專利名稱：一種植物不育系和恢復(fù)系的制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程、生物技術(shù)、作物遺傳育種領(lǐng)域。具體涉及一種在植物中人工創(chuàng)建不育系和恢復(fù)系的制備方法，還涉及雄性不育系、恢復(fù)系在油菜雜交種子生產(chǎn)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
大多數(shù)真核生物成熟mRNA分子都有一段poly (A)尾巴，它與mRNA的穩(wěn)定性及翻譯的起始調(diào)節(jié)有關(guān)。Poly(A)結(jié)合蛋白(poly(A)binding protein,PABP)廣泛存在于真核生物不同類型的細(xì)胞中，與25bp或更長的poly (A)有很強(qiáng)的親和力(Sachs A B,Davis R W and Kornberg R. D. A single domain of yeast poly(A)-binding protein is necessary and sufficient for RNA binding and cell viability. Mol Cell Biol. ,1987,7(9) 3268-3276.)。PABP蛋白可以和最短包括12個腺嘌呤的聚合體結(jié)合，形成一個復(fù)合體， 該復(fù)合體最多可以覆蓋27個腺嘌呤片段(Baer W, Kornberg D. Repeating structure of cytoplasmic poly(A)-ribonucleoprotein.Proc Natl Acad Sci USA 1980,77: 1890-1892.), PABP蛋白主要是通過三級結(jié)構(gòu)中的RRM(RNA recognition motif)來識別 Poly (A)序列(Burd G, Dreyfuss G. Conserved structures and diversity of functions of RNA-binding proteins. Science 1994,265:615-621·)。目前對細(xì)胞核PABP的研究比細(xì)胞質(zhì)PABP研究要落后，主要是因為它們的晶體和NMR(nuclear magnetic resonance)結(jié)構(gòu)還沒有確定。盡管如此，目前已有研究確定在其N末端有一個RRM結(jié)構(gòu)域，在C末端有一個富含精氨酸的結(jié)構(gòu)域(Wahle E，Ruegsegger U:3_end processing of pre—mRNA in eukaryotes. FEMS Microbiol Rev 1999,23: 277-295.) ο酵母的存活必須有細(xì)胞核PABP的存在，它由基因NAP2編碼(David A Mangus, Matthew C Evans, Allan Jacobson.Poly (A)-binding proteins !multifunctional scaffolds for the posttranscriptional control of gene expression Genome Biol. 2003 ；4 (7) :223.)。PABP蛋白在基因表達(dá)過程中起著重要的作用。作為順式作用因子結(jié)合在新合成或者成熟的mRNA上，在轉(zhuǎn)錄本的多腺嘌呤化、運輸、翻譯的起始等過程起著特殊的作用。它通過與poly㈧尾巴的結(jié)合至少在以下三個方面調(diào)節(jié)mRNA的轉(zhuǎn)錄后加工 mRNA的生物合成，mRNA降解和蛋白質(zhì)合成的起始(Dmitry A. Belostotsky. Unexpected Complexity of Poly (A)-Binding Protein Gene Families in Flowering Plants :Three Conserved Lineages That Are at Least 200Million Years Old and Possible Auto-and Cross-Regulation Genetics. 163(1) :311-319)。對 Poly(A)結(jié)合蛋白的研究表明它們都存在四個串聯(lián)的RNA識別結(jié)構(gòu)域(RNA recognition motif, RRM)。盡管這四個RRM存在差異，但其三維結(jié)構(gòu)相似，都包含能夠識別并結(jié)合Poly(A)的β 1-α 1-β 2-β 3-α 2-β 4 結(jié)構(gòu)(Dreyfuss G, M J Matunis, S Pinol-Roma, and C G Burd. hnRNP Proteins and the Biogenesis of mRNA. Annual Review of Biochemistry. 1993，62) 。)^PABP_@的研究主要集中在在酵母和動物中，它們的一級結(jié)構(gòu)和基因結(jié)構(gòu)都具有保守性，而對高等植物的研究較少。在酵母細(xì)胞中PABP基因的缺失突變體是致死型的，這表明該基因在生命過程中起著重要的作用，而擬南芥PABP5基因是花藥特異性表達(dá)的，并且它可以互補(bǔ)酵母的缺失突變體，恢復(fù)酵母細(xì)胞的活性(Belostotsky D A,Meagher R B. A pollen-, ovule-, and early embryo-specific poly (A)binding protein from Arabidopsis complements essential functions in yeast. Plant Cell, 1996,8(8) :1261-75.)。由此推測該基因在小孢子發(fā)育過程中可能也起到重要的作用，它的缺失可能會引起植物的敗育。目前已經(jīng)從酵母(Sachs Α. B, Bond Μ. W. and Kongherg R. D. A single gene from yeast for both nuclear and cytoplasmic polyadenylate-binding proteins domain structure and expression. Cell, 1986,20 ；45 (6) :827-35.)、爪魅(Lefrere V， Vincent A，Amalric F Drosophila melanogaster poly (A)-binding protein :cDNA cloning reveals an unusually long 3 ' -untranslated region of the mRNA, also present in other eukaryotic species. Gene,1990,15 ；96 (2) :219-25.)、人(Grange T，de Sa CM，Oddos J， Pictet Ra1. Human mRNA polyadenylate binding protein !evolutionary conservation of a nucleic acid binding motif. Nucleic Acids Res. 1987June，15(12) :4771-4787.)、 擬南芥(Belostotsky D A，Meagher R B. Differential organ-specific expression of three poly (A)-binding-protein genes from Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci U S A. 1993,90(14) :6686-6690.)、胡蘿卜(林慧馨，張雷，楊志攀，黃美娟，吳乃虎.胡蘿卜DcPAB基因的分離及其結(jié)構(gòu)與功能分析.生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2004， 20(3) :319-324.)、小麥(Hanh. Le, Su-chih. Chang, Tanguay R. L, Gallie D. R. The wheat poly (A)-binding protein functionally complements pabl in yeast. Eur. J. Biochem, 1997,243(1-2) :350-7)等物種中分離到了 PABP基因，但是尚無油菜PABP基因功能的相關(guān)研究報告。雜種優(yōu)勢是生物界的普遍現(xiàn)象，利用雜種優(yōu)勢是提高作物的產(chǎn)量、改良作物品質(zhì)、 提高作物抗逆、抗病等性狀的有效途徑，目前玉米、水稻、高粱、小麥、棉花、油菜、辣椒等糧食和蔬菜作物等雜交種的增產(chǎn)效應(yīng)已經(jīng)在實際生產(chǎn)中起到了關(guān)鍵作用，產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)和社會效益。目前國內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)了多種類型的細(xì)胞核雄性不育材料，并在理論和應(yīng)用方面取得了重要進(jìn)展，而新型不育源的發(fā)現(xiàn)和研究一直是雜種優(yōu)勢研究的基礎(chǔ)，并以此創(chuàng)造出更多的天然和人工不育材料，為育種和生產(chǎn)所應(yīng)用。實現(xiàn)雜種優(yōu)勢的先決條件是找到合適的不育和恢復(fù)系，然而通過常規(guī)方法選育新的優(yōu)良恢復(fù)系和純合不育系，周期長、規(guī)模大、 見效慢。因此，本發(fā)明開發(fā)了一種在植物中人工產(chǎn)生不育系和恢復(fù)系的方法以及該方法在雜交種子生產(chǎn)中的應(yīng)用。本方法以野生型植物為轉(zhuǎn)基因受體，通過基因工程的手段，應(yīng)用 PABP5基因，通過干擾PABP5基因的表達(dá)，人工創(chuàng)建不育系，通過過表達(dá)直系同源的PABP5基因，人工創(chuàng)建恢復(fù)系。該方法可以人工創(chuàng)建在雜交制種過程中需要的不育系和恢復(fù)系，具有一定的開發(fā)價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種人工創(chuàng)建雄性不育系的方法，該方法通過抑制PABP5基因在花藥中的表達(dá)，降低植物的育性，從而獲得雄性不育植株，作為雄性不育系應(yīng)用于雜交制種中。而且該基因在其它大部分植物組織中不表達(dá)或微量表達(dá)，因此在植物中抑制該基因的表達(dá)不會在植物營養(yǎng)生長階段引起表型的變化。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種人工創(chuàng)建恢復(fù)系的方法，該方法通過在其自身啟動子的驅(qū)動下過表達(dá)直系同源PABP5基因，獲得轉(zhuǎn)基因植株，通過該轉(zhuǎn)基因植株和本發(fā)明中人工創(chuàng)建的不育系進(jìn)行雜交，具有恢復(fù)不育系育性的作用。本發(fā)明的再一個目的是在于提供了一種雄性不育系和恢復(fù)系在油菜雜交制種中的應(yīng)用，人工實現(xiàn)雜交育種過程中的三系配套方法，應(yīng)用該方法，可以實現(xiàn)雜交育種過程中的三系配套。這一人工三系配套方法在生產(chǎn)雜交種的過程中有一定的應(yīng)用價值。為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案為了獲得本發(fā)明，發(fā)明人對油菜、擬南芥花粉發(fā)育過程中的相關(guān)基因進(jìn)行了深入和全面的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一個新基因，該基因在可育植株的花藥中高效表達(dá)，而在不育植株中不表達(dá)。并且通過轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炓沧C實了抑制該基因的表達(dá)會造成植物花粉發(fā)育的異常，導(dǎo)致雄性不育；通過轉(zhuǎn)基因的實驗證實過表達(dá)該基因的直系同源基因，對植物本身無影響；過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株與轉(zhuǎn)基因不育植株雜交，獲得的后代表現(xiàn)為可育性狀，證明過表達(dá)該基因的直系同源基因會恢復(fù)花藥發(fā)育異常植株的育性。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，上述目的可以通過提供植物花藥高效表達(dá)啟動子驅(qū)動的 PABP5基因來實現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，上述目的可以通過提供含有所述啟動子和基因的核苷酸序列的重組載體來實現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，上述目的可以通過提供用所述重組載體轉(zhuǎn)化的微生物來實現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，上述目的可以通過提供用所述微生物轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物來實現(xiàn)。一種人工創(chuàng)建植物雄性不育系的制備方法，其步驟是A 人工創(chuàng)建不育系所需的引物設(shè)計利用SDS裂解法(J.薩姆布魯克.D. W.拉塞爾著，黃培堂等譯分子克隆試驗指南(第三版)科學(xué)出版社)提取擬南芥DNA，以DNA為模板，進(jìn)行干擾片斷的擴(kuò)增，引物為 PABP-Ri-I-I，5‘ -GACATCTAGAGAGTCGTGCGATGGAAAG-3‘ ；PABP-Ri-1-2,5‘ -CGCGGATCCCT TGCAGGAAGTCACATTC-3 ‘ ；PABP-Ri-2-1,5 ‘ -CCGGAATTCCCATGGGAGTCGTGCGATGGAAAG-3‘； PABP-Ri-2-2，5‘ -CGGGGTACCCTTGCAGGAAGTCACATTC3-‘。B:不育系的制備本制備方法運用了 RNAi技術(shù)。以擬南芥DNA為模板，進(jìn)行第一個干擾片段的擴(kuò)增， 引物為:PABP-Ri-1-1 ^P PABP-Ri-1-2, PCR 反應(yīng)體系為 25 μ L 內(nèi)含=IXPCR buffer, MgCI 1. 5mmol/L,dNTP 0. 2mmol/L (毫摩爾每升)、引物濃度為0. 5mol/L，Pfu酶1. 5單位，模板約 IOOng0 PCR 反應(yīng)程序-MV 5min ；94°C 30sec，55°C 45sec，72°C lmin，32 個循環(huán)；72°C延伸 anin。以DNA為模板，進(jìn)行第二個干擾片段的擴(kuò)增，引物為PABP-Ri-2-l和PABP-Ri_2_2， PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同第一個干擾片段的擴(kuò)增體系。分別用第一個和第二個片段替換中間載體pKannibal的Xbal I-BamH I之間和EcoRI-KpnI之間的序列，獲得中間載體pKannibal-1-2，用SpeI和NotI雙酶切中間載體pKannibal-1-2，回收大片斷，并用SpeI 和NotI雙酶切pGreen0229，回收雙酶切產(chǎn)物，按3 1的比例混合樣品，加入T4DNA連接酶5單位，1 X反應(yīng)緩沖液，無菌水補(bǔ)充體積至25ml，16°C過夜連接反應(yīng)，構(gòu)建植物表達(dá)載體 pGKarmikil-1-2。轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，并通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得的陽性不育植株即為人工創(chuàng)建的不育系。一種人工創(chuàng)建植物雄性不育系的制備方法，其步驟詳見專利油菜&1PABP5基因及其啟動子的應(yīng)用(專利申請?zhí)?01010(^8913. 6，申請時間2010. 01. 05，發(fā)明名稱油菜 ΒηΡΑΒΡδ基因及其啟動子的應(yīng)用。獲得了一種油菜&1ΡΑΒΡ5基因在控制花粉育性中的應(yīng)用)。一種植物恢復(fù)系的制備方法，其步驟是A 人工創(chuàng)建恢復(fù)系所需的引物設(shè)計利用SDS裂解法(J.薩姆布魯克.D. W.拉塞爾著，黃培堂等譯分子克隆試驗指南 (第三版)科學(xué)出版社)提取油菜DNA，以DNA為模板，進(jìn)行Pbhpabp5啟動子的擴(kuò)增，引物為 PBnPABP5A，GACATCTAGACGCTGTCGTTGGGGCAATTC ； PBnPABP5S, CAGAAGCTTAAAAGACTTACCGAGTTGAACC ； 利用Trirol進(jìn)行油菜花蕾RNA的提取，以RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行toPABP5 基因的擴(kuò)增，弓丨物為BnPABP5A，GACGAGCTCTCACTCCGTTGAGGAGGG ;BnPABP5S， GACATCTAGAATGGTTGATCAAGTCATCCC。B 恢復(fù)系的制備以油菜DNA為模板進(jìn)行Pbhpabp5啟動子PCR擴(kuò)增，引物為PBnPABP5A和PBnPABP5S，反應(yīng)體系為 25 μ L 內(nèi)含IXPCR buffer, MgCI 1. 5mmol/L, dNTP 0. 2mmol/L(毫摩爾每升)、引物濃度為 0. 5mol/L, Pfu 酶 1. 5 單位，模板約 IOOngo PCR 反應(yīng)程序-MV 5min ；94°C 30sec, 55°C 45sec,72°C lmin，32個循環(huán)；72°C延伸8min。反應(yīng)完成后用凝膠回收試劑盒回收并純化目的片段，獲得ΡΒηΡΑΒΡ5啟動子序列。以油菜花蕾cDNA為模板進(jìn)行&1PABP5基因的 PCR擴(kuò)增，引物為&1PABP5A和&iPABP5S，反應(yīng)體系同PBnPABP5啟動子的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序 940C 5min ；94°C 30sec,55°C 45sec，72°C lmin，32 個循環(huán)；72°C延伸 &iiin。完成后用凝膠回收試劑盒回收純化目的片段，獲得&1PABP5基因序列。用獲得的Pbiipabp5啟動子序列和 &1PABP5基因序列分別替換pBI 121植物表達(dá)載體中的CaMV35S序列和⑶S序列，構(gòu)建PBnFABP5 驅(qū)動的PABP5基因的植物過表達(dá)載體，進(jìn)行擬南芥植株的轉(zhuǎn)化，獲得陽性植株，該陽性植株即為人工創(chuàng)建的恢復(fù)系。1、ΒηΡΑΒΡδ 基因的克隆在液氮中將甘藍(lán)型油菜的花蕾樣品研磨至粉狀，利用Trirol提取試劑盒(購自 Invitrogen公司，以下相同)的要求進(jìn)行RNA的提取。提取的總RNA溶于無RNase的雙蒸水中。DNase I (購自Promega公司，以下相同)去除可能殘留的DNA。用蛋白檢測儀(DU 650BECKMAN,USA)分別檢測RNA在260納米和280納米光吸收值，結(jié)合1 % (質(zhì)量體積比) 瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的純度及濃度。以獲得的RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA分裝后于-20°C保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)甘藍(lán)型油菜toPABP5基因序列(詳見專利油菜toPABP5基因及其啟動子的應(yīng)用，專利申請?zhí)?201010028913. 6,申請時間:2010. 01. 05，發(fā)明名稱油菜&ιΡΑΒΡ5 基因及其啟動子的應(yīng)用。獲得了一種油菜&1PABP5基因在控制花粉育性中的應(yīng)用)設(shè)計引物，引物序列分別為 BnPABP5S GACATCTAGAATGGTTGATCAAGTCATCCC 和 BnPABP5A GACGAGCTCTCACTCCGTTGAGGAGGG，引物序列的5'末端分別引入了 XbalI和&icl限制性內(nèi)切酶。以甘藍(lán)型花蕾的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25 μ L內(nèi)含1XPCR buffer, MgCI 1. 5mmol/L, dNTP 0. 2mmol/L(毫摩爾每升)、引物濃度為 0. 5mol/L, Pfu 酶 1. 5 單位， 模板約lOOng，根據(jù)具體情況設(shè)置循環(huán)參數(shù)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0% (質(zhì)量體積比)瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠回收試劑盒回收目的片段&1PABP5基因，獲得&1PABP5基因序列。2、甘藍(lán)型油菜啟動子PBnPABP5的制備方法，其步驟是甘藍(lán)型油菜啟動子PBnPABP5的制備方法，其步驟詳見專利油菜&1PABP5基因及其啟動子的應(yīng)用(專利申請?zhí)?01010(^8913. 6，申請時間2010. 01. 05，發(fā)明名稱油菜 ΒηΡΑΒΡδ基因及其啟動子的應(yīng)用。獲得了一種油菜&1ΡΑΒΡ5基因在控制花粉育性中的應(yīng)用)。3、啟動子PBnPABPjg動的&1PABP5基因的植物過表達(dá)載體ρΒΙ ΡΒηΡΑΒΡ5-ΒπΡΑΒΡ5的構(gòu)建和根癌農(nóng)桿菌菌株ΕΗΑ105(購于上海滬尚生物科技有限公司以下相同)的轉(zhuǎn)化構(gòu)建的重組載體是將質(zhì)粒ρΒΙ121_ΒηΡΑΒΡ5，(詳見甘藍(lán)型油菜&ιΡΑΒΡ5基因及其啟動子，專利申請?zhí)?201010028913. 6,申請時間:2010. 01. 05，發(fā)明名稱油菜&ιΡΑΒΡ5基因及其啟動子的應(yīng)用。獲得了一種油菜&1PABP5基因在控制花粉育性中的應(yīng)用)上的GUS 基因用前期克隆得到的&1PABP5基因片段替換而來。為完成此目的，首先用)(ba I/McI雙酶切克隆載體pBI121-BnPABP5的⑶S片段，同時用)(ba I/Mel酶切&ιΡΑΒΡ5基因片段。酶切反應(yīng)在37度培養(yǎng)箱中進(jìn)行，約4-6個小時之后，用(質(zhì)量體積比)瓊脂糖膠電泳檢測。將&1PABP5基因片段的酶切產(chǎn)物和克隆載體pBI121-BnPABP5上切下的大片段用DNA 凝膠回收試劑盒(前面已述)回收。按&1PABP5基因片段的酶切產(chǎn)物比pBI121-BnPABP5 載體(150ngBnPABP5基因片段50ng載體片段)=3:1的比例(摩爾濃度比)混合樣品，加入T4DNA連接酶5單位，IOX反應(yīng)緩沖液，無菌水補(bǔ)充體積至20 μ L，16°C連接過夜。 轉(zhuǎn)化后，在含有卡那霉素(50yg/mL)固體LB平板上篩選，挑斑做菌落PCR，選擇陽性菌株提質(zhì)粒，酶切驗證正確的重組質(zhì)粒命名為PBI PBnPAEP5-BnPABP5。然后利用凍融法將ρΒΙ ΡΒηΡΑΒΡ5-ΒηΡΑΒΡ5轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌ΕΗΑ105 (購自大連寶生物生物制品有限公司，以下相同)， 卡那霉素(50yg/mL)和利福平(50 μ g/mL)雙抗性平板篩選，挑斑，菌落PCR檢測驗證。4、ρΒΙ PBnPABP5-BnPABP5在擬南芥中的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株篩選參照文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行擬南芥轉(zhuǎn)化(Zhang X. R. et al. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature, 2006，1 :1-6)。在轉(zhuǎn)化擬南芥前一天，將制備含有載體ρΒΙ PBnPABP5-BnPABP5的根癌農(nóng)桿菌 ΕΗΑ105 (前面已述)菌液轉(zhuǎn)入含有卡那霉素50 μ g/ml、利福平50 μ g/ml的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。第二天，用紫外分光光度計(SPEK0L 1300)于276納米波長下檢測吸光值，當(dāng)菌液的吸光值在1.6-2.0之間時取出。室溫00-25°C，以下相同)以4000g離心 lOmin，棄上清，沉淀懸浮于等體積的5% (質(zhì)量體積比)蔗糖中。將渾濁的蔗糖溶液倒入一大培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)化前加入終濃度為0.02% (體積比)的Silwet 1-77(購自北京五洲元業(yè)科貿(mào)中心，以下相同)?；靹蚝蟀汛D(zhuǎn)化的擬南芥整個花序輕輕的浸沒在蔗糖中，默數(shù)15 秒，取出植株。轉(zhuǎn)化后的植株用一個黑色塑料袋包好，放在生長箱培養(yǎng)。第二天將塑料袋揭開，放在光強(qiáng)的地方培養(yǎng)。隔一周再做一次轉(zhuǎn)化。培養(yǎng)一個月左右收獲種子，種子在培養(yǎng)箱或者日光下干燥3-5天。將轉(zhuǎn)化收獲的TO代種子用70% (體積比)酒精和0.01% (體積比)的升汞表面消毒10分鐘后用蒸餾水洗滌數(shù)次(5 7次)，然后均勻地吹打到 MS固體篩選培養(yǎng)基(MS大量元素母液IOOml ；MS微量元素母液IOml ；MS有機(jī)母液IOml ； MS鐵鹽IOml ；肌醇IOml ；蔗糖30g ；用IM NaOH調(diào)PH至5. 8，12g瓊脂粉，定容至1L，高壓 121度滅菌后備用。加入8g瓊脂粉可配置成固體培養(yǎng)基。各種母液配方見表1)表面。 4°C春化4-6天，放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。根據(jù)表達(dá)載體上所特有的卡那霉素抗性篩選陽性苗。葉片長到足夠大小時(3-4葉期)，取少許綠苗葉片進(jìn)行PCR陽性檢測，引物&1PABP5S: GACATCTAGAATGGTTGATCAAGTCATCCC 和 BnPABP5A :GACGAGCTC TCACTCCGTTGAGGAGGG,反應(yīng)體系為 25 μ L 內(nèi)含IXPCR buffer, MgCI 1. 5mmol/L, dNTP 0. 2mmol/L(毫摩爾每升)、引物濃度為 0. 5mol/L, Pfu 酶 1. 5 單位，模板約 IOOngo PCR 反應(yīng)程序-MV 5min ；94°C 30sec, 55°C 45sec, 72°C lmin，32個循環(huán)；72°C延伸8min。獲得了轉(zhuǎn)基因陽性苗。將陽性苗自交3代以上，獲得純合植株.獲得T3代植株，此植株即為人工創(chuàng)建的恢復(fù)系，命名為HF-0XPABP5。
表1 MS培養(yǎng)基母液配方
母液(stock solution)組分(components)濃度(concentration)mg/L大量元素(IOx)NH4NO3/KNO316500/19000CaCL2-2H20/MgS04-7H204400/3700KH2PO41700微量元素(IOOx)KI/H3BO383/620MnS04.4H20/ZnS04.7H202230/860Na2Mo04-2H20/CuS04· 5H2025/2.5CoC12.6H202.5有機(jī)母液(IOOx)甘氨酸50VB1AVB550/50VB6200鐵鹽(IOOx)Na2-EDTA-2H203730Fe2SO4-7H202780肌醇(IOOx)肌醇100005.植物雄性不育系育性的恢復(fù)擬南芥雄性不育種子播種于蛭石中，用塑料布蒙上，4°C春化4-5天，轉(zhuǎn)移到生長箱中萌發(fā)。將PBI PBnPABP5-BnPABP5轉(zhuǎn)化后PCR驗證是陽性的T3代轉(zhuǎn)基因植株種子在MS培養(yǎng)基上播種，方法如下將轉(zhuǎn)化收獲的T3代種子用70% (體積比)酒精表面消毒2-3分鐘后，用0.01% (體積比)的升汞表面消毒10分鐘，然后用蒸餾水洗滌數(shù)次(5 7次)，然后均勻地吹打到MS固體篩選培養(yǎng)基(卡那霉素50 μ g/ml)表面。4°C春化4-6天，放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。長出2-3片真葉后移栽到蛭石中。擬南芥雄性不育植株和恢復(fù)系植株開花后， 每天上午10點以后取恢復(fù)系的轉(zhuǎn)基因植株的花粉對不育植株進(jìn)行授粉。待種子成熟后，收獲，將種子播種于在MS (卡那霉素50 μ g/ml)培養(yǎng)基上播種，長出2-3片真葉后，將陽性植株移栽到蛭石中，待幼苗恢復(fù)健壯后，噴灑30ppm的除草劑Basta (購自拜爾公司)。一星期后，再次噴灑50ppm的Basta，陽性植株進(jìn)入生殖生長期后，角果能夠發(fā)育，成熟后，角果內(nèi)的種子發(fā)育正常，但是數(shù)量比野生型角果少(圖4)，說明陽性植株可以產(chǎn)生正常的花粉，證明不育植株經(jīng)過與PBI ΡΒηΡΑΒΡ5-ΒηΡΑΒΡ5轉(zhuǎn)化后的擬南芥雜交獲得的雜交種的育性得到了恢
Μ. οΑ、一種通過應(yīng)用RNAi技術(shù)干擾ΡΑΒΡ5基因表達(dá)在植物中人工創(chuàng)建雄性不育系的描述。利用RNAi技術(shù)在擬南芥中抑制了擬南芥ΡΑΒΡ5基因的表達(dá)，在轉(zhuǎn)基因擬南芥中ΡΑΒΡ5 基因的沉默并不會引起植物營養(yǎng)生長期表型的變化，但在生殖生長期會引起擬南芥的花粉敗育，具體表現(xiàn)為與野生型擬南芥相比，在營養(yǎng)生長期表型沒有明顯的變化，生長勢相同，進(jìn)入生殖生長期后，開花期基本相同，開花后，不育植株花期較長，花瓣脫落后，角果無變化，不生長或生長緩慢，不生長的逐漸萎縮，變黃，脫落，生長緩慢的結(jié)實率降低或者不結(jié)實。通過觀察花粉，發(fā)現(xiàn)RNAi轉(zhuǎn)基因擬南芥的花藥體積變小，花粉數(shù)量明顯減少，花粉的敗育水平明顯升高。選擇敗育程度較高的轉(zhuǎn)基因株系，制作冰凍切片觀察轉(zhuǎn)基因植株的花粉敗育的觀察，發(fā)現(xiàn)花粉粒變皺折，萎縮。表明抑制或降低ΡΑΒΡ5基因的表達(dá)會引起植物花粉敗育，使植物的結(jié)實能力下降或完全失去，獲得了雄性不育植株。目前在篩選不育材料過程中，存在周期長，種質(zhì)資源短缺、遺傳背景單一等不利因素，因此利用RNAi技術(shù)干擾ΡΑΒΡ5 基因表達(dá)人工創(chuàng)建雄性不育系具有一定的應(yīng)用價值，如選擇高抗病、抗逆、高產(chǎn)等優(yōu)異性狀的受體植株，通過該技術(shù)干擾植株中的ΡΑΒΡ5基因，獲得具有優(yōu)良性狀雄性不育系，在雜交制種的商業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用。B、一種應(yīng)用Pbhpabp5啟動子驅(qū)動ΡΑΒΡ5基因的過表達(dá)，在植物中人工創(chuàng)建恢復(fù)系的描述。利用Trirol提取試劑盒(購自hvitrogen公司，以下相同)的要求進(jìn)行甘藍(lán)型油菜花蕾RNA的提取，以獲得的RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得到的cDNA。根據(jù)甘藍(lán)型油菜&1PABP5 基因序列設(shè)計引物，引物序列分別為BnPABP5S GACATCTAGAATGGTTGATCAAGTCATCCC和 BnPABP5A :GACGAGCTC TCACTCCGTTGAGGAGGG,引物序列的 5 ‘末端分別引入了 Xbal I 和 McI限制性內(nèi)切酶。以甘藍(lán)型花蕾的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0% (質(zhì)量體積比)瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠回收試劑盒回收目的片段&1PABP5基因，獲得 &1PABP5基因序列。禾_基因組步移法克隆得到油菜Pbhpabp5驅(qū)動的內(nèi)源基因的5'上游序列，獲得甘藍(lán)型油菜PBnPABP5啟動子。構(gòu)建由該啟動子調(diào)控的報告基因GUS的植物表達(dá)載體 pBI121-BnPABP5(甘藍(lán)型油菜&ιΡΑΒΡ5基因及其啟動子，專利申請?zhí)?01010(^8913. 6，申請時間2010. 01. 05，發(fā)明名稱油菜&1PABP5基因及其啟動子的應(yīng)用。獲得了一種油菜 ΒηΡΑΒΡδ基因在控制花粉育性中的應(yīng)用)。將該重組載體質(zhì)粒ρΒΙ121-ΒηΡΑΒΡ5上的⑶S基因用前期克隆得到的&1ΡΑΒΡ5基因片段替換而來。為完成此目的，首先用)(ba I/McI雙酶切克隆載體pBI121-BnPABP5的⑶S片段，同時用)(ba I/SacI酶切&ιΡΑΒΡ5基因片段。 將&1PABP5基因片段的酶切產(chǎn)物和克隆載體pBI121-BnPABP5上切下的大片段用DNA凝膠回收試劑盒(前面已述)回收。按&1PABP5基因片段的酶切產(chǎn)物比pBI121-BnPABP5載體 (150ng &1PABP5基因片段50ng載體片段)=3 1的比例(摩爾濃度比)混合樣品，進(jìn)行序列片斷的連接，獲得的重組質(zhì)粒命名為PBI PBnPAEP5-BnPABP5。然后利用凍融法將ρΒΙ ΡΒηΡΑΒΡ5-ΒηΡΑΒΡ5轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌ΕΗΑ105 (購自大連寶生物生物制品有限公司，以下相同)， 經(jīng)抗生素篩選和PCR驗證獲得陽性農(nóng)桿菌菌株。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花期侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥，Tl代在加有卡那霉素的MS (前面已述)培養(yǎng)基上初步篩選轉(zhuǎn)基因植株，當(dāng)擬南芥長出兩片真葉后，移栽到蛭石上繼續(xù)種植，當(dāng)植株出現(xiàn)花序后，進(jìn)行PCR檢測，利用分子手段鑒定陽性株。將陽性植株自交三代，獲得T3代植株。該轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株相比，表型上無明顯差異，花期相同，生長周期相同，角果、種子發(fā)育正常。C、一種植物雄性不育系育性恢復(fù)的描述。擬南芥雄性不育系的種子播種于蛭石中，用塑料布蒙上，4°C春化后在生長箱中萌發(fā)。將pBI PBnFABP5-BnPABP5轉(zhuǎn)化后PCR驗證是陽性的Τ3代轉(zhuǎn)基因植株種子在MS培養(yǎng)基上播種，4°C春化4-6天，放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 長出2-3片真葉后移栽到蛭石中。不育植株生長至2-3片真葉期時，噴灑30ppm的除草劑 Basta (購自拜爾公司)。一星期后，再次噴灑50ppm的Basta，除去除草劑敏感植株。擬南芥雄性不育植株和恢復(fù)系植株開花后，每天上午10點以后取恢復(fù)系的轉(zhuǎn)基因植株的花粉對不育植株進(jìn)行授粉。待種子成熟后，收獲，將種子播種于在MS (前面已述，卡那霉素50 μ g/ ml)培養(yǎng)基上播種，長出2-3片真葉后，將陽性植株移栽到蛭石中，待幼苗恢復(fù)健壯后，噴灑 30ppm的除草劑Basta (購自拜爾公司)。一星期后，再次噴灑50ppm的Basta，陽性植株進(jìn)入生殖生長期后，角果能夠發(fā)育，成熟后，角果內(nèi)的種子發(fā)育正常，但是數(shù)量減少，約為野生型的30% (野生型角果中種子數(shù)量約為40-60個，不予植株恢復(fù)后的種子數(shù)目約為15-20 個)(圖4)，說明陽性植株可以產(chǎn)生正常的花粉，證明不育植株經(jīng)過與ρΒΙΡΒηΡΑΕΡ5-ΒηΡΑΒΡ5轉(zhuǎn)化后的擬南芥雜交獲得的雜交種的育性得到了恢復(fù)。D、一種生產(chǎn)雜交種子的三系配套模式的描述。通過對獲得的兩種轉(zhuǎn)基因植物材料的雜交實驗研究，發(fā)明人獲得了一種生產(chǎn)雜交種子三系配套的新模式(圖幻。在該制種模式中有恢復(fù)系、不育系和保持系。其中恢復(fù)系是應(yīng)用ΡΒηΡΑΒΡ5啟動子驅(qū)動ΡΑΒΡ5基因在植物中過表達(dá)來獲得的，可通過自交使得該系進(jìn)行種質(zhì)的保留。保持系是野生型植物。不育系是應(yīng)用RNAi技術(shù)干擾ΡΑΒΡ5基因在花藥中的表達(dá)獲得的轉(zhuǎn)基因植物。不育系和恢復(fù)系雜交，所結(jié)實的種子即為可育的Fl代雜交種，可以作為雜交種子進(jìn)行商業(yè)使用。不育系和保持系雜交，其后代通過Basta的篩選，陽性苗還會保持不育性狀，作為不育系繼續(xù)使用，使得不育系的種質(zhì)得的以保持。本發(fā)明的優(yōu)點通過利用植物自身啟動子驅(qū)動內(nèi)源基因的表達(dá)，研究ΡΑΒΡ5基因在花藥發(fā)育中的作用，明確了該基因具有其直系同源基因相同功能。利用過表達(dá)該基因的轉(zhuǎn)基因植株同人工干擾ΡΑΒΡ5基因而造成雄性不育的植株雜交，后代植株育性恢復(fù)。申請人可以人工創(chuàng)建具有某些優(yōu)異農(nóng)藝性狀的雄性不育材料以及該不育材料的恢復(fù)系，如開發(fā)具有高感、高抗、 高含油量、或某些其它的優(yōu)異性狀的不育系或恢復(fù)系，為實現(xiàn)人工控制的授粉系統(tǒng)提供新的三系配套體系。


圖1為一種油菜&1ΡΑΒΡ5基因克隆的電泳圖泳道1為以花蕾的cDNA為模板的PCR擴(kuò)增結(jié)果；泳道M為核酸Marker。圖2為一種構(gòu)建的ρΒΙ ΡΒηΡΑΒΡ5-ΒηΡΑΒΡ5載體示意3為一種轉(zhuǎn)化ρΒΙ ΡΒηΡΑΒρ-ΒηΡΑΒΡ5的轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR鑒定圖Μ, DNAmarker DL2000 ；Lane 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 陽性株Lane 11野生型擬南芥；圖4為一種不育系和恢復(fù)系雜交后代表型
圖5為一種雜交種子生產(chǎn)三系配套模式示意圖
具體實施例方式根據(jù)以下實施例，可以更好的理解本發(fā)明，但所述的實施例是為了更好的解釋本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的限制。實施例1 一種油菜花藥高效表達(dá)基因&1PABP5的克隆根據(jù)Trirol提取試劑盒(前面已述)的要求進(jìn)行RNA的提取，具體方法如下取 0. 05-0. Ig的花，在液氮中研磨至粉狀，根據(jù)Trirol提取試劑盒的要求進(jìn)行RNA的提取。提取的總RNA溶于60uL的無RNase的雙蒸水中。DNase I去除可能殘留的DNA。用蛋白檢測儀(DU 650BECKMAN, USA)分別檢測RNA在260納米和觀0納米下的光吸收值，結(jié)合1 % (質(zhì)量體積比)瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的純度及濃度。以上述獲得的RNA為模板按下列方案進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄2yg RNA中加IyL Oligo (dT)，70°C溫育5min，立即置于冰上5min，短暫離心，加入 5XM-MLV Buffer 4μ L, dNTP(1 Ommol/L) 1 μ L, RNase Inhibitor 20 單位，M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(購自Promega公司)200單位，用DEPC處理過的無菌水補(bǔ)至總體積20 μ L，混勻， 42°C溫育lh，70°C水浴15min，得到的cDNA分裝后于_20°C保存?zhèn)溆?。以油菜花cDNA為模板進(jìn)行&1PABP5基因的全長克隆。根據(jù)甘藍(lán)型油菜&ιΡΑΒΡ5 基因序列(甘藍(lán)型油菜&1PABP5基因及其啟動子，專利申請?zhí)?01010(^8913. 6，申請時間2010.01.05，發(fā)明名稱油菜&1PABP5基因及其啟動子的應(yīng)用。獲得了一種油菜toPABP5基因在控制花粉育性中的應(yīng)用)設(shè)計引物，引物序列分別為toPABP5S GACATCTAGAATGGTTGATCMGTCATCCC 和 BnPABP5A GACGAGCTCTCACTCCGTTGAGGAGGG,引物序列的5'末端分別引入了 XbalI和MeI限制性內(nèi)切酶。PCR程序為:94°C，5min ；94°C,45s, 57°C，45s，72°C，2min，33個循環(huán)；72°C, IOmin0結(jié)果如圖1所示。PCR反應(yīng)產(chǎn)物在1 %的(質(zhì)量體積比)低熔點瓊脂糖上電泳，把擴(kuò)增產(chǎn)物條帶從膠上切下放入1. 5ml Eppendoff離心管中，65°C水浴15min，加入等體積苯酚(PH7. 9)，顛倒搖勻5min, 13000轉(zhuǎn)/分鐘離心8分鐘，取上清，加入等體積氯仿異戊醇(體積比M 1)顛倒搖勻5min，13000轉(zhuǎn)/分鐘離心8分鐘，取上清，加入1/10體積的3摩爾/升醋酸鈉(PH5. 2)溶液，2倍體積預(yù)冷的95% (質(zhì)量體積比，以下相同)乙醇，混勻后置_20°C冰箱中20min以上，13000轉(zhuǎn)/分鐘離心15 分鐘，倒掉95% (前面已述)乙醇后再用75% (質(zhì)量體積比，以下相同)乙醇浸洗沉淀，自然風(fēng)干，DNA沉淀溶于20ul無菌去離子水。實施例2 &1PABP5基因的植物過表達(dá)載體pBI PBnPAEP5-BnPABP5的構(gòu)建和根癌農(nóng)桿菌菌株 ΕΗΑ105(購于上海滬尚生物科技有限公司以下相同)的轉(zhuǎn)化構(gòu)建的重組載體是將質(zhì)粒ρΒΙ121-ΒηΡΑΒΡ5(甘藍(lán)型油菜&ιΡΑΒΡ5基因及其啟動子，專利申請?zhí)?201010028913. 6，申請時間:2010. 01. 05，發(fā)明名稱油菜BnPABP5基因及其啟動子的應(yīng)用。獲得了一種油菜&1PABP5基因在控制花粉育性中的應(yīng)用)上的GUS基因用前期克隆得到的&1PABP5基因片段替換而來，載體圖譜如圖2。為完成此目的，首先用 Xba I/SacI雙酶切克隆載體pBI121_BnPABP5的GUS片段，同時用Xba I/SacI酶切&ιΡΑΒΡ5 基因片段。酶切反應(yīng)在37度培養(yǎng)箱中進(jìn)行，約4-6個小時之后，用瓊脂糖膠電泳檢測。
11將&1PABP5基因片段的酶切產(chǎn)物和克隆載體pBI121-BnPABP5上切下的大片段用DNA凝膠回收試劑盒(前面已述)回收。按&1PABP5基因片段的酶切產(chǎn)物比pBI121-BnPABP5載體(150ngBnPABP5基因片段50ng載體片段)=3:1的比例(摩爾濃度比)混合樣品， 加入T4DNA連接酶5單位，IOX反應(yīng)緩沖液，無菌水補(bǔ)充體積至20 μ L，16°C連接過夜。轉(zhuǎn)化后，在含有卡那霉素(50yg/mL)固體LB平板上篩選，挑斑做菌落PCR，以及提質(zhì)粒，Xba I/SacI雙切酶切驗證，正確的重組質(zhì)粒命名為pBI PBnPABP5-BnPABP5。然后利用凍融法將 ρΒΙΡΒ ΡΑΒΡ5-ΒηΡΑΒΡ5轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌ΕΗΑ105 (購自大連寶生物生物制品有限公司，以下相同)，卡那霉素(50 μ g/mL)和利福平(50 μ g/mL)雙抗性平板篩選，挑斑，菌落PCR檢測驗證。實施例3 ρΒΙ ΡΒηΡΑΒΡ5-ΒηΡΑΒΡ5在擬南芥中的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株篩選參照文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行擬南芥轉(zhuǎn)化(Zhang X. R. et al. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature,2006, 1:1-6)。制備含有構(gòu)建好載體的根癌農(nóng)桿菌EHA105(前面已述)菌液，在轉(zhuǎn)化前一天轉(zhuǎn)入含有卡那霉素50yg/ml、利福平50yg/ml的LB液體培養(yǎng)基中，28°C過夜培養(yǎng)。第二天，用紫外分光光度計(SPEK0L 1300)于276nm納米波長下檢測的吸光值，當(dāng)菌液的吸光值達(dá)到在1.6-2.0之間時取出。室溫(20-25°C，以下相同)以4000g離心lOmin，棄上清，沉淀懸浮于等體積的5%蔗糖(質(zhì)量體積比)中。將渾濁的蔗糖溶液倒入一大培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)化前加入終濃度為0.02% (體積比)的Silwet 1-77(購自北京五洲元業(yè)科貿(mào)中心，以下相同)?；靹蚝蟀汛D(zhuǎn)化的擬南芥整個花序輕輕的浸沒在蔗糖中，默數(shù)15s，取出植株。轉(zhuǎn)化后的植株用一個黑色塑料袋包好，放在生長箱培養(yǎng)。第二天將塑料袋揭開，放在光強(qiáng)的地方培養(yǎng)。隔一周再做一次轉(zhuǎn)化。培養(yǎng)一個月左右收獲種子，種子在培養(yǎng)箱或者日光下干燥3-5天。將轉(zhuǎn)化收獲的TO代種子用70% (體積比)酒精和0. 01% (體積比)的升汞表面消毒10分鐘后用蒸餾水洗滌數(shù)次(5 7次)，然后均勻地吹打到MS (MS大量元素母液100ml ；MS微量元素母液IOml ；MS有機(jī)母液IOml ；MS鐵鹽IOml ；肌醇IOml ；蔗糖30g ；用IM NaOH調(diào)PH 至5. 8，12g瓊脂粉，定容至1L，高壓121度滅菌后備用。加入8g瓊脂粉可配置成固體培養(yǎng)基。各種母液配方見表1)固體篩選培養(yǎng)基表面。4°C春化4-6天，放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 根據(jù)表達(dá)載體上所特有的卡那霉素抗性篩選陽性苗。葉片長到足夠大小時(3-4葉期)， 取少許綠苗葉片進(jìn)行PCR陽性檢測，引物序列序列為，5' -AAAAGACTTACCGAGTTGAACC-3‘ 和 5 ‘ -CGCTGTCGTTGGGGCAATTC-3 ‘ ；PCR 反應(yīng)體系如下基因組 DNA 模板 1 μ L (約 50ng)、 10父139酶反應(yīng)緩沖液2111、251111 MgCL2 1. 2ul、2mM dNTP 1. 5ul、IOuM 引物各 0. 2ul、0. 3 單位 Taq 酶，加無菌水至 20μ 1。反應(yīng)程序為94°C變性 5min，94°C 45s、55°C 45s,72°C 2min 32循環(huán)，72°C延伸5min。用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR反應(yīng)產(chǎn)物，結(jié)果表明該&ιΡΑΒΡ5基因全長啟動子表達(dá)載體pBI PBnpABP5-BnPABP5已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入擬南芥(圖3)獲得了轉(zhuǎn)基因陽性苗。將陽性苗自交3代以上，獲得純合植株。實施例4 擬南芥雄性不育植株的獲得擬南芥雄性不育植株的獲得方法及步驟詳見專利油菜&1ΡΑΒΡ5基因及其啟動子的應(yīng)用(專利申請?zhí)?201010028913. 6，申請時間:2010. 01. 05，發(fā)明名稱油菜&ιΡΑΒΡ5基因及其啟動子的應(yīng)用。獲得了一種油菜&1PABP5基因在控制花粉育性中的應(yīng)用)。實施例5 擬南芥雄性不育植株育性的恢復(fù)擬南芥雄性不育種子播種于蛭石中，用塑料布蒙上，4°C春化后在生長箱中萌發(fā)。 將ρΒΙ ΡΒηΡΑΒΡ5-ΒηΡΑΒΡ5轉(zhuǎn)化后PCR驗證是陽性的Tl代轉(zhuǎn)基因植株種子在MS培養(yǎng)基上播種，方法如下將轉(zhuǎn)化收獲的Tl代種子用70% (體積比)酒精和0.01% (體積比)的升汞表面消毒10分鐘后用蒸餾水洗滌數(shù)次(5 7次)，然后均勻地吹打到MS (MS大量元素母液IOOml ；MS微量元素母液IOml ；MS有機(jī)母液IOml ；MS鐵鹽IOml ；肌醇IOml ；蔗糖30g ；用 IM NaOH調(diào)PH至5. 8，12g瓊脂粉，定容至1L，高壓121度滅菌后備用。加入8g瓊脂粉可配置成固體培養(yǎng)基。各種母液配方見表1)固體篩選培養(yǎng)基(卡那霉素50 μ g/ml)表面。4°C 春化4-6天，放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。長出2-3片真葉后移栽到蛭石中。兩種擬南芥開花后， 每天上午10點以后取過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株的花粉對不育植株進(jìn)行授粉。待種子成熟后，收獲，將種子播種于在MS(前面已述，卡那霉素50yg/ml)培養(yǎng)基上播種，長出2-3片真葉后移栽到蛭石中，待幼苗恢復(fù)后，噴灑30ppm的除草劑Basta(購自拜爾公司)。一星期后，噴灑50ppm的Basta，觀察植株的育性，發(fā)現(xiàn)植株的育性得到了恢復(fù)(表2、圖4)。表2不育植株和恢復(fù)系雜交后代的育性統(tǒng)計表
權(quán)利要求
1.一種植物恢復(fù)系的制備方法，其步驟是A 人工創(chuàng)建恢復(fù)系的引物設(shè)計利用SDS裂解法提取油菜DNA，以DNA為模板，進(jìn)行P 5啟動子的擴(kuò)增，弓丨物為/V714i^A, GACATCTAGACGCTGTCGTTGGGGCAATTC ； ΡΒηΡΑΒΡβ, CAGAAGCTTAAAAGACTTACCGAGTTGAACC ；利用 Trirol 進(jìn)行油菜花蕾 RNA 的提取，以 RNA 反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行BnPABP5基因的擴(kuò)增，引物為出nPABP5A，GACGAGCTC TCACTCCGTTGAGGAGGG ； BnPABP5S，GACATCTAGAATGGTTGATCAAGTCATCCC ；B 恢復(fù)系的制備以油菜DNA為模板進(jìn)行啟動子PCR擴(kuò)增，引物為P·鵬k和Ρ β,反應(yīng)體系為 25 μ L 內(nèi)含1XPCR buffer, MgCI 1.5 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L、引物濃度為 0· 5 mol/ L，Pfu 酶 1· 5 單位，模板 lOOng，PCR 反應(yīng)程序94°C 5 min ；94°C 30 sec, 55°C 45 sec, 72°C 1 min，32個循環(huán)；72° C延伸8 min，反應(yīng)完成后用凝膠回收試劑盒回收并純化目的片段，獲得啟動子序列，以油菜花蕾cDNA為模板進(jìn)行fe/^i /笠基因的PCR擴(kuò)增，引物為&1PABP5A和&1PABP5S，反應(yīng)體系同啟動子的擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序94°C 5 min ； 940C 30 sec, 550C 45 sec, 72°C 1 min，32 個循環(huán)；72° C 延伸 8 min，完成后用凝膠回收試劑盒回收純化目的片段，Ι·ΒηΡΑΒΡ5基因序列，用獲得的啟動子序列和BnPABP5 基因序列分別替換PBI121植物表達(dá)載體中的CaMV35S序列和⑶S序列，構(gòu)建/^mm驅(qū)動的 / / /笠基因的植物過表達(dá)載體，進(jìn)行擬南芥植株的轉(zhuǎn)化，獲得陽性植株，該陽性植株即為人工創(chuàng)建的恢復(fù)系。
2.權(quán)利要求1所述的一種植物恢復(fù)系在油菜雜交制種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種植物不育系和恢復(fù)系的制備方法和應(yīng)用，其步驟是A人工創(chuàng)建不育系的引物設(shè)計；B不育系的制備以擬南芥DNA為模板，進(jìn)行第一和第二個干擾片段的擴(kuò)增，構(gòu)建干擾載體，并通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得的陽性不育植株即為人工創(chuàng)建的不育系。C、人工創(chuàng)建恢復(fù)系的引物設(shè)計；D恢復(fù)系的制備以油菜DNA為模板進(jìn)行PBnPABP5啟動子擴(kuò)增，以油菜花蕾cDNA為模板進(jìn)行BnPABP5基因擴(kuò)增，用獲得的PBnPABP5啟動子序列和BnPABP5基因序列分別替換pBI121植物表達(dá)載體中的CaMV35S序列和GUS序列，構(gòu)建PBnPABP5驅(qū)動的BnPABP5的植物過表達(dá)載體，進(jìn)行擬南芥植株的轉(zhuǎn)化，獲得陽性植株，該植株即為人工創(chuàng)建的恢復(fù)系。不育系和恢復(fù)系在油菜雜交制種中的應(yīng)用，實現(xiàn)雜交育種過程中的三系配套。
文檔編號A01H1/02GK102250947SQ20111019259
公開日2011年11月23日 申請日期2011年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月11日
發(fā)明者劉勝毅, 石磊, 董彩華 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所