專利名稱：水稻miR166在提高植物干旱脅迫耐受性中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及功能基因組學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種水稻miRNA166在提高植物干旱脅迫耐受性中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
干旱是全球作物生產(chǎn)的主要限制因素，而且干旱面積分布極不均勻。據(jù)統(tǒng)計，世界上干旱半干旱地區(qū)約占土地面積的36%，占耕地面積的42. 9%。我國干旱、半干旱和亞濕潤干旱區(qū)面積達(dá)331. 7萬平方米，占國土總面積的34. 6%。干旱作為常見的嚴(yán)重影響植物生長的脅迫因素，對農(nóng)作物造成的損失在所有的環(huán)境脅迫中占首位，僅次于生物脅迫病蟲害造成的損失。干旱脅迫首先導(dǎo)致植物細(xì)胞膜透性的改變、引發(fā)膜脂的過氧化作用，并打破細(xì)胞內(nèi)活性氧(R0Q的產(chǎn)生和清除之間的動態(tài)平衡，誘導(dǎo)氧化脅迫等。干旱脅迫下，植物基因表達(dá)發(fā)生變化，關(guān)閉一些正常表達(dá)的基因，啟動干旱脅迫應(yīng)答基因，產(chǎn)生大量的特異蛋白，獨立或協(xié)同調(diào)節(jié)植物的耐旱性。目前，植物干旱脅迫響應(yīng)基因已被大量挖掘，這些基因大致可分為兩類一類編碼調(diào)控蛋白因子，比如鋅指蛋白、S0S2類似蛋白激酶H(S5、轉(zhuǎn)錄因子bHLH、DREBlA、DREB2A、HD-Zip以及生長因子類似蛋白RAP2等；另一類編碼功能蛋白，如 LEA蛋白、脫毒酶、滲透保護(hù)合成酶等。這些脅迫誘導(dǎo)基因及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，協(xié)同或各自獨立地組成植物的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，調(diào)節(jié)植物生理生化以及代謝的變化，從而適應(yīng)外部逆境，提高植物對干旱的耐受性。隨著擬南芥、水稻等植物基因組測序的完成，植物基因的研究已經(jīng)進(jìn)入了功能基因組時代，干旱脅迫響應(yīng)基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究日益成為分子生物學(xué)和作物抗旱基因工程研究的前沿。并且隨著眾多內(nèi)源小RNA的不斷發(fā)現(xiàn)及其功能的研究，人們逐漸認(rèn)識到基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)在植物干旱等逆境脅迫響應(yīng)過程中也起著非常重要的作用，尤其是內(nèi)源小RNA對基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)。微RNAOnicroRNA，或miRNA)就是一類在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的內(nèi)源小RNA分子。miRNA廣泛存在于植物基因組中，長度約為22個核苷酸，它自從被發(fā)現(xiàn)以來就成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。miRNA作為新型的調(diào)控基因表達(dá)的小分子RNA，主要在轉(zhuǎn)錄后水平上通過介導(dǎo)靶mRNA分子的切割或翻譯抑制來調(diào)節(jié)植物基因的表達(dá)，從而調(diào)控植物器官的形態(tài)建成、生長發(fā)育、激素分泌與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及植物對外界環(huán)境脅迫因素的應(yīng)答等過程。近年來，人們通過構(gòu)建小RNA文庫、表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)分析、miRNA基因芯片、 高通量測序、miRNA過表達(dá)等方法，發(fā)現(xiàn)miRNA可受干旱脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生，并在植物抗干旱脅迫中發(fā)揮著重要的作用。Simkar和am(2004)通過構(gòu)建擬南芥幼苗的干旱、鹽、冷害、ABA 脅迫的小RNA文庫，新發(fā)現(xiàn)了沈種miRNA，它們受到脅迫調(diào)控表達(dá)=Northern雜交結(jié)果顯示擬南芥幼苗O周)在干旱脅迫和ABA處理后，miR393、miR397b和miR402的表達(dá)升高， miR389a. 1 表達(dá)下降(Sunkar R and Zhu JK. Novel and stress-regulated microRNAs and other small RNAs from Arabidopsis. Plant Cell，2004，16 :001-2019)。miRNA 芯片結(jié)果表明，擬南芥和水稻中均有多個miRNA受到干旱調(diào)控(Liu HH, Tian X，Li YJ, Wu CAandZheng CC. Microarray-based analysis of stress-regulated microRNAs in Arabidopsis thaliana. RNA,2008,14 :836-843 ；Zhou LG, Liu YH, Liu ZC, Kong DY, Duan M and Luo LJ. Genome-wide identification and analysis of drought-responsive microRNAs in Oryza sativa. Journal of Experimental Botany，2010，61 :4157-4168)。如擬南芥中的 miR393和miR396在干旱誘導(dǎo)下表達(dá)上調(diào)。miR393的靶基因是是生長素受體TIR，推測它通過影響生長素效應(yīng)發(fā)揮干旱耐受作用；miR396的靶基因是生長調(diào)控因子GFL，它通過影響葉片發(fā)育、減少葉片及氣孔密度，從而發(fā)揮耐干旱作用。金由辛課題組在2007年研究發(fā)現(xiàn)水稻中的miR169g可受干旱誘導(dǎo)，且水稻根部的miR169g比莖部的miR169g表達(dá)量更高，合成更迅速，顯示miR169g在水稻根的抗干旱脅迫反應(yīng)中具有重要作用(Zhao B， Liang R, Ge L,Li W,Xiao H,Lin H,Ruan K,Jin Y. Identification of drought-induced microRNAs in rice Biochemical and Biophysical Research Communications,2007, 354 :585-590)。另外，朱健康課題組在2008年研究發(fā)現(xiàn)擬南芥miR169被干旱脅迫抑制表達(dá)，它的靶基因是核轉(zhuǎn)錄因子Y亞基(NFYA0。干旱脅迫下擬南芥通過ABA途徑下調(diào)miR169 水平，引起靶基因NYF5轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量的上調(diào)，進(jìn)而影響下游干旱脅迫相關(guān)基因的表達(dá)。 miR169過表達(dá)以及nfya5敲除突變體植株，較野生植物都表現(xiàn)出葉易失水和抗干旱能力減弱的特點，相反，NFY5過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥通過減少葉片水分喪失而表現(xiàn)出更強(qiáng)的干旱抗性(Li WX, Oono Y, Zhu J, He XJ, Wu JM, Iida K, Lu XY, Cui X，Jin H, Zhu JK. 2008. The Arabidopsis NFYA5 transcription factor is regulated transcriptionally and posttranscriptionally to promote drought resistance. The Plant Cell 20, 2238-2251)。這些結(jié)果表明，miRNA對干旱脅迫耐受性的功能研究，并通過小RNA的遺傳操作改良禾本科作物的抗逆性，將為解決作物的耐旱性問題提供新思路，并具有重要的應(yīng)用前景。利用小RNA技術(shù)改良植物對生物與非生物脅迫的耐性成為了一個重要的技術(shù)手段。 目前，國內(nèi)外還沒有利用基因工程手段將干旱脅迫相關(guān)的miRNA導(dǎo)入水稻、玉米、草莓、煙草等作物獲得干旱脅迫耐受作物株系，但通過小分子RNA的遺傳操作改良作物的抗逆性的前景很光明。 miR166是一種廣泛存在于單子葉植物和雙子葉植物中的miRNA。在植物眾多miRNA中，研究表明miR166通過調(diào)節(jié)其靶基因同源異型域一亮氨酸拉鏈蛋白 (homeodomain-leucine zipper protein, HD-Zip)，從而調(diào)控擬南芥和水稻的葉、花、根的生長發(fā)育，并且在植物對逆境脅迫的響應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用。過量表達(dá)miR166會造成擬南芥植株生長受抑，花器官簇生，頂端分生組織發(fā)育異常等表型。蒺藜苜蓿中過量表達(dá) miR166會造成植株根瘤和側(cè)根數(shù)目減少，維管系統(tǒng)發(fā)育異常。受干旱誘導(dǎo)表達(dá)的miR166通過影響根的數(shù)量和維管組織，從而來調(diào)節(jié)植物的抗干旱能力。在缺水脅迫下蒺藜苜蓿根中 miR166表達(dá)上調(diào)，且野生型蒺藜苜蓿在缺水脅迫下的表型與過表達(dá)miR166的轉(zhuǎn)基因的植株表型相似。干旱脅迫下野生二粒小麥和大麥根中的miR166均表達(dá)下調(diào)，可能存在其他的未鑒定的靶基因。鹽脅迫下玉米的miR166表達(dá)下調(diào)。水稻miR166還與冷脅迫和赤霉素處理有關(guān)。以上研究結(jié)果表明，miR166不僅可以調(diào)節(jié)葉、花、根的發(fā)育，并且在植物應(yīng)答多種環(huán)境脅迫中發(fā)揮作用
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種水稻miR166在提高植物干旱脅迫耐受性中的應(yīng)用。一種水稻miR166在提高植物干旱脅迫耐受性中的應(yīng)用，所述水稻miR166的堿基序列如SEQ ID NO. 1所示。優(yōu)選的，所述植物為水稻。具體方法為將包含所述水稻miR166的前體基因連接到載體上，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化到水稻愈傷組織，篩選培養(yǎng)，獲得水稻轉(zhuǎn)基因株系。由于miR166本身序列很短，只有20幾個bp，而前體序列相對較長，連接到載體上， 有利于轉(zhuǎn)化實現(xiàn)，優(yōu)選的，所述前體基因的堿基序列如SEQ ID NO. 2所示。本發(fā)明通過將水稻miR166轉(zhuǎn)化到水稻愈傷組織，將獲得的T2代水稻培養(yǎng)在水稻培養(yǎng)液(PEG 6000濃度為12%)中，發(fā)現(xiàn)該miRNA可以提高對干旱脅迫的耐受性，緩解干旱脅迫對它的毒害。


圖1為7天齡水稻幼苗60uM Cd脅迫Mi根的miRNA芯片圖譜，(Cy3對照；Cy5處理樣品)；圖2為7天齡水稻幼苗60uM Cd處理3，6，12，24h后，miR166m及其靶基因HD-Zip 的表達(dá)分析；圖3為miR166m過表達(dá)載體構(gòu)建的過程凝膠圖譜。a. miR166m前體PCR擴(kuò)增凝膠圖譜；b. pMD19-T-miR166m質(zhì)粒酶切鑒定圖；c. pl301-miR166m重組質(zhì)粒菌液PCR擴(kuò)增凝膠圖譜；d. pl301-miR166m重組質(zhì)粒酶切鑒定圖；圖4為生長五周的miR166m過表達(dá)水稻經(jīng)12% PEG6000處理7d和19d后的表型 (WT對照；35S :MIR166m轉(zhuǎn)基因水稻)。
具體實施例方式實施例1基因的獲得以野生型水稻(中花11)七天苗齡幼苗為材料，取60uM CdCl2處理Mi和對照組 (未處理)的根0. lg，用液氮研磨并加入Iml Trizol (Invitrogen生產(chǎn))繼續(xù)研磨至勻漿， 轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，12000 Xg離心lOmin，收集上清至新離心管中。室溫放置5min，加入 0. 2ml氯仿用力震蕩15s，使溶液充分混勻。室溫放置5min，12000Xg離心15min，收集上清。加兩倍上清體積的異丙醇，_20°C過夜沉淀。12000Xg離心lOmin，去上清，加ImL預(yù)冷的75%乙醇(DEPC-H2O配制)洗沉淀。12000 Xg離心lOmin，倒盡液體，室溫干燥5min，沉淀重溶于50 μ L DEPC (焦碳酸二乙酯)水。取2 μ g Total RNA進(jìn)行電泳檢測，并稀釋樣品測 OD 260/280, OD 260/230 及濃度。利用 2-5 μ g 總 RNA 樣品，通過 YM-100 (Millipore)微離心過濾柱得到片段小于300nt的小RNA。Poly(A)聚合酶在分離到的小RNA 3'端加上 poly(A)尾巴，再將一個寡聚核苷酸標(biāo)記與這個poly(A)尾巴連接，(ligation)用于后續(xù)的熒光標(biāo)記。用兩個不同的標(biāo)記物Cy3和Cy5來標(biāo)記處理組和對照組的兩個RNA樣品。利用 Version 11.0 microRNA 數(shù)據(jù)庫，(http//microrna. sanger. ac.uk/sequences/)制作μ Paraf IoTM微流體芯片探針。雜交反應(yīng)通過利用μ Paraf IoTM 微流體芯片，檢測在60uM CdClJA迫下水稻根中miRNA的表達(dá)差異，如圖1所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR166m在Cd處理他后表達(dá)量比對照(未處理)下降2倍以上。根據(jù)Sanger microRNA數(shù)據(jù)庫(miRBase)和TIGR數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)miR166m是水稻 miR166家族成員之一，位于8號染色體，來源于基因間區(qū)域。成熟序列如SEQ ID NO. 1所示，前體序列如SEQ ID NO. 2所示。根據(jù)miRU靶基因預(yù)測軟件發(fā)現(xiàn)，miR166m的靶基因是同源異型域一亮氨酸拉鏈蛋白(homeodomain-leucine zipper protein，HD-Zip)。根據(jù) NCBI 和 TIGR 數(shù)據(jù)庫查詢， HD-Zip基因號為0s03g43930，mRNA長度為3081bp，CSD為2589bp，基因編碼產(chǎn)物大小166
個氨基酸。以野生型水稻(中花11)七天苗齡幼苗為材料，用60uM CdCl2處理0，3，6，12，Mh， 用Trizol法分別提取RNA，并用DNase I消化以去除DNA污染。采用PrimekriptTM RT reagent kit(Takara，Japan)合成cDNA。miR166m利用具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RT引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(RT 引物序列5，-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACAGGGAA3-，)； HD-Zip 利用 oligo-d(T)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。采用 SYBR Premix Ex TaqTM(Takara, Japan)，在 LightCycler480 (Roche, Shanghai, China)熒光定量 PCR 儀上擴(kuò)增 miR166m 和 HD_Zip，PCR 反應(yīng)條件為95°C lmin，變性95°C 10s，退火58°C 15s，延伸72°C 15s，45個循環(huán)。PCR引物如下miR166m-F, 5 ’ -GTCGGACCAGGCTTCA-3 ’miR166m-R, 5，-TGCGTGTCGTGGAGTC-3 ‘HD-Zip-F, 5，-ATGTCAAGAACCTCCCCAG-3，HD-Zip-R, 5，-CACACGCAAAAATCACTCA—3，如圖2所示，實時定量PCR實驗結(jié)果驗證了 miR166m對HD-Zip的負(fù)調(diào)控。實施例2基因克隆與轉(zhuǎn)化以野生型水稻中花11七天苗齡幼苗DNA為模板，利用PCR方法擴(kuò)增到miR166m前體基因的序列。具體操作如下首先，提取野生型水稻中花11七天齡幼苗DNA。取約0.2g 水稻葉片用液氮研磨成粉末，轉(zhuǎn)移粉末到加有500 μ 1提取液(IOOmM Tris-HCl, ρΗ 8. 0 ； 20mM EDTA ；500mM NaCl)的離心管中，輕輕混勻。向管中加入100μ1 10% SDS溶液，混勻，65°C保溫20min。然后加氯仿/異戊醇/乙醇QO 1 4)混合液600 μ 1，室溫靜止 IOmin0 4°C，12000rpm離心lOmin，轉(zhuǎn)移上清至另一離心管中。加入Iml預(yù)冷的無水乙醇充分混勻，-20°C沉淀DNA 20min。4°C，12000rpm離心lOmin，棄上清，加70%乙醇500 μ 1進(jìn)行洗滌。4°C，12000rpm離心lOmin，棄上清。輕微離心，用移液器將殘留液體吸干。吹干DNA 沉淀后，溶于100μ 1含RNase酶(10yg/ml)TE中，37°C水浴30min，_20°C保存。根據(jù)已知的 miR166m 前體序列(http://www. mirbase. org/cgi_bin/get_seq. pi),在 database 中查閱其所在基因組位點的兩端的序列，分別在前體發(fā)夾結(jié)構(gòu)兩端約50bp處設(shè)計引物，所設(shè)引物如下miR166m-F, 5 ’ -CGGGGTACCCTTTCTCTGCTTTGGTGGTT-3 ’miR166m-R,5' -AACTGCAGTTCCGATGGATTTCCTGGAC-3‘接著以DNA為摸板，利用所設(shè)引物擴(kuò)增miR166m前體基因。PCR反應(yīng)體系為 20μ 1，依次加入 DNA 模板 1μ 1U0XPCR buffer 2 μ 1、IOmMdNTPs 2口1、10口] 正向引物 (miR166m-F) 0. 5 μ 1、10 μ M 反向引物(miR166m_R) 0. 5 μ 1、TaKaRa Taq (5U/ μ 1)聚合酶0. 2μ 1，最后加ddH20補(bǔ)至20μ 1。PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94°C 5min，變性94°C 30s，退火 58°C 30s，延伸72°C 30s，30個循環(huán)，最后延伸72°C 10min，4°C保存。PCR產(chǎn)物凝膠圖譜如圖 3. a所不。擴(kuò)增后將miR166m前體基因DNA產(chǎn)物，利用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收，操作如下將DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下放入1. 5ml 的Eppendorf管中，稱取重量。加入6倍體積溶膠液PN，50°C水浴放置30min。將溶膠液加入吸附柱CA2中，室溫放置2min，12000rpm離心60s，倒掉收集管中的廢液。加入600 μ 1漂洗液PW，12000rpm離心60s，倒掉收集管中的廢液。12000rpm離心2min，室溫放置數(shù)分鐘徹底晾干。將吸附柱CA2放到一個干凈離心管中，加入40 μ 1洗脫緩沖液EB，12000rpm離心 2min收集DNA溶液。將回收的miR166m前體基因DNA與pMD19-T載體(TakaRa)進(jìn)行連接反應(yīng)，連接體系 ομ 1，分別加入0. 5μ 1 PMD19-T載體、4. 5μ 1純化的miR166m前體的DNA、5 μ 1 Solution I。16°C下連接池后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中。通過 Amp篩選，挑取陽性克隆，經(jīng)PCR反應(yīng)驗證及測序鑒定正確后，選取正確的菌液提取質(zhì)粒 pMD19-miR166m。利用天根公司生產(chǎn)的普通質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒操作如下取3ml菌液加入離心管中，12000rpm離心lmin，盡量吸出上清液。向留有菌體沉淀的離心管中加入250 μ 1的溶液Pl (含RNaseA)，徹底懸浮細(xì)菌沉淀。加入250 μ 1溶液 Ρ2，溫和的上下翻轉(zhuǎn)使菌體充分裂解。加入350μ 1溶液Ρ3，立即溫和的上下翻轉(zhuǎn)充分混勻， 12000rpm離心lOmin。收集上清液，轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3中，12000rpm離心60s，倒掉廢液。加入600 μ 1已加入無水乙醇的漂洗液PW，12000rpm離心60s，倒掉廢液并漂洗兩次。將吸附柱CP3放入收集管，12000rpm離心2min，置于室溫徹底晾干。加入55 μ 1洗脫緩沖液ΕΒ，室溫放置2min，12000rpm離心lmin，將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。將提取的質(zhì)粒pMD19-miR166m和DNA雙元質(zhì)粒載體pCAMBIA1301同時都用iTakafci 公司生產(chǎn)的KpnI和I3StI進(jìn)行雙酶切。酶切體系50μ 1，包括5μ 1 IOXM buffer, 30 μ 1 pMD19-miR166m 質(zhì)粒(或 pCAMBIA1301 質(zhì)粒)、1 μ 1 KpnIU μ 1 PstI 禾口 13μ 1 ddH20，37°C 水浴過夜。pMD19-miR166m質(zhì)粒酶切結(jié)果如圖3. b所示。將DNA雙元質(zhì)粒載體pCAMBIA1301 和克隆質(zhì)粒pMD19-miR166m酶切后，割膠回收DNA片段。接著用T4連接酶連接，連接體系 10口1,包括1“1 pCAMBIA1301 載體、7· 5μ 1 miR166m DNAU μ 1 10XΤ4 連接酶 buffer 和 0.5μ1 Τ4連接酶，16°C連接過夜。然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中， 進(jìn)行菌液PCR，并提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果如圖3. c和圖3. d所示。將正確的植物表達(dá)載體pl301-miR166m導(dǎo)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞EHA105，操作如下取200 μ 1農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，加入1 μ g pl301-miR166m質(zhì)粒，混勻，冰浴5min，液氮中速凍5min，37°C水浴5min，然后加入Iml YM培養(yǎng)基恢復(fù)培養(yǎng)4h。IOOOOg離心30s，棄上清，吸200 μ 1菌液涂布于含有50mg/L卡那霉素和40 μ g/1利福平的YM平板，培養(yǎng)，約4 后長出農(nóng)桿菌單菌落。 搖菌，提取農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA重新轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α中，再提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。經(jīng)鑒定正確的陽性質(zhì)粒pl301-miR166m，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化到水稻愈傷。操作如下首先活化農(nóng)桿菌，在含50mg/L卡那霉素和40mg/L利福平的YM培養(yǎng)基上劃線，28°C暗培養(yǎng)。收集農(nóng)桿菌菌體，將其懸浮于含有200 μ M已酰丁香酮(As)的AAM液體懸浮培養(yǎng)基中。調(diào)整菌體濃度至0D600為0. 8 1. 0，倒入含繼代培養(yǎng)1周的水稻愈傷組織的無菌三角瓶，侵染lOmin，并不時晃動。然后將愈傷組織置于無菌的濾紙上浙干30min后，置于鋪有一層無菌濾紙的固體共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，25°C暗培養(yǎng)3天。將共培養(yǎng)后的愈傷組織用無菌水清洗5-6次，再用含500mg/L頭孢拉定的無菌水清洗1 2遍，置于無菌濾紙上浙干1小時。將晾干的愈傷轉(zhuǎn)入含500mg/L頭孢拉定和50mg/L潮霉素的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行第一輪選擇J8°C，暗培養(yǎng)14天。然后將長有抗性愈傷的初始愈傷轉(zhuǎn)到新的含500mg/L頭孢拉定和50mg/L潮霉素的培養(yǎng)基上進(jìn)行第二輪選擇J8°C，光照培養(yǎng)，直到顆粒性的抗性愈傷組織長出。選擇生長旺盛的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有潮霉素的分化培養(yǎng)基上，于25°C，12h光照/1 黑暗條件下培養(yǎng)。待再生小苗長成約Icm高時，將其移到生根培養(yǎng)基上壯苗，25°C， 12h光照/1 黑暗條件下培養(yǎng)。最后將轉(zhuǎn)基因苗挑出，加入適量蒸餾水煉苗3天至一周左右，洗去瓊脂，培養(yǎng)箱水培1周，移栽到溫室的土缽中生長。挑選生長正常的植株，進(jìn)行潮霉素PCR篩選和⑶S染色，獲得陽性TO代植株，共16個株系。收獲Tl代種子繁種并鑒定至 T2代，獲得純合的轉(zhuǎn)基因株系。實施例3 miRNA干旱脅迫耐性功能鑒定取T2代轉(zhuǎn)基因株系種子和中花11野生型的種子，稀HNO3破休眠處理16h。倒去稀HNO3,10% NaClO(有效氯約1 1. 2% )消毒20min后用蒸餾水沖洗。將種子浸泡在水中，37°C暗處催芽約兩天，再在鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)一天。挑選生長一致的露白的轉(zhuǎn)基因株系和野生型的種子播于網(wǎng)格上，放入盛有水稻營養(yǎng)液(按國際水稻所標(biāo)準(zhǔn)營養(yǎng)液配方進(jìn)行配制)的桶中，置于水稻培養(yǎng)箱中(白天/黑夜26°C /22°C,13h/llh ；Rh 80% ) 培養(yǎng)，營養(yǎng)液每5天換一次。將轉(zhuǎn)基因株系和野生型水稻在正常的營養(yǎng)液中培養(yǎng)五周后，挑選生長一致的水稻植株置于水稻營養(yǎng)液(PEG6000濃度為12% )，處理7d和19d后，觀察轉(zhuǎn)基因株系與野生型大苗在干旱脅迫下的表型。如圖4所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在PEG 600012%模擬的干旱脅迫后7d和19d下，miR166m過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因幼苗相比野生型幼苗，苗更加健壯，葉片的萎蔫程度更低，說明miR166m超量表達(dá)株系對干旱脅迫具有一定的耐受作用。
權(quán)利要求
1.一種水稻miR166在提高植物干旱脅迫耐受性中的應(yīng)用，所述水稻miR166的堿基序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述植物為水稻。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，包括將包含所述水稻miR166的前體基因連接到載體上，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化到水稻愈傷組織，篩選，培養(yǎng)，獲得水稻轉(zhuǎn)基因株系。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述前體基因的堿基序列如SEQID NO. 2 所示。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水稻miR166在提高植物干旱脅迫耐受性中的應(yīng)用，所述水稻miR166的堿基序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明通過將該水稻miR166轉(zhuǎn)化到水稻愈傷組織，將獲得的T2代水稻培養(yǎng)在水稻培養(yǎng)液(PEG 6000濃度為12％)中，發(fā)現(xiàn)該miRNA可以提高對干旱脅迫的耐受性，緩解干旱脅迫對它的毒害。
文檔編號A01H4/00GK102250903SQ20111019459
公開日2011年11月23日 申請日期2011年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月12日
發(fā)明者丁艷菲, 劉海麗, 朱誠, 江瓊, 潘家榮, 王飛娟 申請人:中國計量學(xué)院