受災(zāi)的地區(qū)要嚴(yán)格控制松材線蟲的蔓延。目前，主要可以通過兩種方法治療松材線蟲病。由于松材線蟲在樹干內(nèi)部，因此可以將殺蟲劑注射到樹干或澆灌到根部，另一種是用飛機(jī)噴撒化學(xué)藥劑來防治天牛。這兩種方法有一定療效，但是其性價(jià)比較低。對(duì)于樹干注射治療，其成本高，因此不適合大面積推廣；而用飛機(jī)噴撒化學(xué)藥劑來防治天牛，成本也比較昂貴，并且具有一定負(fù)面效應(yīng)。由于化學(xué)防治具有較多缺陷，因此人們開始更多地關(guān)注松材線蟲的生物防治。研究顯示許多真菌對(duì)線蟲的生存有抑制作用，如總狀共頭霉和日本亮耳菌等，但是由于松材線蟲的繁殖速度驚人，生物防治的作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)趕不上其擴(kuò)散速度。因此，已有的防治措施都無法有效防治松材線蟲。我們只能寄希望于致病機(jī)理研究上的突破。目前，最經(jīng)濟(jì)有效的途徑是利用分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)松樹的抗性基因進(jìn)行篩選，然后再通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)使松樹獲得對(duì)松材線蟲的抗性。半胱氨酸蛋白酶的活性位點(diǎn)含有半胱氨酸殘基。該酶廣泛存在于自然界的各種生物當(dāng)中，例如細(xì)菌、真菌、植物、哺乳動(dòng)物和人類等。因此，關(guān)于該酶的研究比較多。研究表明，半胱氨酸蛋白酶在線蟲入侵組織或細(xì)胞、提供胚胎發(fā)育所需的營養(yǎng)成分[12]、蛻皮[13]、消化宿主蛋白、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)以及逃避宿主免疫反應(yīng)的清除[14]等過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。半胱氨酸蛋白酶屬于蛋白水解酶的一類。該酶在生物體內(nèi)最開始合成時(shí)為一種前體物質(zhì)，該物質(zhì)包括兩個(gè)區(qū)前體區(qū)和催化區(qū)。半胱氨酸蛋白酶家族中有高度保守的典型的三聯(lián)體催化活性中心Cys-His-Asn[15]。線蟲半胱氨酸蛋白酶為線蟲的主要“消化酶”，通常表達(dá)在線蟲的食道腺和腸細(xì)胞中，發(fā)揮著蛋白水解活性。線蟲攝取食物、入侵宿主細(xì)胞以及免疫等方面的功能均與半胱氨酸蛋白酶有密切關(guān)系，因此，近年來對(duì)該酶的研究愈加廣泛深入。研究發(fā)現(xiàn)，半胱氨酸蛋白酶存在于多種線蟲體內(nèi)，不同的線蟲，分泌這種酶的部位不同，而且酶的分布部位也有所差異。有些線蟲的卵母細(xì)胞中包含L型半胱氨酸蛋白酶，如秀麗隱桿線蟲；在很多線蟲的不同發(fā)育期，蟲體腸腔內(nèi)中都發(fā)現(xiàn)了 B型和L型半胱氨酸蛋白酶，如捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Haemonchus controtus)和南方根結(jié)線蟲(Meloidyne incognita)。呂春花(呂春花.相似穿孔線蟲S型半胱氨酸蛋白酶基因克隆與序列分析[J]. 植物保護(hù)，2008，34 (5) :17-22.)等從松材線蟲中分離到半胱氨酸蛋白酶家族的兩個(gè)基因 (Bx-cpl-U Bx-cpl-2)并在大腸桿菌中初步表達(dá)，但并未揭示并證明這兩個(gè)基因在線蟲生活史中的功能。RNA干擾(RNAi)，是指由雙鏈RNA引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默的機(jī)制。隨著技術(shù)的發(fā)展，RNA干擾技術(shù)越來越受研究人員的關(guān)注。目前，RNA干擾技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于線蟲基因分析。R)rd[33]等通過RNA干擾分析組織蛋白類半胱氨酸蛋白酶基因在馬來絲蟲成蟲中的作用。用絲蟲CPL基因家族的Bm-cpl-1和Bm-cpl-5處理馬來絲蟲雌雄成蟲，或者用 Bm-cpz-ldsRNA處理，均導(dǎo)致了微絲蚴數(shù)量下降。通過Bm-cpl-5或Bm-cpl的dsRNA和siRNA 處理雌蟲子宮，結(jié)果顯示胚胎發(fā)育受到明顯影響，導(dǎo)致晶胚畸形和不同的胚胎階段。通過對(duì)秀麗桿線蟲L型組織蛋白酶(Ce-cpl-Ι)和Z型組織蛋白酶(Ce-cpz-Ι)進(jìn)行功能分析，確定了控制它們的兩種基因在早期的胚胎發(fā)育中都是必要的，Ce-cpl-Ι在卵黃蛋白分解期間起調(diào)控作用，Ce-cpz-Ι在蛻皮中起重要作用。對(duì)于RNA干擾的介導(dǎo)，目前，細(xì)菌介導(dǎo)的RNAi技術(shù)在模式線蟲基因功能的研究中起到了重要的作用，成為模式線蟲基因功能研究的主要方法。目前RNAi的手段也成為松材線蟲基因功能的一種重要方法，但是目前所采用的都是浸泡法，體外轉(zhuǎn)錄合成dsRNA浸泡松材線蟲來分析基因的功能，該方法存在著極大地不足，主要表現(xiàn)在不能持續(xù)干擾，而且極其不穩(wěn)定，如何實(shí)現(xiàn)RNA的穩(wěn)定干擾也是本發(fā)明進(jìn)一步需要實(shí)現(xiàn)的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根據(jù)上述領(lǐng)域存在的空白和松材線蟲防治的需要，提供一種干擾松材線蟲 Bx-cpl-2基因表達(dá)的dsRNA載體及該載體用于防治松材線蟲的方法。干擾松材線蟲Bx-cpl-2基因表達(dá)的dsRNA干擾載體，其特征在于，在骨架載體的多克隆位點(diǎn)上按順序正向插入有Bx-cpl-2基因的完整或部分正義鏈和與所述正義鏈互補(bǔ)的反義鏈。所述骨架載體為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的表達(dá)載體。所述正義鏈的核苷酸序列如kq ID No. 4所示，所述正義鏈的核苷酸序列如所示 Seq IDNo. 5所示，所述農(nóng)桿菌介導(dǎo)的載體為PHDT-RH，所述正義鏈插入在PHDT-RH的LB和 RB之間的5，端多克隆位點(diǎn)，所述反義鏈插入在PHDT-RH的LB和RB之間的3，端多克隆位點(diǎn)，得到的dsRNA干擾載體為PHD-RH-CPL1。轉(zhuǎn)入有上述dsRNA干擾載體的菌株。所述菌株指轉(zhuǎn)入有PHD-RH-CPL2的灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)。
上述dsRNA干擾載體在松材線蟲防治中的應(yīng)用。一種研究Bx-cpl-2基因功能的新方法，其特征在于，將權(quán)利要求1 3任一所述 dsRNA干擾載體轉(zhuǎn)化到絲狀真菌中，然后通過絲狀真菌轉(zhuǎn)化子的菌絲體飼喂松材線蟲，觀察松材線蟲的表型。所述絲狀真菌指灰葡萄孢菌。本發(fā)明的發(fā)明人對(duì)前人獲得的半胱氨酸蛋白酶基因Bx-cpl-2在線蟲生活史中的作用進(jìn)行研究，采用該基因的部分片段構(gòu)建成RNA干擾載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入灰葡萄孢菌中，然后將該轉(zhuǎn)基因灰霉菌絲飼養(yǎng)松材線蟲對(duì)松材線蟲的CPL進(jìn)行干擾試驗(yàn)，采用熒光定量PCR檢測(cè)被干擾的松材線蟲的半胱氨酸蛋白酶基因Bx-cpl-2的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)量，結(jié)果顯示，隨著干擾時(shí)間的增加，半胱氨酸蛋白酶基因的轉(zhuǎn)錄水平逐漸降低，與對(duì)照相比，感染效果具有顯著差異。半胱氨酸蛋白酶的活性測(cè)定顯示，Bx-cpl-2基因的表達(dá)連續(xù)被干擾 10代的松材線蟲，其半胱氨酸蛋白酶的活性降低8. 6%，其5天內(nèi)的繁殖量降低37%，線蟲體長也有明顯縮短。這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說明，Bx-cpl-2基因的表達(dá)在松材線蟲的胚胎發(fā)育過程中起著關(guān)鍵作用，因而干擾該基因的表達(dá)可以達(dá)到生物防治松材線蟲的目的?；谶@些實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明提供一種干擾松材線蟲Bx-cpl-2基因表達(dá)的dsRNA干擾載體，其特點(diǎn)就是在骨架載體中插入有Bx-cpl-2基因的完整的或部分片段的正義鏈和與該正義鏈完全互補(bǔ)的反義鏈，關(guān)于骨架載體，本領(lǐng)域技術(shù)人員可能選出很多用于RNA干擾載體構(gòu)建的常規(guī)骨架載體，構(gòu)建方法也是順序構(gòu)建入目的干擾基因片段的正義鏈和反義鏈?？梢允峭暾腂x-cpl-2基因，也可以是其中的部分片段，選取Bx-cpl-2基因的完整片段還是其中的哪一部分片段與所選用的骨架載體所具備的酶切位點(diǎn)有關(guān)，這種選取工作是本領(lǐng)域技術(shù)人員所具備的常規(guī)技能。本發(fā)明優(yōu)選骨架載體為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的表達(dá)載體，農(nóng)桿菌能夠攜帶目的基因轉(zhuǎn)移到多種生物體內(nèi)，除了自然界的植物之外，還包括酵母、絲狀真菌以及人的細(xì)胞等。與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化方法相比，AMT技術(shù)轉(zhuǎn)化效率高且遺傳穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)，因此，構(gòu)建成農(nóng)桿菌介導(dǎo)的 RNA干擾載體有利于使干擾片段轉(zhuǎn)入到較多種類的宿主中使其表達(dá)dsRNA，用于干擾松材線蟲。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，以PHDT-RH為骨架載體，以Bx-cpl-2基因中的如Seq ID No. 4所示的片段及其反義鏈為dsRNA干擾載體的核心片段構(gòu)建了 dsRNA干擾載體 PHD-RH-CPL2。將本發(fā)明要求保護(hù)的dsRNA干擾載體轉(zhuǎn)入到真菌、植物甚至動(dòng)物細(xì)胞中，用這些轉(zhuǎn)化的真菌、植物或動(dòng)物細(xì)胞飼喂松材線蟲，其表達(dá)dsRNA與松材線蟲的Bx-cpl-2相互作用使Bx-cpl-2基因的表達(dá)受到干擾從而影響松材線蟲的生長發(fā)育，達(dá)到防止的目的。本發(fā)明的實(shí)施例中，將構(gòu)建的dsRNA干擾載體PHD-RH-CPL1轉(zhuǎn)入到灰葡萄孢菌 (灰霉)中，獲得了可用于干擾松材線蟲Bx-cpl-2基因表達(dá)的灰霉轉(zhuǎn)化子。本發(fā)明的了一個(gè)貢獻(xiàn)還在于，提供了一種研究Bx-cpl-2在松材線蟲生長發(fā)育過程中的功能的研究方法，即將上述dsRNA干擾載體轉(zhuǎn)入到松材線蟲喜好的絲狀真菌中，然后用絲狀真菌轉(zhuǎn)化子的菌絲體飼喂各階段的松材線蟲，觀察松材線蟲的生長發(fā)育情況。


圖1.農(nóng)桿菌介導(dǎo)絲狀真菌轉(zhuǎn)化載體PHDT結(jié)構(gòu)示意圖；圖2.原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化絲狀真菌RNAi載體Psilent-I結(jié)構(gòu)示意圖；圖3.載體PHD-RH結(jié)構(gòu)示意圖；圖4.松材線蟲CPL基因部分片段的克隆產(chǎn)物電泳圖，M =DNA Marker 2000 ；2 :Bx-cpl_l 基因正義鏈擴(kuò)增結(jié)果；4 :Bx-cpl_l 基因反義鏈擴(kuò)增結(jié)果；6 :Bx-cpl-2基因正義鏈擴(kuò)增結(jié)果；8 :Bx-cpl-2基因反義鏈擴(kuò)增結(jié)果；其余為對(duì)照。圖5.菌液PCR電泳圖M :DNA Marker 2000 ；2-6，Βχ-cpl-l 基因正義鏈擴(kuò)增結(jié)果；8-12 :Bx-cpl_l 基因反義鏈擴(kuò)增結(jié)果；14-18 :Bx-cpl-2基因正義鏈擴(kuò)增結(jié)果；其余為對(duì)照。圖6. Hind III和Xba I雙酶切目的片段M =DNA Marker 2000 ； 1-6 含有插入片斷的載體pGM_T的酶切產(chǎn)物。圖7. HindIII和BglII雙酶切檢測(cè)正義鏈圖8. HindIII和BglII雙酶切檢測(cè)反義鏈圖9.潮霉素PCR電泳圖M =DNA Marker 2000 ； 1-3 潮霉素引物 PCR ；4 對(duì)照。圖10.目的片段PCR電泳圖M =DNA Marker 2000 ； 1-2 目的片段引物 PCR ；3 對(duì)照。圖11.干擾2代后Βχ-cpl-l基因的轉(zhuǎn)錄水平(Bar值為標(biāo)準(zhǔn)誤)圖12.干擾30代后Βχ-cpl-l基因的轉(zhuǎn)錄水平(Bar值為標(biāo)準(zhǔn)誤)圖13.干擾2代后Bx-cpl-2基因的轉(zhuǎn)錄水平(Bar值為標(biāo)準(zhǔn)誤)圖14.干擾30代后Bx-cpl-2基因的轉(zhuǎn)錄水平(Bar值為標(biāo)準(zhǔn)誤)圖15.干擾10代后以GLUpNA為底物的酶活性測(cè)定 對(duì)照；·干擾 CPLl ；Δ 干擾 CPL2圖16.干擾35代后以GLUpNA為底物的酶活性測(cè)定 對(duì)照；·干擾 CPLl ；Δ 干擾 CPL2圖17. RNA干擾影響松材線蟲成蟲的繁殖能力(Bar值為標(biāo)準(zhǔn)誤)圖18.干擾后的松材線蟲體長變化(Bar值為標(biāo)準(zhǔn)誤)。
具體實(shí)施例方式以下通過試驗(yàn)及數(shù)據(jù)具體說明本發(fā)明的實(shí)施和其取得的有益效果。生物材料松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus) (USl)來自美國，本實(shí)驗(yàn)室已進(jìn)行多年的傳代培養(yǎng)。灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)，由中國科學(xué)院微生物研究所提供。根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株 EHA105，商購。農(nóng)桿菌介導(dǎo)絲狀真菌轉(zhuǎn)化載體PHD-T (見圖1)，已知載體，由中國科學(xué)院微生物研究所劉杏忠研究員惠贈(zèng)。I^silent-l，為現(xiàn)有已知載體，由中國科學(xué)院微生物研究所劉杏忠研究員惠贈(zèng)。
申請(qǐng)人聲明，以上生物材料均在申請(qǐng)人實(shí)驗(yàn)室有保存，可向公眾發(fā)放用于驗(yàn)證試驗(yàn)。主要儀器和試劑儀器01ympus實(shí)體顯微鏡、美國Polyscience冷凍離心機(jī)(9500)、恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、電子天平、高壓滅菌鍋、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、水浴鍋、移液器、勻漿器、離心管、 槍頭、燒杯和PH計(jì)等。試劑提RNA用的Trizol Reagent, RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自hvitrogen公司；SanPrep柱式DNA小量抽提試劑盒和Sarfrep柱式DNA膠回收試劑盒均購自生工生物工程有限公司；TA克隆試劑盒、Tag DNA聚合酶、DNA Marker 2000和克隆所用的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞均購自天根生物公司；限制性內(nèi)切酶HindIII、BglII、XbaI和SpeI等均購自Takara生物公司。TAE 緩沖液(50X) =Tris 堿 242g，冰醋酸 57. Iml,0. 5mol/L EDTA(ρΗ8· 0) 100ml。土豆培養(yǎng)基(PDA)，用于培養(yǎng)灰葡萄孢菌稱取IOOg去皮馬鈴薯，切碎，加500ml 蒸餾水，煮沸30min。用紗布濾去馬鈴薯，補(bǔ)足500ml裝入三角瓶，調(diào)整pH值為6.0。再稱取IOg葡萄糖，7.5g瓊脂粉，加入三角瓶后搖勻。12rC，20min高壓蒸汽滅菌后倒入平板。LB培養(yǎng)基，用于大腸桿菌藍(lán)白斑篩選。酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCllOg/L。YEM培養(yǎng)基，分為固體和液體兩種，用于農(nóng)桿菌菌體的活化酵母粉0. 2g，甘露醇 5g, MgS04 · 7H20 0. lg, K2HP04 0. 25g, NaCl 0. 05g,瓊脂 6g,溶于水，定容至 500ml (液體培養(yǎng)基不加瓊脂)。匪培養(yǎng)基，為擴(kuò)大培養(yǎng)根癌農(nóng)桿菌時(shí)所用的基本培養(yǎng)基，500ml的配方如 T :5mlK-buffer(pH 7.0) :KH2P04 145g/L, K2HP04 200g/L ； IOml M-N =NaCl 7. 5g/ L，MgS04. 7H2015g/L ；5ml葡萄糖20g/L (過濾滅菌后置于4 °C冰箱儲(chǔ)存)；5ml FeS04 0. 01g/L(過濾滅菌后置于 4 °C 冰箱儲(chǔ)存)；0. 5ml CaC12. 2H20 lg/L ；2. 5ml Spore Elements(CuS04. 5H200.lg/L, ZnS04. 7H20 0. lg/L, Na2Mo04. 2H20 0.lg/L, MnS04. H20 0. lg/L, H3B03 0. lg/L) ；1. 25ml, NH4N03 20g/L ；470. 75ml 無菌水。IM培養(yǎng)基，用于誘導(dǎo)培養(yǎng)根癌農(nóng)桿菌，IL的配方0. 8ml 1. 25M K-buffer,(將pH 調(diào)至4. 9) ；20ml M-N =NaCl 15g/L，MgS04. 7H20 30g/L ；Iml CaCl2. 2H20 2g/L ； 10ml 50%甘油；2.5ml NH4N0320g/L ；5ml Spore Elements ；40ml MES IM (將 pH 調(diào)至 5. 5)，用 NaOH 調(diào)節(jié) PH值(過濾滅菌，4°C儲(chǔ)藏)；10ml FeS04 0. 01g/L (過濾滅菌，4°C儲(chǔ)藏)；IOml葡萄糖20g/ L(過濾滅菌)；2ml AS IOOmM(用無水乙醇溶解，放置于-20°C ) ；898. 7ml水。共培養(yǎng)培養(yǎng)基(Co-IM)，用于灰葡萄孢菌和根癌農(nóng)桿菌進(jìn)行共培養(yǎng)。配制時(shí)將誘導(dǎo)培養(yǎng)基IM中的葡萄糖用量減半?？敲顾厝苡谒?，配制濃度為10mg/ml，儲(chǔ)存于-20°C，使用時(shí)稀釋為IOyg/ ml ；利福平溶于甲醇中，配制濃度為10mg/ml，儲(chǔ)存于-20°C，使用時(shí)稀釋為34yg/ ml ；潮霉素50mg/ml，避光儲(chǔ)存于4°C，使用時(shí)稀釋為200 μ g/ml ；
頭孢霉素溶于水中，200mg/ml，儲(chǔ)存于_20°C，使用時(shí)稀釋為400μ g/ml。MES 緩沖液(pH5. 5) :MES 0. 15M, DTT 4Mm, EDTA 4mM底物GLUpNA (0. 5mg/mL) :1. 5mg 底物溶于 lmlDMSO，用 MES 緩沖液稀釋為 0. 5mg/ ml οSYBR Premix Ex Taq 購自 TaKaRa 公司。SYBR Mix 與染料混勻Mix lml, Dye II 200 μ 1。實(shí)施例1 構(gòu)建農(nóng)桿菌介導(dǎo)絲狀真菌表達(dá)dsRNA的載體-PHD-RH農(nóng)桿菌介導(dǎo)絲狀真菌轉(zhuǎn)化載體PHD-T，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化絲狀真菌RNAi載體 I^ilent-I (圖2)為已知載體，由中國科學(xué)院微生物研究所劉杏忠研究員惠贈(zèng)。載體PHD-RH的構(gòu)建主要以農(nóng)桿菌介導(dǎo)絲狀真菌轉(zhuǎn)化載體PHDT為骨架，對(duì)其T-DNA 區(qū)加以改造，由上海生物工程公司合成了一段DNA序列(Seq ID No. 1)，其結(jié)構(gòu)為KpnI酶切位點(diǎn)、構(gòu)巢曲霉色氨酸啟動(dòng)子、5’多克隆位點(diǎn)、內(nèi)含子、3’多克隆位點(diǎn)、構(gòu)巢曲霉色氨酸終
止子、Bstx I酶切位點(diǎn)(5，------3，)。將該合成的序列插入載體PHDT的Kpn I和Bstx
I位點(diǎn)之間，經(jīng)過陽性克隆鑒定后測(cè)序驗(yàn)證，得到的載體命名為PHD-R。其5’多克隆位點(diǎn)依次含有》io I,Snab I, HindIII, Xba I酶切位點(diǎn)，3，多克隆位點(diǎn)含有Mu I，spe LBglII, ApaI酶切位點(diǎn)。在載體PHD-R上添加潮霉素抗性基因作為選擇標(biāo)記。設(shè)計(jì)引物HYG-F和 HYG-R(兩端添加KPN I酶切位點(diǎn))以載體PHDT為模板擴(kuò)增得到潮霉素抗性基因HPH。擴(kuò)增產(chǎn)物連接于載體PHD-R，測(cè)序確認(rèn)后插入到載體PHD-R的Kpn I酶切位點(diǎn)，即獲得載體 PHD-RH(圖3)，酶切鑒定陽性克隆后測(cè)序確認(rèn)。HYG-F :5’ -TGGTACCTAGACGTTAACTGATATTGAA-3’HYG-R :5’ -TGGTACCTAAACCCAGGGCTGGTGACGGA-3’實(shí)施例2松材線蟲的培養(yǎng)和分離1.松材線蟲的培養(yǎng)松材線蟲用生長在PDA培養(yǎng)基上的灰葡萄孢菌培養(yǎng)。將PDA培養(yǎng)基在121°C高壓蒸汽滅菌20min，60°C左右時(shí)倒入培養(yǎng)皿；培養(yǎng)基冷卻后，在超凈臺(tái)中接入灰葡萄孢菌，置于25°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；3到4天后，用雙氧水將松材線蟲消毒后接入培養(yǎng)皿，置于25°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；6到7天后，從溫箱中取出培養(yǎng)皿置于4°C保存。2.松材線蟲的分離將養(yǎng)有松材線蟲的培養(yǎng)基用四層紗布包裹后，懸浮在盛有滅菌蒸餾水的燒杯中； 將燒杯置于25°C恒溫培養(yǎng)箱中靜置24h ；移走紗布和培養(yǎng)基，倒去上清；將剩余液體倒入滅菌的培養(yǎng)皿中，用移液器在顯微鏡下挑取松材線蟲，即可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3.總RNA的提取采用Trizol Reagent (購自Invitrogen)提取，操作參照說明書。4. cDNA第一鏈的合成合成cDNA時(shí)使用RT-PCR試劑盒(購自Invitrogen)，操作參照說明書，合成的 cDNA保存?zhèn)溆谩?.引物設(shè)計(jì)
Βχ-cpl-l 的 cDNA 全長為 1220bp, GenBank ID 為 EU651860。Bx-cpl-2 的 cDNA 全長為 1161bp, GenBank ID 為 EU659123。這兩個(gè)基因均由2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子組成。利用DNAMAN軟件分析目的片段與載體PHDT-RH上的酶切位點(diǎn)，篩選出目的基因中沒有而載體上有的酶切位點(diǎn)。在481bp處設(shè)計(jì)Βχ-cpl-l正義鏈引物和Βχ-cpl-l反義鏈引物，正義鏈引物插入 HindIII和Xba I酶切位點(diǎn)，反義鏈引物插入Spe I和BglII酶切位點(diǎn)。在830bp處設(shè)計(jì)Bx-cpl-2正義鏈引物和Bx-cpl-2反義鏈引物，正義鏈引物插入 HindIII和Xba I酶切位點(diǎn)，反義鏈引物插入Spe I和BglII酶切位點(diǎn)。表1.為Βχ-cpl-l和Bx-cpl-2基因引入酶切位點(diǎn)的引物
權(quán)利要求
1.干擾松材線蟲Bx-cpl-2基因表達(dá)的dsRNA干擾載體，其特征在于，在骨架載體的多克隆位點(diǎn)上按順序正向插入有Bx-cpl-2基因的完整或部分正義鏈和與所述正義鏈互補(bǔ)的反義鏈。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的dsRNA干擾載體，所述骨架載體為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的表達(dá)載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的dsRNA干擾載體，所述正義鏈的核苷酸序列如kqID No. 2所示，所述正義鏈的核苷酸序列如所示^^ ID似^所示，所述農(nóng)桿菌介導(dǎo)的載體為？皿！“-冊(cè)， 所述正義鏈插入在PHDT-RH的LB和RB之間的5，端多克隆位點(diǎn)，所述反義鏈插入在PHDT-RH 的LB和RB之間的3’端多克隆位點(diǎn)，得到的dsRNA干擾載體為PHD-RH-CPL1。
4.轉(zhuǎn)入有權(quán)利要求1 3任一所述dsRNA干擾載體的菌株。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的菌株，指轉(zhuǎn)入有PHD-RH-CPL1的灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)0
6.權(quán)利要求1 3任一所述dsRNA干擾載體在松材線蟲防治中的應(yīng)用。
7.一種研究Bx-cpl-2基因功能的新方法，其特征在于，將權(quán)利要求1 3任一所述 dsRNA干擾載體轉(zhuǎn)化到絲狀真菌中，然后通過絲狀真菌轉(zhuǎn)化子的菌絲體飼喂松材線蟲，觀察松材線蟲的表型。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的新方法，所述絲狀真菌指灰葡萄孢菌。
全文摘要
本發(fā)明“干擾Bx-cpl-2基因表達(dá)的dsRNA載體及其在松材線蟲防治和研究中的應(yīng)用”，屬于植物病蟲防治技術(shù)。所述dsRNA干擾載體，其特征在于，在骨架載體的多克隆位點(diǎn)上按順序正向插入有Bx-cpl-2基因的完整或部分正義鏈和與所述正義鏈互補(bǔ)的反義鏈。可用于松材線蟲的防治和研究。
文檔編號(hào)A01P5/00GK102250942SQ20111017538
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月27日
發(fā)明者成新躍, 梅眉, 王殿東, 白婷, 謝丙炎, 陳國華 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所