專利名稱：一種提高小菘菜游離小孢子胚胎發(fā)生率的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種提高小菘菜游離小孢子胚胎發(fā)生率的方法， 專用于小菘菜游離小孢子培養(yǎng)。
背景技術：
小菘菜(Brassica campestris var. peruviridis)系十字花科二年生草本植物， 為不結球白菜的一個變種。原產亞洲，經日本系統(tǒng)改良形成具有獨特風味的品種。以幼嫩的植株供食用，品質柔嫩，味道鮮美，經烹調后色澤翠綠，營養(yǎng)價格高，超過綠葉菜之首的菠菜，并且具有防癌的保健功能。在日本市場周年供應，成為銷售量最大的蔬菜品種之一。我國寧波市2002年開始大面積種植，目前已成為寧波市出口日本的主要創(chuàng)匯蔬菜品種之一。 小菘菜為異花授粉植物，在育種上獲得一個純系需要5 6年的時間，而游離小孢子培養(yǎng)可以在1 2年獲得雙單倍體植株，大大節(jié)省純化時間和工作量。除此之外，小孢子還是一種優(yōu)良的轉化受體，它具備了單細胞和單倍體兩個特性，不會獲得雜合體或嵌合體，因此也是突變體篩選和基因工程研究的理想材料。我國游離小孢子培養(yǎng)的起步較晚，但最近幾年，對不結球白菜的游離小孢子培養(yǎng)已取得了較大的進展，李巖等(1993)、盧鋼等(2001)、蔣武生等Q005)和耿建峰等Q007) 均獲得了不結球白菜小孢子再生植株，并對影響培養(yǎng)的各種因素進行了分析，但小菘菜的游離小孢子培養(yǎng)未見過報道，馮輝O007)曾利用花藥培養(yǎng)獲得了小菘菜的再生植株，但是花藥離體培養(yǎng)容易受到花藥壁、藥隔等二倍體細胞的干擾，后期檢測程序復雜，而小孢子已是單倍體細胞，具有花藥培養(yǎng)所不具備的單細胞單倍性、不受體細胞干擾、便于遺傳操作等優(yōu)點，但是游離小孢子培養(yǎng)受基因型的影響很大，而且小菘菜的游離小孢子培養(yǎng)出胚率很低，所以本發(fā)明旨在建立穩(wěn)定高頻的小菘菜游離小孢子胚胎發(fā)生體系。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的在于針對上述現(xiàn)有技術中小菘菜游離小孢子存在的培養(yǎng)效率低的問題，提供一種提高小菘菜游離小孢子胚胎發(fā)生率的方法。本發(fā)明的目的可通過如下技術方案實現(xiàn)一種提高小菘菜游離小孢子胚胎發(fā)生率的方法，選取小菘菜單核靠邊期的花蕾， 消毒后分離純化出小孢子，將純化后的小孢子懸浮于高糖培養(yǎng)基中，調整小孢子的密度達到1 X IO5 1 X IO6個/ml，置于33°C _:35°C下黑暗處理12h_Mh，離心棄上清后，加入低糖培養(yǎng)基，獲得小孢子懸浮液；其中，所述的高糖培養(yǎng)基是在1/2NLN培養(yǎng)基中加入15% -17% 蔗糖及0. 8mg/L-l. Omg/L秋水仙堿，再經0. 22 μ m的微孔濾膜抽濾滅菌所得，pH為6. 0 ； 所述的低糖培養(yǎng)基是在1/2NLN培養(yǎng)基加入10 13%蔗糖及0. 5 0. 8g/L活性炭，再經 0.22 um的微孔濾膜抽濾滅菌所得，pH為6. 0。所述的小孢子懸浮于高糖培養(yǎng)基后優(yōu)選于33°C黑暗處理Mh。所述的小菘菜單核靠邊期的花蕾長度為2. Omm-3. 0mm，外觀特征為花瓣、花藥長度比為1/2 4/5。消毒前將選取的適宜花蕾保濕并置于4°C冰箱中處理Mh。所述的消毒是將花蕾用75 %的酒精消毒30s，然后用質量比為0. 1 %的HgCl2消毒 6min,最后用無菌水沖洗3次待用。所述的分離純化小孢子是將消毒后的花蕾置于研缽中，加入小孢子提取液，采用擠壓法使小孢子游離出來，然后用400目濾網(wǎng)過濾，將濾液收集于離心管，SOOrpm離心 5min，棄上清液，重復3次；所述的小孢子提取液為小孢子提取液為加入10 13%蔗糖的 B5基本培養(yǎng)基，pH為5.8。所述的離心條件是800rpm-1000rpm離心5min_7min。所述的小孢子懸浮液于黑暗處理10d-14d后即可出現(xiàn)肉眼可見的胚狀體，將其置于振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當出現(xiàn)子葉型胚后立即放于光照下轉綠，然后接到分化培養(yǎng)基上繼代進而形成再生植株。所述的分化培養(yǎng)基是在&基本培養(yǎng)基中加入10 13%蔗糖、0. 1 0.3mg/L 6-BA、0. 01 0. 03mg/LNAA、0. 6 0. 9%瓊脂以及 0. 4 0. 7g/L 活性炭所得，pH 為 5. 8。本發(fā)明方法中培養(yǎng)基的滅菌條件均為121°C，1. IMpa條件下滅菌20分鐘。有益效果本發(fā)明提供了一種促進小菘菜游離小孢子培養(yǎng)胚胎發(fā)生的方法，培養(yǎng)的小孢子獲得了再生植株。通過本發(fā)明改良后的小孢子培養(yǎng)(IMC)方法，使對常規(guī)培養(yǎng)沒有反應的小菘菜品種產生了胚狀體，誘導基因型成功率達到60% ；除此之外，還使可出胚的小菘菜品種的成胚率有了很大的提高，從0. 4個/花蕾提高到1. 3個/花蕾，提高了 3. 25倍。
具體實施例方式實施例1提高小菘菜游離小孢子培養(yǎng)胚胎誘導率的方法，包括1 基因型=NHCC 秋-631 ；NHCC 秋-632 ；NHCC 秋-634 ；NHCC 秋-635 ；NHCC 秋-636。2培養(yǎng)基的配置及滅菌基本培養(yǎng)基為大量元素減半的NLN培養(yǎng)基，即1/2NLN培養(yǎng)基；①高糖培養(yǎng)基(1/2NLN-17):1/2NLN+17% 蔗糖 +0. 8mg/L 秋水仙堿 pH 為 6. 0 ；②低糖培養(yǎng)基(1/2NLN-13):1/2NLN+13% 蔗糖 +0. 8g/L 活性炭 pH 為 6. 0 ；以上培養(yǎng)基用0. 22 μ m的微孔濾膜抽濾滅菌。③小孢子提取液(B5-13培養(yǎng)基)=B5基本培養(yǎng)基+13%蔗糖，pH為5. 8 ；④分化培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基+13%蔗糖+0. 2mg/L 6-BA+O. 02mg/L ΝΑΑ+0. 8%瓊脂+0. 5g/L活性炭，pH為5.8 ；以上小孢子提取液和分化培養(yǎng)基于121°C，1. IMpa條件下滅菌20分鐘。3取材2011年1月選取長度為2 3mm的花蕾，將花蕾保濕置于4°C冰箱中保存 24h。4消毒選取的花蕾用75%的酒精消毒30s，然后用質量比為0. 的HgCl2消毒 6min，最后用無菌水沖洗3次待用；
5小孢子分離與純化將消毒后的花蕾置于研缽中，加小孢子提取液(B5-13)，采用擠壓法使小孢子游離出來，然后用400目濾網(wǎng)過濾，將濾液收集于離心管，SOOrpm離心 5min，棄上清液，重復3次；6將純化后的小孢子懸浮于兩種不同的預處理培養(yǎng)基中①低糖培養(yǎng)基(含13% 蔗糖的1/2NLN培養(yǎng)基)；②高糖培養(yǎng)基(含17%蔗糖及0.8mg/L秋水仙堿的1/2NLN培養(yǎng)基)分別進行低糖處理和高糖、秋水仙堿處理，利用血球計數(shù)板調整小孢子的密度達到 1 X 10"個 /ml ；7高溫誘導將上述小孢子懸浮液置于33°C高溫下黑暗處理Mh ；8換培養(yǎng)基將上述小孢子懸浮液SOOrpm離心5min棄上清后，加入低糖培養(yǎng)基 (1/2NLN-13液體培養(yǎng)基)，獲得小孢子懸浮液；9胚狀體形成及植株再生25°C黑暗處理2周后即可出現(xiàn)肉眼可見的胚狀體，將其置于振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當出現(xiàn)子葉型胚后立即放于光照下轉綠，然后接到分化培養(yǎng)基上繼代進而形成再生植株。實施結果如下表1結果表明，五種基因型的小菘菜對常規(guī)培養(yǎng)即低糖處理沒有反應，出胚率為 0，而經過高糖及秋水仙堿處理后，有三種基因型可誘導出胚，誘導基因型成功率達到60%， 其中NHCC秋-631平均出胚3. 7個/蕾，NHCC秋-635平均出胚1. 3個/蕾，NHCC秋-636 平均出胚4.3個/蕾。表1五種基因型兩種培養(yǎng)方式的出胚對比情況
權利要求
1.一種提高小菘菜游離小孢子胚胎發(fā)生率的方法，其特征在于選取小菘菜單核靠邊期的花蕾，消毒后分離純化出小孢子，將純化后的小孢子懸浮于高糖培養(yǎng)基中，調整小孢子的密度達到1 X IO5 1 X IO6個/ml，置于33°C 下黑暗處理12h Mh，離心棄上清后， 加入低糖培養(yǎng)基，獲得小孢子懸浮液；其中，所述的高糖培養(yǎng)基是在1/2NLN培養(yǎng)基中加入 15% 17%蔗糖及0. 8mg/L 1. Omg/L秋水仙堿，再經0. 22 μ m的微孔濾膜抽濾滅菌所得， PH為6. 0 ；所述的低糖培養(yǎng)基是在1/2NLN培養(yǎng)基加入10 13%蔗糖及0. 5 0. 8g/L活性炭，再經0. 22 μ m的微孔濾膜抽濾滅菌所得，pH為6. 0。
2.根據(jù)權利要求1所述的提高小菘菜游離小孢子胚胎發(fā)生率的方法，其特征在于小孢子懸浮于高糖培養(yǎng)基后于33°C黑暗處理Mh。
3.根據(jù)權利要求1所述的提高小菘菜游離小孢子胚胎發(fā)生率的方法，其特征在于所述的小菘菜單核靠邊期的花蕾長度為2. Omm 3. 0mm。
4.根據(jù)權利要求1所述的提高小菘菜游離小孢子胚胎發(fā)生率的方法，其特征在于消毒前將選取的適宜花蕾保濕并置于4°C冰箱中處理Mh。
5.根據(jù)權利要求1所述的提高小菘菜游離小孢子胚胎發(fā)生率的方法，其特征在于所述的消毒是將花蕾用75%的酒精消毒30s，然后用質量比為0. 1 %的HgCl2消毒6min，最后用無菌水沖洗3次待用。
6.根據(jù)權利要求1所述的提高小菘菜游離小孢子胚胎發(fā)生率的方法，其特征在于所述的分離純化小孢子是將消毒后的花蕾置于研缽中，加入小孢子提取液，采用擠壓法使小孢子游離出來，然后用400目濾網(wǎng)過濾，將濾液收集于離心管，SOOrpm離心5min，棄上清液，重復3次；所述的小孢子提取液為加入10 13%蔗糖的B5基本培養(yǎng)基，pH為5. 8。
7.根據(jù)權利要求1所述的提高小菘菜游離小孢子胚胎發(fā)生率的方法，其特征在于所述的離心條件是800rpm IOOOrpm離心5min 7min。
8.根據(jù)權利要求1所述的提高小菘菜游離小孢子胚胎發(fā)生率的方法，其特征在于所述的小孢子懸浮液于黑暗處理IOd 14d后即可出現(xiàn)肉眼可見的胚狀體，將其置于振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當出現(xiàn)子葉型胚后立即放于光照下轉綠，然后接到分化培養(yǎng)基上繼代進而形成再生植株。
9.根據(jù)權利要求8所述的提高小菘菜游離小孢子胚胎發(fā)生率的方法，其特征在于所述的分化培養(yǎng)基是在B5基本培養(yǎng)基中加入10 13%蔗糖、0. 1 0. 3mg/L 6 BA、0. 01 0. 03mg/LNAA、0. 6 0. 9%瓊脂以及0. 4 0. 7g/L活性炭，滅菌所得，pH為5. 8。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高小菘菜游離小孢子胚胎發(fā)生率的方法。一種提高小菘菜游離小孢子胚胎發(fā)生率的方法，選取小菘菜單核靠邊期的花蕾，消毒后分離純化出小孢子，將純化后的小孢子懸浮于高糖培養(yǎng)基中，調整小孢子的密度達到1×105～1×106個/ml，置于33℃-35℃下黑暗處理12h-24h，離心棄上清后，加入低糖培養(yǎng)基，獲得小孢子懸浮液。小孢子懸浮液于黑暗處理10d-14d后即可出現(xiàn)肉眼可見的胚狀體，將其置于振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，出現(xiàn)子葉型胚后立即放于光照下轉綠，然后接到分化培養(yǎng)基上繼代進而形成再生植株。通過本發(fā)明改良后的小孢子培養(yǎng)方法，使對常規(guī)培養(yǎng)沒有反應的小菘菜品種產生了胚狀體，誘導基因型成功率達到60％。
文檔編號A01H4/00GK102349443SQ20111020193
公開日2012年2月15日 申請日期2011年7月19日 優(yōu)先權日2011年7月19日
發(fā)明者于文佳, 侯喜林 申請人:南京農業(yè)大學