專利名稱：一種抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆的快速鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及除草劑生物測定技術(shù)及除草劑生物化學(xué)研究，具體涉及一種抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆的快速鑒定方法。
背景技術(shù)：
1985年，Comai等將鼠傷寒沙門氏桿菌Mlmonella的抗草甘膦突變基因(aroA) 轉(zhuǎn)移到煙草上，首次獲得了抗草甘膦的轉(zhuǎn)基因作物。1996年，抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆 (genetically engineered soybean,GE)由美國孟山都(Monsanto)公司開發(fā)并正式投入商業(yè)生產(chǎn)，由此拉開了抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物培育的序幕。此后，抗除草劑作物的研發(fā)及推廣突飛猛進(jìn)，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用國際服務(wù)組織(International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications，簡稱ISAAA)的數(shù)據(jù)表明，2009年全球轉(zhuǎn)基因作物的種植面積達(dá)到1. 34億hm2，其中，僅耐除草劑作物的種植面積就高達(dá)6920萬hm2，占總面積的 52%?？共莞熟⑥D(zhuǎn)基因大豆問世以來，在世界范圍內(nèi)迅速擴(kuò)大，截止2007年世界轉(zhuǎn)基因大豆種植面積已達(dá)8. 79億畝，占世界大豆種植總面積的64%。種植轉(zhuǎn)基因大豆的國家也在不斷增加，目前已有美國、巴西、阿根廷、烏拉圭、南非、巴拉圭等九個國家種植轉(zhuǎn)基因大豆。 轉(zhuǎn)基因大豆在上述國家種植面積也在不斷擴(kuò)大，目前巴西轉(zhuǎn)基因大豆種植面積已占大豆種植總面積的65%，美國達(dá)到81%，阿根廷、烏拉圭等國更是100%的種植轉(zhuǎn)基因大豆。如前所述，轉(zhuǎn)基因大豆的種植和推廣引起了農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域的重大變革，取得了巨大的經(jīng)濟(jì)效益，拉開了抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物培育的序幕。但是與此同時，抗性基因的流向和由此引發(fā)的食品安全性問題始終存在著巨大的爭議，甚至在一定程度上阻礙了轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展。因此，轉(zhuǎn)基因大豆的檢測就顯得尤為必要。目前針對抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆的檢測方法主要集中在分子檢測法和田間(溫室)抗性鑒定兩方面。前者由于儀器、試劑要求精確，成本較高，專一性強(qiáng)，多數(shù)的的科研院所不便開展，且只是針對靶標(biāo)基因進(jìn)行檢測，并不能驗(yàn)證靶標(biāo)基因的表達(dá)與否。后者雖然直觀準(zhǔn)確，但所需時間比較長、工作量大，且易受季節(jié)影響。因此，如何建立一種快速、易于開展的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆的檢測方法對于今后轉(zhuǎn)基因大豆的推廣和檢測具有指導(dǎo)性的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆的快速鑒定方法。本發(fā)明提供了輔助鑒別抗草甘膦植物和/或不抗草甘膦植物的方法，包括方法甲；所述方法甲包括如下步驟(1)至步驟(3)(1)將待測植物種子催芽后用50-150 (mg a. i. /L)的草甘膦溶液處理；(2)檢測步驟(1)植物的下胚軸中的莽草酸積累量；(3)根據(jù)步驟(2)得到的莽草酸積累量鑒別待測植物為候選的抗草甘膦植物還是候選的不抗草甘膦植物。
所述步驟(1)具體可為將待測植物種子催芽后置于兩層濾紙間，上層濾紙用水浸潤，下層濾紙用50-150 (mg a.i./L)的草甘膦溶液浸潤，25_27°C (如)、64_79% (如 65% )濕度黑暗培養(yǎng)66-78小時(如72小時)。所述步驟(3)具體可為如果所述莽草酸積累量為700ug/g Fff以上，待測植物為候選的不抗草甘膦植物；如果所述莽草酸積累量為lOOug/g Fff以下，待測植物為候選的抗草甘膦植物。所述步驟(1)中，所述草甘膦溶液的濃度具體可為50-100 (mg a. i. /L)；所述步驟 (3)具體可為如果所述莽草酸積累量為700ug/g Fff以上，待測植物為候選的不抗草甘膦植物；如果所述莽草酸積累量為70ug/g Fff以下，待測植物為候選的抗草甘膦植物。所述步驟(1)中，所述草甘膦溶液的濃度具體可為100_150(mg a. i. /L)；所述步驟⑶具體可為如果所述莽草酸積累量為1 lOOug/g FW以上，待測植物為候選的不抗草甘膦植物；如果所述莽草酸積累量為90ug/g Fff以下，待測植物為候選的抗草甘膦植物。所述步驟(1)中，所述草甘膦溶液的濃度具體可為50(mg a. i. /L)；所述步驟(3) 具體可為如果所述莽草酸積累量為720ug/g Fff以上，待測植物為候選的不抗草甘膦植物；如果所述莽草酸積累量為45ug/g Fff以下，待測植物為候選的抗草甘膦植物。所述步驟⑴中，所述草甘膦溶液的濃度具體可為100 (mg a. i. /L)；所述步驟(3) 具體可為如果所述莽草酸積累量為1200ug/g Fff以上，待測植物為候選的不抗草甘膦植物；如果所述莽草酸積累量為61ug/g Fff以下，待測植物為候選的抗草甘膦植物。所述步驟(1)中，所述草甘膦溶液的濃度具體可為150 (mg a. i. /L)；所述步驟(3) 具體可為如果所述莽草酸積累量為1750ug/g Fff以上，待測植物為候選的不抗草甘膦植物；如果所述莽草酸積累量為85ug/g Fff以下，待測植物為候選的抗草甘膦植物。所述步驟(1)中，所述催芽的方法具體如下將所述待測植物種子于25°C水中浸泡乩，然后27°C培養(yǎng)12h。所述方法還可包括將進(jìn)行所述步驟(1)前的所述待測植物種子進(jìn)行消毒的步驟； 所述消毒的方法為將植物種子用水沖洗，然后在70% (體積比)乙醇水溶液中處理50s， 然后在0. 1% (g/100mL)HgCl水溶液中處理15min，然后用水沖洗。所述方法還可包括方法乙；將所述方法甲中得到的候選的抗草甘膦植物或候選的不抗草甘膦植物作為初步鑒別的待測植物進(jìn)行所述方法乙；所述方法乙包括如下步驟(4) 至步驟(6)(4)將所述初步鑒別的待測植物種子催芽后用100-2000 (mg a. i. /L)的草甘膦溶液處理，作為實(shí)驗(yàn)組；將所述初步鑒別的待測植物種子催芽后用水處理，作為對照組；(5)檢測步驟的實(shí)驗(yàn)組植物的下胚軸抑制率；所述下胚軸抑制率=(對照組植物的下胚軸長度-實(shí)驗(yàn)組植物的下胚軸長度)/對照組植物的下胚軸長度X100% ；(6)根據(jù)步驟( 得到的下胚軸抑制率鑒別待測植物為候選的抗草甘膦植物還是候選的不抗草甘膦植物。所述步驟(4)具體可為將所述初步鑒別的待測植物種子催芽后置于兩層濾紙間，上層濾紙用水浸潤，下層濾紙用100-2000 (mg a. i. /L)的草甘膦溶液浸潤，25_27°C (如 260C ) ,64-79% (如65% )濕度黑暗培養(yǎng)66-78小時(如72小時)，作為實(shí)驗(yàn)組；將所述初步鑒別的待測植物種子催芽后置于兩層濾紙間，上層濾紙用水浸潤，下層濾紙用水浸潤，25-270C (如) >64-79% (如65% )濕度黑暗培養(yǎng)66-78小時(如72小時)，作為對照組。所述步驟(6)具體可為如果所述下胚軸抑制率大于50%，待測植物為候選的不抗草甘膦植物；如果所述下胚軸抑制率小于50%，待測植物為候選的抗草甘膦植物。所述步驟(4)中，所述草甘膦溶液的濃度具體可為100-1000 (mg a. i. /L)；所述步驟(6)具體可為如果所述下胚軸抑制率大于50%，待測植物為候選的不抗草甘膦植物；如果所述下胚軸抑制率小于40%，待測植物為候選的抗草甘膦植物。所述步驟中，所述草甘膦溶液的濃度具體可為1000-2000(mg a. i./L)；所述步驟(6)具體可為如果所述下胚軸抑制率大于90%，待測植物為候選的不抗草甘膦植物； 如果所述下胚軸抑制率小于50%，待測植物為候選的抗草甘膦植物。所述步驟(4)中，所述草甘膦溶液的濃度具體可為100 (mg a. i. /L)；所述步驟(6) 具體可為如果所述下胚軸抑制率大于50%，待測植物為候選的不抗草甘膦植物；如果所述下胚軸抑制率小于15%，待測植物為候選的抗草甘膦植物。所述步驟(4)中，所述草甘膦溶液的濃度具體可為1000 (mg a. i. /L)；所述步驟 (6)具體可為如果所述下胚軸抑制率大于95%，待測植物為候選的不抗草甘膦植物；如果所述下胚軸抑制率小于35%，待測植物為候選的抗草甘膦植物。所述步驟(4)中，所述草甘膦溶液的濃度具體可為2000 (mg a. i. /L)；所述步驟 (6)具體可為如果所述下胚軸抑制率大于98%，待測植物為候選的不抗草甘膦植物；如果所述下胚軸抑制率小于50%，待測植物為候選的抗草甘膦植物。所述步驟中，所述催芽的方法具體如下將所述待測植物種子于25°C水中浸泡乩，然后27°C培養(yǎng)12h。所述方法還包括將進(jìn)行所述步驟(4)前的所述初步鑒別的待測植物種子進(jìn)行消毒的步驟；所述消毒的方法為將植物種子用水沖洗，然后在70% (體積比)乙醇水溶液中處理50s，然后在0. 1% (g/100mL)HgCl水溶液中處理15min，然后用水沖洗。所述待測植物具體可為大豆，如東農(nóng)42 (不抗草甘膦大豆)或大豆品種AZ04(轉(zhuǎn)基因大豆；抗草甘膦大豆)。利用本發(fā)明公開的檢測方法進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明該方法可以快速的進(jìn)行抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆室內(nèi)生物測定方法可以快速檢測轉(zhuǎn)基因大豆，克服了分子檢測中只是針對靶標(biāo)基因進(jìn)行檢測且不能驗(yàn)證靶標(biāo)基因的表達(dá)與否的問題和田間溫室表型鑒定中但所需時間比較長、工作量大，且易受季節(jié)影響的缺點(diǎn)。


圖1為不抗草甘膦大豆的莽草酸積累量標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2為抗草甘膦大豆的莽草酸積累量標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖3為不抗草甘膦大豆的下胚軸抑制率標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖4為抗草甘膦大豆的下胚軸抑制率標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖5為不同的草甘膦濃度處理后大豆的照片(G為AZ04 ；G親本為東農(nóng)42)。
具體實(shí)施方式
以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。a. i.的含義為有效劑量，以“所施加的草甘膦濃度為IOOmg a. i./L”為例，就是指每升溶液含有IOOmg有效劑量的草甘膦。草甘膦購自美國孟山都公司，為41%水劑，使用時用水稀釋至預(yù)期的濃度，濃度以有效劑量計。實(shí)施例1、輔助鑒定抗草甘膦大豆的方法的建立一、莽草酸積累量檢測方法1、標(biāo)準(zhǔn)數(shù)學(xué)模型的建立通過莽草酸的積累量與草甘膦的濃度之間的關(guān)系，以植株體內(nèi)的莽草酸含量(Ug/ g FW;即每克鮮重的下胚軸中積累的莽草酸的微克數(shù))為縱坐標(biāo)，所施加的草甘膦濃度(mg a. i. /L)為橫坐標(biāo)，分別建立不抗草甘膦大豆和抗草甘膦大豆的標(biāo)準(zhǔn)曲線。不抗草甘膦大豆的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，直線方程為y = 10. 335X+204. 42，相關(guān)系數(shù)為0. 9978，抗草甘膦大豆的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，直線方程為y = 0. 3945X+25. 156，相關(guān)系數(shù)為0. 9944。2、鑒別標(biāo)準(zhǔn)值的確定在IOOmg a. i./L的草甘膦劑量下不抗草甘膦大豆的莽草酸積累量約為 1237. 7(ug/g FW)，95%置信區(qū)間為986. 56-1589. 37 (ug/g Fff)；抗草甘膦大豆的莽草酸積累量只有64.61(ug/g FW)，95%置信區(qū)間為57. 63-85. 36 (ug/g FW)。二者之間有顯著性差
已所以可以采用如下方法鑒別不抗草甘膦大豆和抗草甘膦大豆對待測大豆給予 50-150(優(yōu)選為100) (mg a. i. /L)的草甘膦。黑暗條件下培養(yǎng)后檢測植株的莽草酸含量，根據(jù)莽草酸含量鑒別不抗草甘膦大豆和抗草甘膦大豆。通常常規(guī)栽培大豆均為不抗草甘膦大豆，抗草甘膦大豆均為轉(zhuǎn)基因大豆。二、胚軸檢測方法通過下胚軸抑制率與草甘膦的濃度之間的關(guān)系，以植株的下胚軸抑制率的機(jī)率值 D(將用草甘膦處理后的植株的下胚軸長度作為長度A，未經(jīng)草甘膦處理的平行植株的下胚軸長度作為長度B ；長度B與長度A的差值再除以長度B，然后乘以100%得到的的數(shù)值為 C，查抑制率機(jī)率值表，得到C對應(yīng)的機(jī)率值為D)為縱坐標(biāo)，以10為底所施加的草甘膦濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，分別建立不抗草甘膦大豆和抗草甘膦大豆的標(biāo)準(zhǔn)曲線。不抗草甘膦大豆的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3，直線方程為y = 1. 4191+1. 8453x，相關(guān)系數(shù)為0. 9901，下胚軸抑制率為 50%時的(即LD50)草甘膦濃度為87. 20 (mg a. i. /L)。95%置信區(qū)間為78. 04-97. 43 (下胚軸抑制率)?？共莞熟⒋蠖沟臉?biāo)準(zhǔn)曲線見圖4，直線方程為y = 1.4067+1. 0946x，相關(guān)系數(shù)為0.9928，下胚軸抑制率為50% (即LD5tl)時的草甘膦濃度為1917. 89 (mg a. i./L), 95% 置信區(qū)間為1620. 86-2269. 33(下胚軸抑制率)。不同的草甘膦濃度處理后大豆的照片見圖 5。2、鑒別標(biāo)準(zhǔn)值的確定根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和置信區(qū)間來看，在IOOmg a. i. /L的草甘膦劑量下，不抗草甘膦大豆的下胚軸抑制率約為50%，抗草甘膦大豆的下胚軸抑制率只有10%，二者之間有顯著性差異；而在2000mg a. i. /L的草甘膦劑量下，抗草甘膦大豆的下胚軸抑制率約為100%，抗草甘膦大豆的下胚軸抑制率只有50%，二者之間有顯著性差異。所以可以采用如下方法鑒別不抗草甘膦大豆和抗草甘膦大豆對待測大豆給予 100-2000mg a. i. /L的草甘膦，以未經(jīng)草甘膦處理的平行植株作為對照，黑暗條件下培養(yǎng)后檢測下胚軸抑制率，根據(jù)下胚軸抑制率鑒別不抗草甘膦大豆和抗草甘膦大豆。通常常規(guī)栽培大豆均為不抗草甘膦大豆，抗草甘膦大豆均為轉(zhuǎn)基因大豆。實(shí)施例2、抗草甘膦大豆和不抗草甘膦大豆的鑒別一、實(shí)驗(yàn)樣本東農(nóng)42 (不抗草甘膦大豆)購自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所。AZ04(轉(zhuǎn)基因大豆；抗草甘膦大豆)參考文獻(xiàn)陶波，蔣凌雪，沈曉峰，欒鳳俠， 邱麗娟.抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆對根基和非根基土壤可培養(yǎng)菌的影響，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2011,42(1) :10-16。二、通過莽草酸積累量進(jìn)行鑒別1、將各個實(shí)驗(yàn)樣本分別進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)(1)實(shí)驗(yàn)樣本的消毒將實(shí)驗(yàn)樣本(待測大豆種子)用自來水沖洗15min，先在70% (體積比)乙醇水溶液中處理50s，然后再在0. 1% (g/100mL) HgCl水溶液中處理15min，在然后再用無菌水沖洗3次。(2)催芽將步驟1得到的大豆種子25°C溫水中浸泡他，然后27°C培養(yǎng)12h。(3)在預(yù)先鋪有一層濾紙、直徑12cm的滅菌培養(yǎng)皿中加12mL IOOmg a. i. /L的草甘膦溶液，然后均勻的擺放芽長一致的大豆種子10粒，上覆一層濾紙保濕，置于溫度為 ^°C、濕度為65%的恒溫恒濕的培養(yǎng)箱中，不照光持續(xù)黑暗培養(yǎng)72h。(4)取步驟3得到的大豆的下胚軸，檢測莽草酸積累量(莽草酸積累量的檢測方法見文獻(xiàn)婁遠(yuǎn)來，鄧淵鈺，沈晉良等.2005.甲磺隆和草甘膦對空心蓮子草乙酰乳酸合酶活性和莽草酸含量的影響[J].植物保護(hù)學(xué)報，32 185 188)。東農(nóng)42莽草酸的積累量為1200. 78ug/g Fff, AZ04的莽草酸積累量為60. 38ug/ gFW，二者之間有顯著性差別。東農(nóng)42為已知非轉(zhuǎn)基因大豆，AZ04W為轉(zhuǎn)基因大豆。2、將各個實(shí)驗(yàn)樣本分別進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)改為使用50mg a. i. /L的草甘膦溶液，其它同步驟1。東農(nóng)42莽草酸的積累量為721. 17ug/g Fff, AZ04的莽草酸積累量為44. 88ug/g FW，二者之間有顯著性差別。東農(nóng)42為已知非轉(zhuǎn)基因大豆，AZ04W為轉(zhuǎn)基因大豆。3、將各個實(shí)驗(yàn)樣本分別進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)改為使用150mg a. i. /L的草甘膦溶液，其它同步驟1。東農(nóng)42莽草酸的積累量為1754. 67ug/g Fff, AZ04的莽草酸積累量為84. 331ug/ gFW，二者之間有顯著性差別。東農(nóng)42為已知非轉(zhuǎn)基因大豆，AZ04W為轉(zhuǎn)基因大豆。三、通過下胚軸抑制率進(jìn)行鑒別1、將各個實(shí)驗(yàn)樣本分別進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)(1)實(shí)驗(yàn)樣本的消毒將實(shí)驗(yàn)樣本(待測大豆種子)用自來水沖洗15min，先在70% (體積比)乙醇水溶液中處理50s，然后再在0. 1% (g/100mL) HgCl水溶液中處理15min，在然后再用無菌水沖洗3次。(2)催芽將步驟(1)得到的大豆種子25°C溫水中浸泡他，然后27°C培養(yǎng)12h。(3)在預(yù)先鋪有一層濾紙、直徑12cm的滅菌培養(yǎng)皿中加12mL IOOmg a. i. /L的草甘膦溶液，然后均勻的擺放芽長一致的大豆種子10粒，上覆一層濾紙保濕，置于溫度為 ^rc、濕度為65%的恒溫恒濕的培養(yǎng)箱中，不照光持續(xù)黑暗培養(yǎng)72h，作為實(shí)驗(yàn)組；用無菌水代替草甘膦溶液，其它同實(shí)驗(yàn)組，作為對照組。(4)測量步驟C3)得到的大豆的下胚軸，將實(shí)驗(yàn)組大豆的平均下胚軸長度數(shù)值作為數(shù)值A(chǔ)，將對照組大豆的平均下胚軸長度數(shù)值作為數(shù)值B，計算下胚軸抑制率，下胚軸抑制率=(B-A)/B X 100%。東農(nóng)42下胚軸抑制率為51. 36%, AZ04的下胚軸抑制率為12. 37%，二者之間有顯著性差別。東農(nóng)42為已知非轉(zhuǎn)基因大豆，AZ04W為轉(zhuǎn)基因大豆。2、將各個實(shí)驗(yàn)樣本分別進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)改為使用2000mg a. i. /L的草甘膦溶液，其它同步驟1。東農(nóng)42下胚軸抑制率為98. 99%, AZ04的下胚軸抑制率為49. 36%，二者之間有顯著性差別。東農(nóng)42為已知非轉(zhuǎn)基因大豆，AZ04W為轉(zhuǎn)基因大豆。3、將各個實(shí)驗(yàn)樣本分別進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)改為使用IOOOmg a. i. /L的草甘膦溶液，其它同步驟1。東農(nóng)42下胚軸抑制率為97. 63%, AZ04的下胚軸抑制率為33. 78%，二者之間有顯著性差別。東農(nóng)42為已知非轉(zhuǎn)基因大豆，AZ04W為轉(zhuǎn)基因大豆。
權(quán)利要求
1.輔助鑒別抗草甘膦植物和/或不抗草甘膦植物的方法，包括方法甲；所述方法甲包括如下步驟⑴至步驟⑶(1)將待測植物種子催芽后用50-150mga. i. /L的草甘膦溶液處理；(2)檢測步驟(1)植物的下胚軸中的莽草酸積累量；(3)根據(jù)步驟( 得到的莽草酸積累量鑒別待測植物為候選的抗草甘膦植物還是候選的不抗草甘膦植物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(1)為將待測植物種子催芽后置于兩層濾紙間，上層濾紙用水浸潤，下層濾紙用50-150mg a. i. /L的草甘膦溶液浸潤， 25-27°C、64-79%濕度黑暗培養(yǎng)66-78小時。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟(3)為如果所述莽草酸積累量為 700ug/g Fff以上，待測植物為候選的不抗草甘膦植物；如果所述莽草酸積累量為lOOug/g Fff以下，待測植物為候選的抗草甘膦植物。
4.如權(quán)利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于所述步驟(1)中，所述催芽的方法如下將所述待測植物種子于25°C水中浸泡他，然后27°C培養(yǎng)12h。
5.如權(quán)利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述方法還包括將進(jìn)行所述步驟(1)前的所述待測植物種子進(jìn)行消毒的步驟；所述消毒的方法為將植物種子用水沖洗， 然后在70% (體積比)乙醇水溶液中處理50秒，然后在0. 1 % HgCl水溶液中處理15分鐘， 然后用水沖洗。
6.如權(quán)利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于所述方法還包括方法乙；將所述方法甲中得到的候選的抗草甘膦植物或候選的不抗草甘膦植物作為初步鑒別的待測植物進(jìn)行所述方法乙；所述方法乙包括如下步驟(4)至步驟(6)(4)將所述初步鑒別的待測植物種子催芽后用100-2000mga. i. /L的草甘膦溶液處理，作為實(shí)驗(yàn)組；將所述初步鑒別的待測植物種子催芽后用水處理，作為對照組；(5)檢測步驟的實(shí)驗(yàn)組植物的下胚軸抑制率；所述下胚軸抑制率=(對照組植物的下胚軸長度-實(shí)驗(yàn)組植物的下胚軸長度)/對照組植物的下胚軸長度X 100% ；(6)根據(jù)步驟( 得到的下胚軸抑制率鑒別所述初步鑒別的待測植物為候選的抗草甘膦植物還是候選的不抗草甘膦植物。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述步驟(4)為將所述初步鑒別的待測植物種子催芽后置于兩層濾紙間，上層濾紙用水浸潤，下層濾紙用100-2000mga. i./L的草甘膦溶液浸潤，25-27°C、64-79%濕度黑暗培養(yǎng)66-78小時，作為實(shí)驗(yàn)組；將待測所述初步鑒別的待測植物種子催芽后置于兩層濾紙間，上層濾紙用水浸潤，下層濾紙用水浸潤， 25-27°C、64-79%濕度黑暗培養(yǎng)66-78小時，作為對照組。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述步驟(6)為如果所述下胚軸抑制率大于50%，所述初步鑒別的待測植物為候選的不抗草甘膦植物；如果所述下胚軸抑制率小于 50%，所述初步鑒別的待測植物為候選的抗草甘膦植物。
9.如權(quán)利要求6至8中任一所述的方法，其特征在于所述步驟(6)中，所述催芽的方法如下將所述初步鑒別的待測植物種子于25°C水中浸泡他，然后27°C培養(yǎng)12h。
10.如權(quán)利要求6至9中任一所述的方法，其特征在于所述方法還包括將進(jìn)行所述步驟(4)前的所述初步鑒別的待測植物種子進(jìn)行消毒的步驟；所述消毒的方法為將植物種子用水沖洗，然后在70% (體積比)乙醇水溶液中處理50s，然后在0. HgCl水溶液中處理15min，然后用水沖洗。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆的快速鑒定方法。本發(fā)明提供了輔助鑒別抗草甘膦大豆和/或不抗草甘膦大豆的方法，包括方法甲；方法甲包括如下步驟(1)將待測大豆種子催芽后用50-150mg a.i./L的草甘膦溶液處理；(2)檢測大豆的下胚軸中的莽草酸積累量；(3)根據(jù)莽草酸積累量鑒別待測大豆為候選的抗草甘膦大豆還是候選的不抗草甘膦大豆。利用本發(fā)明公開的檢測方法進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明該方法可以快速的進(jìn)行抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆室內(nèi)生物測定方法可以快速檢測轉(zhuǎn)基因大豆，克服了分子檢測中只是針對靶標(biāo)基因進(jìn)行檢測且不能驗(yàn)證靶標(biāo)基因的表達(dá)與否的問題和田間溫室表型鑒定中但所需時間比較長、工作量大，且易受季節(jié)影響的缺點(diǎn)。
文檔編號A01C1/02GK102388697SQ20111018787
公開日2012年3月28日 申請日期2011年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月6日
發(fā)明者張慶賀, 陶波, 韓玉軍, 馬紅 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)